Summary
Здесь мы описываем модель мышиного ксенотрансплантата, которая функционально напоминает резервуар Оммайя у пациентов. Мы разработали Murine Ommaya для изучения новых терапевтических средств для универсально смертельной болезни лептоменингеала.
Abstract
Лептоменингеальная болезнь (ЛМД) является редким типом метастазирования центральной нервной системы (ЦНС) в спинномозговую жидкость (ликвор). Наиболее распространенными видами рака, которые вызывают LMD, являются рак молочной железы и легких и меланома. Пациенты с диагнозом LMD имеют очень плохой прогноз и, как правило, выживают только в течение нескольких недель или месяцев. Одной из возможных причин отсутствия эффективности системной терапии против ЛМД является неспособность достичь терапевтически эффективных концентраций препарата в ликворе из-за неповрежденного и относительно непроницаемого гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) или гематоэнцефалического барьера через сосудистое сплетение. Поэтому непосредственное введение лекарств интратекально или внутрижелудочково может преодолеть эти барьеры. Эта группа разработала модель, которая позволяет эффективно доставлять терапевтические средства (то есть лекарства, антитела и клеточную терапию) хронически и повторный отбор проб ликвора для определения концентраций лекарств и целевой модуляции в ликворе (когда микроокружение опухоли нацелено на мышей). Модель является мышиным эквивалентом магнитно-резонансно-резонансного резервуара Оммайя, который используется клинически. Эта модель, которая прикреплена к черепу, была обозначена как «Murine Ommaya». В качестве терапевтического доказательства концепции, антитела рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (клон 7.16.4) были доставлены в ликвор через Мышиную оммайю для лечения мышей с LMD от рецептора эпидермального фактора роста человека 2-положительного рака молочной железы. Murine Ommaya повышает эффективность доставки лекарств с помощью миниатюрного порта доступа и предотвращает потери избыточного препарата; не препятствует отбору проб ликвора для молекулярных и иммунологических исследований. Murine Ommaya полезен для тестирования новых терапевтических средств в экспериментальных моделях LMD.
Introduction
Лептоменингеальная болезнь (ЛМД) представляет собой агрессивную позднюю стадию метастазирования ЦНС, при которой опухолевые клетки получают доступ к ликвору и проникают на поверхность головного и спинногомозга1. Наиболее распространенные виды рака, вызывающие ЛМД, включают рак молочной железы и легких, а также меланому2. LMD приводит к ряду неврологических симптомов и признаков, таких как головные боли, паралич черепных нервов, жесткая шея и радикулопатии. Прогноз для пациентов с ЛМД, как правило, очень плохой (средняя выживаемость измеряется в неделях) и повсеместно смертелен3,4,5,6,7. Лечение хирургическим вмешательством, лучевой и системной химиотерапией является паллиативным. Системная терапия ЛМД может потерпеть неудачу из-за неадекватного проникновения препарата в ликвор через неповрежденный ГЭБ или гемато-ликворный барьер через сосудистое сплетение1.
Таким образом, введение терапевтических средств лечения рака (например, лекарств и методов лечения на основе антител, включая ингибиторы контрольных точек и клеточную терапию) непосредственно в ликвор может преодолеть это ограничение8. Доступ и отбор образцов ликвора у пациентов возможен через резервуар Оммайя, который имплантируется под кожу головы. Это устройство позволяет ввести противораковые агенты (например, метотрексат и трастузумаб), а также забор образцов ликвора для диагностических исследований (например, цитологическая диагностика LMD для мониторинга реакций на лечение) без выполнения спинномозговой пункции. Мышиное водохранилище Оммайя было разработано, чтобы имитировать те, которые используются клинически. Резервуар требует сборки доступного порта и проставочных частей и модификации мышиной техники каннюляции, что позволяет устройству оставаться постоянно нетронутым на протяжении всего периода исследования препарата. Это устройство было обозначено как «Murine Ommaya».
