Summary
Her beskriver vi en murine xenograft model, der funktionelt ligner et Ommaya reservoir hos patienter. Vi udviklede Murine Ommaya til at studere nye terapier for den universelt dødelige leptomeningeal sygdom.
Abstract
Leptomeningeal sygdom (LMD) er en usædvanlig type centralnervesystemet (CNS) metastaser til cerebral spinalvæske (CSF). De mest almindelige kræftformer, der forårsager LMD er brystkræft og lungekræft og modermærkekræft. Patienter diagnosticeret med LMD har en meget dårlig prognose og generelt overleve for kun et par uger eller måneder. En mulig årsag til den manglende effekt af systemisk behandling mod LMD er den manglende opnåelse af terapeutisk effektive koncentrationer af lægemidler i CSF på grund af en intakt og relativt uigennemtrængelig blod - hjerne barriere (BBB) eller blod-CSF barriere på tværs af choroid plexus. Derfor kan direkte administration af lægemidler intrathecally eller intraventricularly overvinde disse barrierer. Denne gruppe har udviklet en model, der giver mulighed for effektiv levering af terapi (dvs. lægemidler, antistoffer og cellulære behandlingsformer) kronisk og gentagne prøveudtagning af CSF til bestemmelse af lægemiddelkoncentrationer og målmodulering i CSF (når tumormikromiljøet er målrettet mod mus). Modellen er murin svarende til en magnetisk resonans imaging-kompatible Ommaya reservoir, som anvendes klinisk. Denne model, som er fastgjort til kraniet, er blevet udpeget som "Murine Ommaya." Som et terapeutisk proof of concept blev human epidermal vækstfaktor receptor 2 antistoffer (klon 7.16.4) leveret til CSF via Murine Ommaya til behandling af mus med LMD fra humane epidermal vækstfaktor receptor 2-positiv brystkræft. Murine Ommaya øger effektiviteten af narkotikalevering ved hjælp af en miniatureadgangsport og forhindrer spild af overskydende lægemiddel; det forstyrrer ikke CSF-prøveudtagning til molekylære og immunologiske undersøgelser. Murine Ommaya er nyttig til test af nye terapier i eksperimentelle modeller af LMD.
Introduction
Leptomeningeal sygdom (LMD) er en aggressiv sen fase metastaser af CNS, hvor tumorceller adgang til CSF og infiltrere overfladen af hjernen og rygmarven1. De mest almindelige kræftformer, der forårsager LMD omfatter dem af bryst og lunge samt modermærkekræft2. LMD resulterer i en række neurologiske symptomer og tegn som hovedpine, kranienervevenner, stiv nakke, og radiculopatier. Prognosen for patienter med LMD er generelt meget dårlig (gennemsnitlig overlevelse måles i uger) og er universelt dødelig3,4,5,6,7. Behandling med kirurgi, stråling, og systemisk kemoterapi er palliativ. Systemisk behandling for LMD kan mislykkes på grund af utilstrækkelig lægemiddelindtrængning i CSF på tværs af en intakt BBB eller blod-CSF barriere på tværs af choroid plexus1.
Derfor kan administration af kræftbehandling (f.eks. lægemidler og antistofbaserede behandlinger, herunder checkpointhæmmere og cellulære terapier) direkte ind i CSF, overvinde denne begrænsning8. Adgang til og prøveudtagning AF EFSR fra patienter er muligt gennem et Ommaya-reservoir, der implanteres under hovedbunden. Denne enhed giver mulighed for administration af kræftmidler (f.eks. methotrexat og trastuzumab) samt prøveudtagning af CSF til diagnostiske undersøgelser (f.eks. den cytologiske diagnose lmd til at overvåge for respons på behandling) uden at udføre en spinal hane. En murine Ommaya reservoir var designet til at efterligne dem, der anvendes klinisk. Reservoiret kræver samling af en adgangsport og afstandsdele og en ændring af musens cannulationsteknik, som gør det muligt for enheden at forblive permanent intakt under hele lægemiddelundersøgelsen. Denne enhed er blevet udpeget som "Murine Ommaya".