В отличие от метода осмотического инфузионного насоса, который требует подготовки избыточных объемов жидкости для предварительного заполнения пустого пространства в трубке и непрерывной инфузии в течение частых инъекций9,Murine Ommaya минимизирует потери лекарственных растворов. Это позволяет эффективно вводить несколько разовых доз лечения в любой момент времени в небольших количествах (3-7 мкл) в ликвор с использованием шприца Гамильтона, миниатюрного порта доступа и автоматического инжектора. В режиме реального времени эффективность тестовых препаратов против ЛМД может быть определена с помощью визуализации. Используя этот подход, различные химиотерапии, антитела и клеточные иммунотерапии (в виде одиночных или комбинированных агентов) могут быть протестированы против LMD, чтобы перевести результаты in vivo в рациональные стратегии лечения пациентов. Для дальнейшего улучшения возможностей визуализации для модели ксенотрансплантата (PDX) LMD, полученной от пациента, было предпринято сотрудничество с производителем для разработки магнитно-резонансной томографии (МРТ) совместимой версии Murine Ommaya, которая не требует сборки и готова к использованию. Возможность МРТ полезна, особенно для моделей PDX, в которых количество циркулирующих опухолевых клеток (CTC) из CSF иногда является ограничивающим фактором, и часто, когда предварительная маркировка CTC неосуществима.
В этой статье описывается подробный протокол, который начинается с инъекции CTC для рендеринга мышей с LMD. Затем муринная оммайя имплантируется хирургическим путем, и выполняются несколько этапов медикаментозного лечения через Мурин Оммайя. В качестве доказательства концепции для демонстрации было проведено параллельное сравнение in vivo, в котором было доставлено10антитело рецептора эпидермального фактора роста человека человека 2 (Her2), называемое клоном 7.16.4 (человеческий эквивалент трастузумаба). Антитело нацелено на клетки рака молочной железы Her2+ либо через Мышиную оммайю (прямая или интратекальная терапия), либо путем внутрибрюшинной инъекции (системная терапия). Результаты показали, что мыши с ЛМД, получавшие прямую интратекальную иммунотерапию, жили значительно дольше, чем те, кто получал ту же терапию системно. Метастазы в ЦНС у мышей, получавших лечение через мышиную оммайю, были почти полностью регрессированы третьей дозой третьей недели лечения, что привело к улучшению общей выживаемости.
Protocol
Протокол был одобрен Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета Южной Флориды (IS00005974).
1. Внедрение CTC в CSF для генерации модели LMD мыши
- Подготовка ЦОД
- Рассчитайте количество ЦОК, необходимых для инъекции, и приготовьте одноклеточную суспензию при 1,0 ×10 4 клетки/мкл в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS). Поместите клеточную суспензию на лед или при 4 °C на протяжении всей процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании клеточных линий, требующих трипсинизации, обязательно промывайте клетки дважды стерильным PBS для удаления трипсина. Выполняйте подсчет клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Если используется большая когорта (>50 мышей), пересчет клеток и проверка жизнеспособности клеток между инъекциями, чтобы обеспечить постоянное количество клеток на мышь.
- Рассчитайте количество ЦОК, необходимых для инъекции, и приготовьте одноклеточную суспензию при 1,0 ×10 4 клетки/мкл в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS). Поместите клеточную суспензию на лед или при 4 °C на протяжении всей процедуры.
- Предоперационная процедура
- Вводят мышам подкожно 1 мг/кг бупренорфина пролонгированного высвобождения (Bup-SR).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вводите в область предполагаемого разреза; выбрать место инъекции далеко от лопатки. - Обезболивайте мышь 2-3% изофлураном до тех пор, пока у нее не проявится признаки правотекательного рефлекса. Кроме того, проверьте рефлекс защемления хвоста и / или лапы, чтобы подтвердить состояние анестезии.
- Подготовьте мышь к операции в месте, удаленном от операционной зоны. Обрежь хирургическое место (т.е. дорсальную поверхность черепа) с достаточной площадью границы, чтобы мех не загрязнял место разреза; затем насытить участок бактерицидным антисептиком кожи, работающим от центра участка до периферии, а затем дать высохнуть. Нанесите либо стерильную драпировку, либо стерильный пластиковый драпировочный материал с адгезивной основой для защиты места операции от загрязнения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты должны быть заранее автоклавированы, а наконечники повторно стерилизованы между животными с использованием стерилизатора из стеклянных шариков. - Сбрить мех всей вентральной поверхности головы, и подготовить кожу с помощью стерильной техники.
- Распорядить нос модифицированным L-образным носовым конусом стереотаксического аппарата, гарантируя, что нары остаются чистыми и открытыми. Используя ленту через вентральные поверхности обеих пинн, осторожно потяните кожу вперед, чтобы закрепить ее на носовом конусе, и согните шею под углом примерно 90° после закрепления. Вводят 1,5% изофлурана для поддержания анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное позиционирование приведет к тому, что область разреза будет представлена таким образом, чтобы можно было легко идентифицировать хвостовой гребень затылочной кости. - Расположите тело, чтобы позвоночник поддерживался на одном уровне с cisterna magna, и, применяя небольшое сцепление с хвостом, поместите ленту у основания хвоста, чтобы закрепить.
- Вводят мышам подкожно 1 мг/кг бупренорфина пролонгированного высвобождения (Bup-SR).
- Хирургическая инъекция цистерны магна
- С шеей в полном разгибании и начиная только между шнеками, провести кончики хирургических ножниц вниз с небольшим давлением через затылочную кость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Находясь в этом положении средней линии, небольшое углубление заметно, когда кончики ножниц опускаются в вогнутую область над цистерной magna. - Сделайте небольшой разрез средней линии 3-5 мм чуть выше пальпированной вогнутости. Втяни 5 мкл клеточной суспензии при 1,0 ×10 4 клетки/мкл (всего 5,0 ×10 4 клетки) в шприц Гамильтона 30 г.
- Используйте щипцы с тупыми наконечниками с 1-2 мм, чтобы осторожно надавить на цистерну magna. Введите наконечники в закрытое положение и открывайте их, применяя нисходящее давление на твердое мозговое средство.
- Повторяйте тупое рассечение, описанное на предыдущем этапе, до тех пор, пока дуральная мембрана не будет легко идентифицирована, и связанные с ней кровеносные сосуды не будут видны в открытой области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное окно инъекции гарантирует, что кровеносные сосуды не будут повреждены во время введения иглы. - Удерживая щипцы открытыми для втягивания окружающей мускулатуры, введите 30-жидную иглу без корочивания под твердое расстояние, чтобы визуализировать скос. Убедитесь, что игла вводится только сразу за самой скосой. Медленно разверните шприцевой поршень и доставьте ячейки чуть ниже твердой мозговой оболочки.
- Правильно поместите скос, чтобы наблюдать за инъекцией под твердой мозговой оболочкой. Осторожно вводите технику и используйте иглу 30 G без пробоотбора, чтобы предотвратить повреждение мембраны и обеспечить минимальную утечку. Если отмечена утечка, нанесите мягкое давление с помощью аппликатора с хлопковым наконечником.
- Закройте кожу, нанеся раневой зажим или микро-каплю кожного клея. Как только инъекция будет успешно выполнена, позвольте мышам оправиться от анестезии на теплом одеяле, наблюдая за ними непрерывно, пока они не смогут сохранить стернальное положение и продемонстрировать целенаправленное движение.