I modsætning til den osmotiske infusionspumpeteknik, som kræver fremstilling af overskydende væskemængder for at prefylde det tomme rum i slangen og kontinuerlig infusion over hyppige injektioner9, minimerer Murine Ommaya spild af lægemiddelopløsninger. Det tillader effektiv administration af flere enkeltdoser af behandlinger på et givet tidspunkt i små mængder (3-7 μL) i CSF ved hjælp af en Hamilton sprøjte, en miniature adgangsport, og en automatisk injektor. I realtid, effekten af test medicin mod LMD kan bestemmes ved billeddannelse. Ved hjælp af denne tilgang, en række kemoterapier, antistoffer, og celle immunterapier (som enkelt eller kombinerede midler) kan testes mod LMD at oversætte in vivo resultater i rationel behandling strategier for patienter. For yderligere at forbedre billeddannelseskapaciteten for en patientafledt xenograft (PDX) model af LMD blev der indgået et samarbejde med en producent om at udvikle en MRI-kompatibel version af Murine Ommaya(Magnetic Resonance Imaging), som ikke kræver nogen samling og er klar til brug. MR-kapacitet er gavnlig, især for PDX-modeller, hvor mængden af cirkulerende tumorceller (CFC' er) fra CSF undertiden er den begrænsende faktor, og ofte når præmærkning af CFC'er er umulig.
Dette papir beskriver en detaljeret protokol, der begynder med injektion af CFC'er til at gøre mus med LMD . Murine Ommaya er derefter kirurgisk implanteret, og flere lægemiddelbehandling trin via Murine Ommaya udføres. Som et bevis på begrebet for demonstration, en in vivo side-by-side sammenligning blev udført, hvor murin menneskelige epidermal vækstfaktor receptor 2 (Her2) antistof kaldet klon 7.16.4 (den menneskelige ækvivalent af trastuzumab) blev leveret10. Antistoffet er rettet mod Her2+ brystkræftceller enten via Murine Ommaya (direkte målrettet eller intrathecal behandling) eller ved intraperitoneal injektion (systemisk terapi). Resultaterne viste, at mus med LMD, der fik direkte intrathecal immunterapi levede betydeligt længere end dem, der behandles med samme behandling systemisk. CNS-metastaserne hos mus, der blev behandlet via Murine Ommaya, blev næsten fuldstændig regresseret af den tredje dosis i den tredje behandlingsuge, hvilket resulterede i forbedret samlet overlevelse.
Protocol
Protokollen blev godkendt af University of South Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IS00005974).
1. Injektion af CFC'er i CSF til at generere en mus LMD model
- Udarbejdelse af CFC'er
- Antallet af CFC'er, der er nødvendige for injektion, beregnes, og der forberedes en enkeltcellet suspension ved 1,0 × 104 celler/μL i steril fosfatbuffered saltvand (PBS). Placer celleaffjedringen på is eller ved 4 °C under hele proceduren.
BEMÆRK: Når du bruger cellelinjer, der kræver trypsinisering, skal du sørge for at vaske celler to gange med steril PBS for at fjerne trypsin. Udfør celletal ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Hvis der anvendes en stor kohorte (>50 mus), skal du tælle cellerne og validere celle levedygtigheden mellem injektioner for at sikre, at der administreres et ensartet antal celler pr. mus.
- Antallet af CFC'er, der er nødvendige for injektion, beregnes, og der forberedes en enkeltcellet suspension ved 1,0 × 104 celler/μL i steril fosfatbuffered saltvand (PBS). Placer celleaffjedringen på is eller ved 4 °C under hele proceduren.
- Presurgisk procedure
- Indsprøjt musen subkutant med 1 mg/kg buprenorphin vedvarende frigivelse (Bup-SR).
BEMÆRK: Indsprøjtningen af det foreslåede snitområde må ikke injiceres; vælge et injektionssted langt væk fra skulderbladet. - Bedøve musen med 2-3% isoflurane, indtil den ikke viser tegn på retterefleks. Derudover skal du kontrollere for hale og / eller pote knivspids refleks for at bekræfte tilstanden af anæstesi.