- Наследуйте за мышами ежедневно после операции в течение первой недели. Если мышь испытывает боль или дистресс, обработайте ее подкожной инъекцией карпрофена 10 мг / кг один раз в 12-24 ч в течение 5 дней на основе ветеринарной консультации и директивы. Позвольте мышам восстановиться и контролировать их в течение как минимум 48-72 ч, прежде чем перейти к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Bup-SR, данный превентивно, будет длиться до 72 ч, поэтому дополнительные анальгетики обычно не нужны. Однако животным будет предоставлен дополнительный анальгетик по мере необходимости (если вялый, не едный, взъерошенный). Если в месте операции развиваются признаки послеоперационной инфекции (например, покраснение, отек, болезненность, аллодиния, гипералгезия, гиперпатия или нагноение), или если мышь охраняет пораженный участок, усыплите мышь. Если раковые клетки успешно введены в ликвор, ЛМД и опухолевая прогрессия будут развиваться в ЦНС в течение 1 или 2 недель (в зависимости от типов используемых ЦОК или клеточной линии)(рисунок 1).
- С шеей в полном разгибании и начиная только между шнеками, провести кончики хирургических ножниц вниз с небольшим давлением через затылочную кость.
2. Сборка и имплантация Murine Ommaya
- Подготовка станции
- Продезинфицируйте поверхность станции. Поместите синее покрытие на поверхность и держите наготове все стерилизованные инструменты и расходные материалы, указанные на рисунке 2.
- Предоперационная процедура
- Применяют анальгезию (Bup-SR) и поддерживают стерильную технику, как описано в разделе 1.2.
- Хирургическая имплантация мышиной оммая
- Соберите инжекторное устройство Murine Ommaya с помощью миниатюрного инжекционного отверстия 25 G (наружный диаметр 0,51 мм) и проставочной дисковой дисковой диском диаметром 1 мм. Используйте цианоакрилатный стерильный клей для обеспечения проникновения примерно 2,5 мм металлической канюли в правое полушарие головного мозга(рисунок 3А-С).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой лаборатории был разработан МРТ-совместимый прототип мыши Ommaya, который уже имеет обе части (миниатюрный инжекционный порт и распорку), напечатанные 3D-печатью вместе как единое целое(рисунок 3D). Версия с одним блоком была протестирована с помощью МРТ и может сэкономить время, исключив этап сборки. - Обезболивают мышь 2-3% изофлураном до тех пор, пока не покинется признаки правотекающего рефлекса. Кроме того, проверьте рефлекс защемления хвоста и / или лапы, чтобы подтвердить состояние анестезии.
- Сбрить всю вентральную поверхность головки меха, и подготовить кожу по стерильной методике, как описано ранее в шаге 1.2.3. Поместите мышь в стереотаксический аппарат с носовым конусом для продолжения введения изофлурана во время процедуры; снизить изофлуран до 1,5%. Осторожно затяните ушные вкладыши, чтобы закрепить голову, и нанесите смазку для глаз, чтобы прикрыть глаза мыши.
- Делают небольшой разрез кожи (3 мм) с последующим тупым рассечением подлежащих подкожных тканей для обнажения черепа. Высушите череп с помощью пропитанных перекисью водорода аппликаторных палочек с хлопковым наконечником.
- Просверлите отверстие в черепе 0,5 мм с задней и 1,1 мм боковой от брегмы — анатомическую точку на черепе, где корональный шов перпендикулярно пересекается сагиттальным швом(рисунок 3А),— а также отверстие для заусенцев 0,9 мм, чтобы обнажить твердое мозговое отверстие. Отведите микродрень в сторону и аккуратно окуйте кость, непосредственно окружающую отверстие заусенца, прежде чем вставлять инъекционный порт (глубина примерно 2,5 мм), прикрепленный к черепу с помощью цианоакрилатного стерильного клея. Состояние шва вокруг места инъекции с использованием 4-0 неабсорбирующих нейлоновых швов в прерываемом рисунке стежка или пучкового струнного шва11.
- Размещайте послеоперационных мышей в отдельных клетках для хирургического восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что мышиная оммайя может оторваться, когда несколько выздоровенные хирургическим путем мыши находятся в одной клетке, возможно, из-за постоянных взаимодействий с вмешательством. Рекомендуется, чтобы мыши, имплантированные Murine Ommaya, размещались индивидуально (или не более 2 мышей на клетку) в течение всего испытания эффективности препарата.
- Соберите инжекторное устройство Murine Ommaya с помощью миниатюрного инжекционного отверстия 25 G (наружный диаметр 0,51 мм) и проставочной дисковой дисковой диском диаметром 1 мм. Используйте цианоакрилатный стерильный клей для обеспечения проникновения примерно 2,5 мм металлической канюли в правое полушарие головного мозга(рисунок 3А-С).
3. Лечение мышиной оммая
- Дозирование мышей с помощью мышиной оммайи
- Обезболивают мышь 2-3% изофлураном, пока не покинется признаки выпрямляющего рефлекса. Кроме того, проверьте рефлекс защемления хвоста и / или лапы, чтобы подтвердить поддержание анестезии.
- Доступ к Murine Ommaya с помощью адаптера впрыска порта и шприца Hamilton. Используя щипцы, удерживайте верхнюю часть миниатюрного порта впрыска и аккуратно вставьте адаптер инжектора порта полностью в перегородку порта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инжектор порта прокалывает перегородку порта таким образом, чтобы уменьшить мертвое пространство до минимума и обеспечить контролируемый впрыск через моторизованный шприцевой насос(рисунок 4A). Таргетные/новые методы лечения вводят со скоростью потока 1 мкл/мин под наркозом. Лечение должно проводиться через определенные промежутки времени (ежедневно / еженедельно) в течение установленной продолжительности (недели / месяцы), по усмотрению исследователя.
Объем от 3 до 7 мкл является оптимальным, так как объем < 3 мкл ненадежен, а объемная > 7 мкл может вызвать слишком большое давление. Размер шприца Гамильтона может варьироваться от 10 до 100 мкл, в зависимости от количества мышей в каждой лечебной руке. Предварительная загрузка соответствующего объема в шприц Гамильтона предотвратит повторную замену шприца, тем самым минимизируя ошибки. Лучше всего посвятить 1 шприц Гамильтона на руку лечения. - После того, как инъекция сделана, отсоедините Murine Ommaya от адаптера для инъекции порта с помощью щипцов и верните мышь в клетку для восстановления после анестезии, как описано выше на этапе 1.3.7.
- Эвтаназия
- Усыпленить мышей путем вдыхания углекислого газа (CO2)из источника сжатого резервуара. Подвергайте мышей воздействию возрастающих концентраций CO2 (т.е. следует использовать скорость смещения от 10% до 30% объема камеры в минуту), чтобы избежать или свести к минимуму дискомфорт или дистресс. На мониторах мышей до уверенности в прекращении сердечно-сосудистых и дыхательных движений.
Representative Results
У мышей общий объем ликвора составляет приблизительно 35-40 мкл и вырабатывается со скоростью около 350 нл/мин; переворачивается 12-13 раз в день12. С целью визуализации маршрута инъекции 2% Эванс Блю вводили через модель Murine Ommaya, после чего 15 мин и 30 мин пропускали до сбора мозга для анализа. Краситель успешно проникает в желудочки и мозг за 15 мин. В течение 30 мин краситель стал виден на спинном мозге(рисунок 4).
В качестве доказательства концепции мышам BALB/c вводили меченую люциферазу линию клеток рака молочной железы Her2+ TUBO внутричерно, и имплантировали Murine Ommayas. Примерно через 1 неделю после инъекции раковых клеток у мышей начала развиваться ЛМД. Этих мышей лечили один раз в неделю в течение 4 недель иммунотерапией Her2-антителами, либо посредством системной терапии с помощью внутрибрюшинной инъекции, либо интратекально через мышиную оммайю(рисунок 5А).
Хотя необработанные мыши умерли к 19-му дню, все мыши, которые получали интратекальную терапию через мышиную оммайю, выжили(P = 0,004). К 4 неделе наблюдалась полная регрессия опухолей. По сравнению с мышами, получавших системную терапию, которые имели умеренный успех в лечении ЛМД, мыши, получавшие интратекальную терапию, имели гораздо более длительную общую выживаемость(рисунок 5B).