- Forbered musen til operation på et sted fjernt fra operationsområdet. Klip det kirurgiske sted (dvs. kraniets dorsale overflade) med tilstrækkeligt grænseområde til at forhindre pels i at forurene indsnitsstedet; derefter mætte stedet med bakteriedræbende hud antiseptisk, der arbejder fra midten af stedet til periferien, og lad derefter tørre. Påfør enten steril drapering eller et sterilt klæbemiddel-backed plast draperingsmateriale for at beskytte det kirurgiske sted mod forurening.
BEMÆRK: Instrumenter skal autoklaverseres på forhånd og spidser steriliseres igen mellem dyr ved hjælp af en glasperlesterilisator. - Barber pelsen af hele den ventrale overflade af hovedet, og forberede huden ved hjælp af steril teknik.
- Sæt næsen med en modificeret L-formet næsekegle af det stereotaktiske apparat, så nares forbliver klare og åbne. Brug tape på tværs af de ventrale overflader af begge pinnae, forsigtigt trække huden fremad for at fastgøre den til næsen kegle, og bøje halsen i en ca 90 ° vinkel, når sikret. Administrere 1,5% isoflurane for at opretholde anæstesi.
BEMÆRK: Korrekt positionering vil resultere i, at snitområdet præsenteres på en måde, der gør det let at identificere den kaukasiske højderyg af occipital knoglen. - Placer kroppen for at sikre, at rygsøjlen holdes på niveau med cisterna magna, og mens du anvender let trækkraft på halen, skal du placere tape ved halebasen for at sikre.
- Indsprøjt musen subkutant med 1 mg/kg buprenorphin vedvarende frigivelse (Bup-SR).
- Kirurgisk cisterna magna injektion
- Med halsen i fuld forlængelse, og begynder lige mellem pinnae, køre den kirurgiske saks tips nedad med let tryk på tværs af occipital knoglen.
BEMÆRK: Mens der i denne midterlinje position, en lille depression er mærkbar, når saksen tips dyppe i konkav område over cisterna magna. - Lav en lille 3-5 mm midterlinje snit lige over palperet konkavitet. Træk 5 μL celleaffjedring ved 1,0 × 104 celler/μL (i alt 5,0 × 104 celler) i en 30 G Hamilton sprøjte.
- Brug stumpspidsede sammenkrammer med 1-2 mm spidser til forsigtigt at trykke ned på cisterna magnaen. Indfør spidser i lukket position og åbn dem, mens du lægger et nedadgående tryk på duraen.
- Gentag stump dissektion beskrevet i det foregående trin, indtil duralmembranen er let identificeret, og de tilhørende blodkar er synlige i det udsatte område.
BEMÆRK: Det resulterende injektionsvindue sikrer, at blodkarrene er ubeskadigede under indføring af nålen. - Mens du holder sammentrækningerne åbne for at trække omgivende muskulatur, skal du introducere en 30 G ikke-coring nål under duraen for at visualisere facet. Sørg for, at nålen kun introduceres lige uden for facet selv. Langsomt indsætte en sprøjte stempel, og levere celler lige under dura.
- Placer facetafvælgen korrekt for at observere injektionen under duraen. Giv forsigtigt teknikken, og brug den 30 G ikke-coring nål for at forhindre skader på membranen og sikre minimal lækage. Hvis lækage er noteret, skal du anvende blidt tryk med en bomuldsspidsapplikator.
- Luk huden ved at anvende et sår klip eller mikro-drop af huden klæbemiddel. Når injektionen er udført med succes, lad musene komme sig efter anæstesi på et varmt tæppe og observere dem kontinuerligt, indtil de kan opretholde sternal position og demonstrere målrettet bevægelse.
- Overvåg musene dagligt efter operationen i den første uge. Hvis en mus ser ud til at have smerter eller angst, skal den behandles med 10 mg/kg subkutan injektion af carprofen en gang hver 12.-24. time i op til 5 dage baseret på veterinærkonsultation og -direktiv. Lad musene komme sig og overvåge dem i mindst 48 til 72 timer, før de går videre til næste trin.
BEMÆRK: Bup-SR, givet forebyggende, vil vare op til 72 timer, så yderligere smertestillende midler er normalt ikke nødvendigt. Dyr vil dog blive forsynet yderligere smertestillende efter behov (hvis sløv, ikke spise, pjusket). Hvis et kirurgisk sted udvikler tegn på postoperativ infektion (dvs. rødme, hævelse, ømhed, allodynia, hyperalgesi, hyperpati eller suppuration), eller hvis musen bevogter det berørte område, aflive musen. Hvis kræftceller med succes injiceres i CSF, LMD og tumor progression vil udvikle sig i CNS inden for 1 eller 2 uger (afhængigt af de typer af CFC'er eller cellelinje, der anvendes) (Figur 1).
- Med halsen i fuld forlængelse, og begynder lige mellem pinnae, køre den kirurgiske saks tips nedad med let tryk på tværs af occipital knoglen.
2. Murine Ommaya samling og implantation
- Forberedelse af station
- Desinficer stationens overflade. Placer en blå belægning over overfladen, og hold alle steriliserede værktøjer og forsyninger, der er angivet i figur 2, klar.
- Presurgisk procedure
- Påfør smertestillende midler (Bup-SR), og steril teknik som beskrevet i punkt 1.2.
- Kirurgisk implantation af Murine Ommaya
- Murine Ommaya-injektionsanordningen samles ved hjælp af en miniatureindsprøjtningsport med en miniatureindsprøjtningsport på 25 G (0,51 mm udvendig diameter) og en afstandsdisk på 1 mm afstandsdisk. Brug et cyanoacrylat sterilt klæbemiddel for at sikre, at ca. 2,5 mm af metal kanylen ind i højre hjernehalvdel (Figur 3A-C).
BEMÆRK: En MR-kompatibel Mouse Ommaya prototype blev udviklet i dette laboratorium, som allerede har begge dele (miniature injektion port og spacer) 3D-printet sammen som en enkelt enhed (Figur 3D). Enkeltenhedens version blev testet af MR og kan spare tid ved at eliminere samlingstrinnet. - Bedøve musen med 2-3% isoflurane, indtil der ikke er tegn på retterefleks. Yderligere, kontrollere for hale og / eller pote knivspids refleks for at bekræfte tilstanden af anæstesi.
- Barber hele den ventrale overflade af pelshovedet, og forbered huden i henhold til den sterile teknik, som tidligere beskrevet i trin 1.2.3. Placer musen i det stereotaktiske apparat med en næsekegle for at fortsætte isoflurane administrationen under proceduren; isofluraen til 1,5 %. Stram forsigtigt ørestængerne for at fastgøre hovedet, og påfør øjensmøremiddel for at dække musens øjne.
- Lav et lille hud snit (3 mm), efterfulgt af stump dissektion af de underliggende subkutane væv for at udsætte kraniet. Tør kraniet ved hjælp af brintoverilte-gennemblødt bomuld-tippet applikator sticks.
- Bor et burrhul i kraniet 0,5 mm posterior og 1,1 mm laterale af bregma-det anatomiske punkt på kraniet, hvor koronar suturen krydses vinkelret af sagittal sutur (Figur 3A) - samt et 0,9 mm burrhul for at udsætte dura materen. Flyt mikrodrillen til side, og skånsomt score knoglen umiddelbart omkring burr hul før du indsætter en injektion port (dybde på ca 2,5 mm), fastgjort til kraniet ved hjælp af en cyanoacrylat steril lim. State sutur omkring injektion stedet ved hjælp af 4-0 no-absorbans nylon suturer i en afbrudt søm mønster eller pung streng sutur11.
- Hus efter operationen mus i de enkelte bure til kirurgi opsving.
BEMÆRK: Det er muligt, at Murine Ommaya kan komme ud, når flere kirurgi-genvundet mus er anbragt i samme bur, muligvis på grund af konstant manipulation interaktioner. Det anbefales, at Murine Ommaya-implanterede mus er anbragt individuelt (eller ikke mere end 2 mus pr bur) i løbet af lægemidlets effektforsøg.