Рисунок 1:Инъекция циркулирующих опухолевых клеток в cisterna magna в мышиной модели ксенотрансплантата для изучения лептоменингеального заболевания и метастазов центральной нервной системы. (A) Иллюстрация, показывающая расположение cisterna magna и места доступа к CSF, в который CTC вводятся с использованием шприца Гамильтона. (B) Репрезентативное изображение IVIS мышей, у которых развилось лептоменингеальное заболевание и метастазы в центральную нервную систему (в головном мозге и вдоль спинного мозга) после 2 недель инъекции циркулирующих опухолевых клеток. Клетки были помечены геном-репортером люциферазы. У контрольных животных, вводимых физиологическим раствором, опухолей не развивалось (n=3), и эксперимент проводили в трех. Сокращения: ЦОК = циркулирующие опухолевые клетки; IVIS = система визуализации in vivo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Пример установки рабочей станции для выполнения имплантации Murine Ommaya мышам. (1) Аппарат для газовой анестезии/испаритель. (2) Стерильная синяя бумажная драпировка, покрывающая стереотаксическую подставку. (3) Стереотаксическое устройство (подставка/сцена, ушные вкладыши, носовой конус). (4) Микродрил. (5) Увеличительное стекло со светом. (6) Стерильные хлопковые аппликаторы с стерильным солевым ополаскивателем. (7) Перекись водорода. (8) Стерилизатор бисера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Имплантация устройства Murine Ommaya. (A)Иллюстрация со стрелкой, указывающей на расположение брегмы на черепе, и приблизительное расстояние, на котором в черепе с помощью микродрели с помощью микродрели сверлит отверстие заусенца. ( A ) Иллюстрация со стрелкой, указывающей на расположение брегмы на черепе. (B) Murine Ommaya собирается путем объединения металлической канюли и распорки 1 мм в качестве основы для крепления клея к черепу. (C)Репрезентативные изображения мышей, которым имплантировали Murine Ommayas; эти мыши контролируются, чтобы убедиться, что они яркие, бдительные и реактивные перед получением каких-либо инъекций. (D) Пример прототипа магнитно-резонансной томографии, совместимого с Murine Ommaya и репрезентативных магнитно-резонансных томорезных изображений мозга имплантатов Murine Ommaya. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Внутрижелудочковая (центральная нервная система) инъекция с использованием мышиной оммая. (А)Изображение инъекции, доступящей к желудочку и центральной нервной системе через мышиную оммайю. Мыши остаются под наркозом во время инъекции. В примере Murine Ommaya соединен с миниатюрным портом, который прикреплен к предварительно заполненному шприцу Гамильтона. Инъекции выполняются с использованием автоматического инъекционного набора со скоростью инфузии 1 мкл/мин и объемом 5-7 мкл. Показано изображение мозга мыши, введенного Эвансу Блю. Круг показывает, где была прикреплена Мурин Оммайя. Утечки красителя на внешней стороне мозга не наблюдалось. Поперечное сечение мозга показывает, что боковые желудочки были заполнены красителем; краситель не проникал в паренхиму головного мозга. (B) Изображения мозга мыши через 15 и 30 мин после инъекции красителя Evans Blue. Краситель проник в головной мозг (15 мин) и начал циркулировать по спинному мозгу (30 мин). Из 5 мышей 4 получали краситель для визуализации, а 1 служила контрольной. Эксперимент повторялся в трехкратном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Прямоцелевая иммунотерапия с использованием мышиной оммайи увеличивает общую выживаемость мышей с лептоменингеальным заболеванием, связанным с раком молочной железы. (A) МЫШАм BALB / c вводили люциферазу с репортерной маркировкой