- Murine Ommaya-injektionsanordningen samles ved hjælp af en miniatureindsprøjtningsport med en miniatureindsprøjtningsport på 25 G (0,51 mm udvendig diameter) og en afstandsdisk på 1 mm afstandsdisk. Brug et cyanoacrylat sterilt klæbemiddel for at sikre, at ca. 2,5 mm af metal kanylen ind i højre hjernehalvdel (Figur 3A-C).
3. Murine Ommaya behandling
- Dosering af mus ved hjælp af Murine Ommaya
- Bedøve musen med 2-3% isoflurane, indtil der ikke er tegn på at rette refleks. Yderligere, kontrollere for hale og / eller pote knivspids refleks for at bekræfte vedligeholdelsen af anæstesi.
- Få adgang til Murine Ommaya ved hjælp af en port injektion adapter og en Hamilton sprøjte. Hold toppen af miniatureindsprøjtningsporten ved hjælp af sammentævne, og sæt forsigtigt portinjektoradapteren helt ind i havnens septum.
BEMÆRK: Portinjektoren gennemborer portens septum på en måde, der reducerer den døde plads til et minimum og giver mulighed for kontrolleret injektion via en motoriseret sprøjtepumpe (Figur 4A). Målrettede/nye behandlinger injiceres med en strømningshastighed på 1 μL/min, mens de er under bedøvelse. Behandlingen skal gives med bestemte intervaller (dagligt /ugentligt) for en bestemt varighed (uger/måneder), efter forskerens skøn.
Et volumen mellem 3 og 7 μL er optimalt, da et volumen < 3 μL er upålideligt, og et volumen > 7 μL kan forårsage for meget tryk. Størrelsen af Hamilton sprøjten kan variere fra 10 til 100 μL, afhængigt af antallet af mus i hver behandling arm. Hvis du forloader det relevante volumen i Hamilton-sprøjten, forhindres gentagen udskiftning af sprøjten og minimerer derved fejl. Det er bedst at dedikere 1 Hamilton sprøjte pr behandling arm. - Når injektionen er foretaget, løsne Murine Ommaya fra havnen injektion adapter ved hjælp af sammenkædninger, og returnere musen til buret for at komme sig efter anæstesi, som beskrevet ovenfor i trin 1.3.7.
- Dødshjælp
- Aflive musene ved indånding af kuldioxid (CO2) fra en komprimeret tankkilde. Udsæt musene for stigende koncentrationer af CO2 (dvs. en forskydningshastighed fra 10% til 30% af kammervolumen/min.) for at undgå eller minimere ubehag eller angst. Overvåg musene, indtil forsikringen om ophør af hjerte-kar-og åndedrætsbevægelser.
Representative Results
Hos mus er den samlede mængde CSF ca. 35-40 μL og produceres med en hastighed på ca. 350 nL/min. det vender over 12-13 gange om dagen12. Med henblik på at visualisere injektionens rute blev 2% Evans Blue injiceret via Murine Ommaya-modellen, hvorefter 15 min og 30 min fik lov til at gå, før de høstede hjernen til analyse. Farvestoffet infiltrerede med succes hjertekamrene og hjernen på 15 min. Inden for 30 min, farvestoffet blev synlig på rygmarven (Figur 4).
Som et proof of concept blev BALB/c mus injiceret med en luciferase-mærket Her2+ TUBO brystkræftcellelinje intracisternally, og Murine Ommayas blev implanteret. Ca. 1 uge efter injektionen af kræftceller begyndte musene at udvikle LMD. Disse mus blev behandlet en gang om ugen i op til 4 uger med Her2-antistofimmunterapi, enten gennem systemisk behandling via intraperitoneal injektion eller intrathecally via Murine Ommaya (Figur 5A).
Selvom ubehandlede mus døde på dag 19, overlevede alle mus, der fik intrathecal terapi gennem Murine Ommaya (P = 0,004). I uge 4 blev der observeret en fuldstændig regression af tumorer. Sammenlignet med mus behandlet med systemisk behandling, som havde moderat succes med at behandle LMD, mus, der fik intrathecal terapi havde en meget længere samlet overlevelse (Figur 5B).
Figur 1: Injektion af cirkulerende tumorceller i cisterna magna i en murine xenograft model til undersøgelse leptomeningeal sygdom og centralnervesystemet metastaser. (A) En illustration, der viser placeringen af cisterna magna og CSF adgang site, hvor CFC injiceres ved hjælp af en Hamilton sprøjte. (B) Et repræsentativt IVIS - billede af mus der havde udviklet leptomeningealsygdom og metastaser i centralnervesystemet (hjernen og rygmarven) efter 2 ugers injektion med cirkulerende tumorceller. Celler blev mærket med en luciferase reporter gen. Kontroldyr injiceret med saltvand udviklede ikke tumorer (n = 3), og eksperimentet blev udført i tredotel. Forkortelser: CTCs = cirkulerende tumorceller; IVIS = in vivo imaging system. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Et eksempel på en arbejdsstationsopsætning til udførelse af Murine Ommaya-implantationen i mus. (1) Gas anæstesi maskine / fordamper. (2) Steril blå papir drapere dækker en stereotaxisk stativ. (3) Stereotaxisk anordning (stativ/scene, ørestænger, næsekegle). (4) Mikrodrill. (5) Forstørrelsesglas med lys. (6) Sterile anpinde med tappet perlikatorpinde af bomuld med steril saltvandsskylningsbeholder. (7) Brintoverilte. (8) Perle sterilisator. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Implantationen af Murine Ommaya-enheden. (A) En illustration med en pil, der peger på bregmaens placering på kraniet, og den omtrentlige afstand, hvor der bores et burrhul i kraniet (0,5 mm posterior/1,1 mm laterale) fra bregmaen ved hjælp af en mikrodrill. (B) En Murine Ommaya samles ved at kombinere en metalkanyle og en 1 mm afstandsstykke som base for limtilbehør til kraniet. (C) Repræsentative billeder af mus, der havde Murine Ommayas implanteret; disse mus overvåges for at sikre, at de er lyse, opmærksomme og reaktive, før de får injektioner. (D) Et eksempel på prototypen magnetisk resonans imaging-kompatible Murine Ommaya og repræsentative hjernen magnetisk resonans imaging billeder af Murine Ommaya implantater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Intraventrikulær (centralnervesystemet) injektion ved hjælp af Murine Ommaya. (A) Et billede af en injektion, adgang til ventrikel og centralnervesystemet via Murine Ommaya. Mus forbliver under bedøvelse under injektionen. I eksemplet er Murine Ommaya forbundet til miniatureporten, der er fastgjort til en præfyldt Hamilton-sprøjte. Injektionerne udføres ved hjælp af en automatisk injektion, der er indstillet med en infusionshastighed på 1 μL/min og et volumen på 5-7 μL. Et billede af en musehjerne injiceret med Evans Blue er vist. Cirklen viser, hvor Murine Ommaya var fastgjort. Ingen lækage af farvestoffet blev observeret på ydersiden af hjernen. Et tværsnit af hjernen viser, at de laterale hjertekamre var fyldt med farvestoffet; farvestoffet ikke trænge hjernen parenchyma. (B) Billeder af musehjerner efter 15 og 30 min efter injektion af Evans Blue farvestof. Farvestoffet infiltrerede hjernen (15 min) og begyndte at cirkulere på rygmarven (30 min). Ud af 5 mus fik 4 farvestof til visualisering, og 1 tjente som kontrol. Eksperimentet blev gentaget i tredobling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Direkte målrettet