рецептора эпидермального фактора роста человека 2-положительные клетки TUBO, линию клеток рака молочной железы мышей. Через три дня после инъекций cisterna magna были имплантированы Murine Ommayas. У мышей начала развиваться лептоменингеальная болезнь (ЛМД) через 1 неделю после инъекции. Мышей LMD лечили либо человеческим антителом рецептора эпидермального фактора роста системно с помощью внутрибрюшинной инъекции, либо интратекально (Murine Ommaya) в качестве прямого целевого подхода. Инъекции делались один раз в неделю в течение 4 недель. По сравнению с необработанными мышами, мыши, получавшие иммунотерапию, выживали гораздо дольше. Мышиные мыши Оммайя имели полную регрессию заболевания к четвертой неделе, и эти мыши в конечном итоге были излечены от болезни. (B) Эти мыши также имели значительно лучшую среднюю выживаемость (тест Мантеля-Кокса; P = 0,004; n = 5 мышей на руку лечения) и лучшая общая выживаемость, чем систематически обработанные мыши с LMD. Сокращения: ЛМД = лептоменингеальная болезнь; IP = внутрибрюшинный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Здесь Murine Ommaya была описана как надежная модель, которая позволяет повторно ввести противораковые агенты в пространство ликвора в доклинических моделях LMD и других заболеваний, связанных с ЦНС. CSF был взят у мышей, в то время как устройство все еще было прикреплено без перерыва. Эта модель ксенотрансплантата с прямым нацеливаем является важным шагом в разработке и тестировании рациональных стратегий лечения LMD. Время от инъекций cisterna magna до начального признака развития LMD варьируется в зависимости от типа раковых клеток. Метастазы ЛМД и ЦНС начинают формироваться примерно через 1 или 2 недели после прививки CTC. Если используется высокопролиферативная линия раковых клеток, возможно, что метастазирование может произойти через <7 дней. В этом случае васкуляризация из-за роста опухоли иногда может сделать имплантацию мышиной оммы сложной. Одним из решений этой проблемы является уменьшение количества раковых клеток для инъекции в пространство ликвора, что позволяет получить больше времени до развития опухоли. Кроме того, этот протокол был оптимизирован для имплантации Мышиной Оммайи не позднее, чем через 72 ч после инъекции цистерны магна, чтобы обеспечить достаточно времени для мышей, чтобы восстановиться после операции до первого лечения. Исследователи должны рассчитать скорость роста ЦОК в моделях ксенотрансплантатов, прежде чем планировать схему лечения.
Хотя существуют и другие методы прямой внутрижелудочковой доставки, такие как использование осмотической насосной системы или внутрицеребровентрикулярной (ICV) болюсной инъекции, как описаноранее 9, естьнесколько преимуществ использования модели Murine Ommaya. Например, болюсная инъекция ICV выполняется за одну доставку, тогда как Murine Ommaya позволяет проводить несколько доз лечения в любое время, независимо от того, дается ли он в качестве одного агента или в качестве комбинированной терапии. Осмотический насос рассчитан на поддержание в течение 14, 28 или 42 дней, прежде чем насос нуждается в замене, а иногда и чаще, если используется меньшая мышь с меньшим насосом. Замена осмотического насоса требует хирургической процедуры, которая добавляет стресса мышам, несущим опухоль. Замена Murine Ommaya не требуется для длительных экспериментов, пока устройство остается нетронутым. Это также минимизирует потенциальную изменчивость, которая возникает в результате изменения насоса9. Имплантированные мышиные оммая у подопытных мышей оставались нетронутыми дольше 42 дней, и эта продолжительность позволяла долгоживущие схемы лечения.