immunterapi ved hjælp af Murine Ommaya øger den samlede overlevelse af brystkræft-associerede leptomeningeal sygdom mus. (A) BALB / c mus blev injiceret med luciferase reporter-mærket human epidermal vækstfaktor receptor 2-positive TUBO celler, en murin brystkræft celle linje. Tre dage efter cisterna magna injektioner, Murine Ommayas blev implanteret. Mus begyndte at udvikle leptomeningeal sygdom (LMD) 1 uge efter injektion. LMD mus blev behandlet med enten en human epidermal vækstfaktor receptor antistof systemisk via intraperitoneal injektion eller via intrathecal (Murine Ommaya) som en direkte målrettet tilgang. Injektioner blev givet en gang om ugen i op til 4 uger. Sammenlignet med ubehandlede mus overlevede mus, der fik immunterapi, meget længere. Murine Ommaya mus havde fuldstændig sygdom regression af den fjerde uge, og disse mus blev til sidst helbredt for sygdom. (B) Disse mus havde også betydeligt bedre medianoverlevelse (Mantel-Cox-testen; P = 0,004; n = 5 mus pr. behandlingsarm) og bedre samlet overlevelse end systematisk behandlede LMD-mus. Forkortelser: LMD = leptomeningeal sygdom; IP = intraperitoneal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her er Murine Ommaya blevet beskrevet som en pålidelig model, som giver mulighed for gentagen administration af anti-cancer agenter i CSF rummet i prækliniske modeller af LMD og andre CNS-relaterede sygdomme. CSF blev udtaget prøver af mus, mens enheden stadig var fastgjort uden afbrydelse. Denne direkte målrettede terapi xenograft model er et vigtigt skridt i udviklingen og afprøvning rationel behandling strategier for LMD. Tiden fra cisterna magna injektioner til det første tegn på LMD udvikling varierer afhængigt af kræft celletype. LMD og CNS metastaser begynder at tage form omkring 1 eller 2 uger efter CTC podning. Hvis en meget proliferativ kræft celle linje anvendes, Er det muligt, at metastaser kan forekomme i <7 dage. I dette tilfælde kan vascularisering på grund af tumorvækst undertiden gøre implantation af Murine Ommaya udfordrende. En løsning på denne udfordring er at reducere antallet af kræftceller til injektion i CSF rummet, giver mulighed for mere tid før tumor udvikling. Desuden er denne protokol blevet optimeret til at implantere Murine Ommaya senest 72 timer efter cisterna magna injektion for at sikre tilstrækkelig tid til mus til at komme sig efter operationen før den første behandling. Forskere bør beregne vækstraten for CFC'erne i xenograft modeller, før du planlægger behandling regime.
Selv om der er andre direkte intraventrikulære leveringsmetoder, såsom at bruge en osmotisk pumpe system eller en intratracerebroventricular (ICV) bolus injektion, som beskrevet tidligere9, der er flere fordele ved at bruge Murine Ommaya model. For eksempel, en ICV bolus injektion sker i en enkelt levering, mens Murine Ommaya giver mulighed for flere doser af behandling til enhver tid, uanset om det gives som et enkelt middel eller som kombinerede behandlinger. Den osmotiske pumpe er designet til at opretholde i op til 14, 28 eller 42 dage, før pumpen skal udskiftes, og nogle gange oftere, hvis en mindre mus med en mindre pumpe bruges. Ændring af den osmotiske pumpe kræver en kirurgisk procedure, som tilføjer stress til tumorbærende mus. En Murine Ommaya udskiftning er ikke nødvendig for langvarige eksperimenter, så længe enheden forbliver intakt. Det minimerer også potentielle variabilitet, der skyldes at ændre pumpen9. Implanterede Murine Ommayas i forsøgsmusene forblev intakte i mere end 42 dage, og denne varighed tillod for langlivede behandlingsregimer.
Tidligere resultater tyder på, at en pulsatile intermitterende dosering i CSF har bedre effekt mod LMD end en langvarig lægemiddelleveringsproces ved infusion13. Det ville være umuligt at udføre gentagne enkeltdosis injektioner ved hjælp af osmotiske pumpe system. Der er ingen nem måde at skylle den resterende fanget væske ud efter hver injektion. Den osmotiske pumpe er også begrænset til at levere blandinger af kompatible eller enkelte lægemidler og kræver typisk højere mængder lægemiddelpræparat til kontinuerlig infusion. I modsætning hertil er Murine Ommaya designet til nøjagtige mikroindsprøjtninger så lidt som 3 til 7 μL uden at skulle tage højde for døde rum, og der er ingen begrænsning på den type lægemidler, forskere kan bruge, herunder immuncelleterapi. Murine Ommaya minimerer også reagensaffald, hvis en bestemt prøve er dyrebar og maksimerer brugen af denne ressource. For enhver behandling regime, der kræver flere doser af anti-cancer behandlinger, Murine Ommaya er let at bruge, og der er minimal risiko for infektion eller kirurgisk uheld, med de alternative tilgange til gentagne gange at få adgang til CSF kirurgisk eller via gentagen levering med en nål. Murine Ommaya giver forskerne fleksibilitet til at justere lægemiddelkoncentrationer og doseringsfrekvenser og til at vurdere målmodulation og varighed af undersøgelsen i henhold til forskningen af interesse.
En begrænsning af Murine Ommaya er, at forskere kan have svært ved at implantere enheden i mindre mus. Derfor er det bedre at bruge mus, der er mindst 8 til 10 uger gamle. Det er muligt for Murine Ommaya at komme ud under behandlingsforsøget, hvis enheden ikke er fastgjort til kraniet under implantationstrinnene, og limen aftager, eller hvis musene har manipuleret slibende med det. Sidstnævnte scenario forekommer hyppigere, når flere mus blev anbragt i samme bur. Derfor anbefales det at huse ikke mere end to Murine Ommaya-implanterede mus pr. bur i varigheden af behandlingsplanen. Denne protokol blev ændret til at anvende cyanoacrylat sterilt klæbemiddel på afstandsrummet, som viste sig at være den mest effektive lim til at klæbe afstandsrummet til kraniets overflade og forhindre Murine Ommaya i at komme ud. Resultaterne viste, at LMD mus nød godt af direkte intrathecal behandling via Murine Ommaya, med øget samlet overlevelse. Enkelt mikroliter mængder kunne administreres sikkert, uden om BBB, hvilket reducerer mængden af lægemiddelpræparat. Vigtigst er det, at de mus, der blev helbredt for CNS-metastaser fra Her2-antistofimmunterapistudiet, er forblevet sunde.
Et samarbejde med en producent havde til formål at udvikle en MR-kompatibel version af Murine Ommaya til PDX-modellen af LMD. Fordi denne prototype version har en spacer indarbejdet, ingen samling er påkrævet, giver mulighed for bedre tilslutning til kraniet. En begrænsning af denne prototype er, at selv om enheden er MR-kompatibel, genererer den en skygge, hvor enheden indsættes, hvilket reducerer billedets synlighed til kvantificeringsanalyser. Den MRI-kompatible version er et godt alternativ værktøj, når ex vivo CTC-prøveudtagning er en begrænsende faktor, og præmærkningsceller er ikke mulige. Kombinationen af en LMD xenograft model og Murine Ommaya teknik er gavnligt for at studere direkte målrettet lægemiddeleffekt uden om BBB. Resultaterne fra disse in vivo-studier er klinisk relevante for at designe rationelle terapeutiske strategier for patienter med LMD.
Disclosures
Peter Forsyth sidder i advisory boards for Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen og Ziopharm uden for det indsendte arbejde. Alle andre forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson og resten af Comparative Medicine-teamet på University of South Florida for deres tekniske support og vedligeholdelse af vores dyr. Vi takker Instech Laboratories, Inc. for deres indsats med at arbejde sammen med os baseret på vores anmodning om at udvikle en MR-kompatibel Murine Ommaya. Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (til K.S.M. Smalley), Department of Defense (DOD) W81XWH10675 (til B. Czerniecki og P. Kalinski), og Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (til P. Forsyth og D. Duckett). Redaktionel bistand blev ydet af Moffitt Cancer Center's Office of Scientific Writing af Dr. Paul Fletcher og Daley Drucker. Der blev ikke givet nogen kompensation ud over deres almindelige lønninger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C.
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), Suppl 2 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al.
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