Предыдущие результаты показывают, что пульсирующее прерывистое дозирование в ликвор имеет лучшую эффективность против ЛМД, чем длительный процесс доставки лекарств путем инфузии13. Было бы невозможно выполнить повторные однодозовые инъекции с использованием системы осмотического насоса. Не существует простого способа вымыть оставшуюся захваченную жидкость после каждой инъекции. Осмотический насос также ограничен доставкой смесей совместимых или одиночных лекарств и обычно требует больших объемов лекарственной подготовки для непрерывной инфузии. Напротив, Murine Ommaya предназначен для точных микроинъекций всего от 3 до 7 мкл, без необходимости учитывать мертвое пространство, и нет никаких ограничений на тип лекарств, которые исследователи могут использовать, включая терапию иммунными клетками. Murine Ommaya также сводит к минимуму отходы реагентов, если конкретный образец является ценным, и максимизирует использование этого ресурса. Для любой схемы лечения, которая требует многократных доз противораковой терапии, Murine Ommaya проста в использовании, и существует минимальный риск инфекции или хирургического злоключения, с альтернативными подходами многократного доступа к ликвору хирургическим путем или через повторную доставку иглой. Murine Ommaya предоставляет исследователям гибкость для корректировки концентраций лекарств и частот дозирования, а также для оценки целевой модуляции и продолжительности исследования в соответствии с интересующими исследованиями.
Ограничение Murine Ommaya заключается в том, что исследователям может быть трудно имплантировать устройство более мелким мышам. Следовательно, лучше использовать мышей, которым по крайней мере от 8 до 10 недель. Мышиная оммайя может оторваться во время испытания лечения, если устройство не прикреплено к черепу во время этапов имплантации и клей изнашивается, или если мыши абразивно подделали его. Последний сценарий происходит чаще, когда несколько мышей были размещены в одной клетке. Следовательно, рекомендуется размещать не более двух мышей, имплантированных Оммайей, на клетку в течение всего срока лечения. Этот протокол был модифицирован для нанесения цианоакрилатного стерильного клея на распорку, которая была признана наиболее эффективным клеем для приклеивания спейсера к поверхности черепа и предотвращения отрыва Murine Ommaya. Результаты показали, что мыши с LMD выиграли от прямой интратекальной терапии через Мышиную Оммайю с увеличением общей выживаемости. Одиночные микролитровые объемы можно безопасно вводить, минуя ГЭБ, тем самым уменьшая количество препарата. Самое главное, что мыши, которые были вылечены от метастазов в ЦНС из исследования иммунотерапии Her2-антителами, остались здоровыми.
Сотрудничество с производителем было направлено на разработку МРТ-совместимой версии Murine Ommaya для PDX-модели LMD. Поскольку эта версия прототипа имеет встроенный спейсер, сборка не требуется, что позволяет лучше сцепляться с черепом. Ограничение этого прототипа заключается в том, что, хотя устройство совместимо с МРТ, оно генерирует тень, в которую вставляется устройство, что снижает видимость изображения для количественного анализа. МРТ-совместимая версия является хорошим альтернативным инструментом, когда отбор проб ex vivo CTC является ограничивающим фактором, а предварительная маркировка клеток невозможна. Комбинация модели ксенотрансплантата LMD и метода Murine Ommaya полезна для изучения эффективности препарата с прямым нацеливанием в обход ГЭБ. Результаты этих исследований in vivo клинически значимы для разработки рациональных терапевтических стратегий для пациентов с LMD.
Disclosures
Питер Форсайт входит в состав консультативных советов Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen и Ziopharm, за пределами представленных работ. Всем остальным авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Мишель Л. Даниэльсон, Тришию Фаворс-Уотсон и остальную часть команды сравнительной медицины в Университете Южной Флориды за их техническую поддержку и содержание наших животных. Мы благодарим Instech Laboratories, Inc. за их усилия, работающие с нами на основе нашего запроса на разработку МРТ-совместимого Murine Ommaya. Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения (NIH) R21 CA216756 (К.С.M. Смолли), Министерством обороны (DOD) W81XWH1910675 (Б. Чернецким и. Калинским) и Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (П. Форсайту и Д. Дакетту). Редакционная помощь была оказана Отделом научного письма Онкологического центра Моффитта доктором Полом Флетчером и Дейли Друкером. Никакой компенсации, кроме их обычной заработной платы, не присуждалось.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C.
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), Suppl 2 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al.
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
