Summary
Her beskriver vi en murine xenograft modell som funksjonelt ligner et Ommaya-reservoar hos pasienter. Vi utviklet Murine Ommaya for å studere nye terapeutiske behandlinger for den universelt dødelige leptomeningeal sykdommen.
Abstract
Leptomeningeal sykdom (LMD) er en uvanlig type sentralnervesystem (CNS) metastase til cerebral spinalvæske (CSF). De vanligste kreftformene som forårsaker LMD er bryst- og lungekreft og melanom. Pasienter diagnostisert med LMD har en svært dårlig prognose og overlever generelt i bare noen få uker eller måneder. En mulig årsak til mangelen på effekt av systemisk terapi mot LMD er unnlatelse av å oppnå terapeutisk effektive konsentrasjoner av stoffet i CSF på grunn av en intakt og relativt ugjennomtrengelig blod-hjerne barriere (BBB) eller blod-CSF barriere over choroid plexus. Derfor kan direkte administrering av legemidler intrathecally eller intraventricularly overvinne disse barrierene. Denne gruppen har utviklet en modell som gjør det mulig for effektiv levering av terapeutiske midler (dvs. legemidler, antistoffer og cellulære terapier) kronisk og gjentatt prøvetaking av CSF for å bestemme legemiddelkonsentrasjoner og målmodulering i CSF (når tumormikromiljøet er målrettet mot mus). Modellen er murinekvivalenten til et magnetisk resonansavbildningskompatibelt Ommaya-reservoar, som brukes klinisk. Denne modellen, som er festet til skallen, har blitt utpekt som "Murine Ommaya." Som et terapeutisk konseptbevis ble human epidermal vekstfaktorreseptor 2 antistoffer (klone 7.16.4) levert inn i CSF via Murine Ommaya for å behandle mus med LMD fra human epidermal vekstfaktorreseptor 2-positiv brystkreft. Murine Ommaya øker effektiviteten av legemiddellevering ved hjelp av en miniatyr tilgangsport og forhindrer svinn av overflødig stoff; det forstyrrer ikke CSF-prøvetaking for molekylære og immunologiske studier. Murine Ommaya er nyttig for å teste nye terapeutiske behandlinger i eksperimentelle modeller av LMD.
Introduction
Leptomeningeal sykdom (LMD) er en aggressiv senfasemetastase av CNS, der tumorceller får tilgang til CSF og infiltrerer overflaten av hjernen og ryggmargen1. De vanligste kreftformene som forårsaker LMD inkluderer bryst og lunge samt melanom2. LMD resulterer i en rekke nevrologiske symptomer og tegn som hodepine, kranial nerve pareser, stiv nakke og radikulopatier. Prognosen for pasienter med LMD er generelt svært dårlig (gjennomsnittlig overlevelse måles i uker) og er universelt dødelig3,4,5,6,7. Behandling med kirurgi, stråling og systemisk kjemoterapi er palliativ. Systemisk behandling for LMD kan mislykkes på grunn av utilstrekkelig legemiddelinntrengning i CSF over en intakt BBB- eller blod-CSF-barriere over choroid plexus1.
Derfor kan administrering av kreftterapeutiske behandlinger (f.eks. legemidler og antistoffbaserte behandlinger, inkludert sjekkpunkthemmere og cellulære terapier) direkte inn i CSF, overvinne denne begrensningen8. Tilgang til og prøvetaking av CSF fra pasienter er mulig gjennom et Ommaya-reservoar som er implantert under hodebunnen. Denne enheten tillater administrering av kreftmidler (f.eks. metotreksat og trastuzumab) samt prøvetaking av CSF for diagnostiske studier (f.eks. cytologiske diagnosen LMD for å overvåke for respons på behandling) uten å utføre en spinalkran. Et murine Ommaya reservoar ble designet for å etterligne de som brukes klinisk. Reservoaret krever montering av en tilgangsport og avstandsdeler og en modifikasjon av musens kannkulasjonsteknikk, noe som gjør at enheten kan forbli permanent intakt gjennom hele narkotikastudien. Denne enheten er utpekt som "Murine Ommaya".
I motsetning til den osmotiske infusjonspumpeteknikken, som krever forberedelse av overflødige væskevolumer for å forhåndsfylle det tomme rommet i slangen og kontinuerlig infusjon over hyppige injeksjoner9, minimerer Murine Ommaya svinningen av legemiddelløsninger. Det tillater effektiv administrering av flere enkeltdoser av behandlinger til enhver tid i små mengder (3-7 μL) i CSF ved hjelp av en Hamilton-sprøyte, en miniatyr tilgangsport og en automatisk injektor. I sanntid kan effekten av testmedisiner mot LMD bestemmes ved avbildning. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan en rekke kjemoterapier, antistoffer og celleimmunoterapier (som enkelt- eller kombinerte midler) testes mot LMD for å oversette in vivo-funn til rasjonelle behandlingsstrategier for pasienter. For ytterligere å forbedre bildekapasiteten for en pasientavledet xenograft (PDX) modell av LMD, ble det inngått et samarbeid med en produsent for å utvikle en MAGNETISK RESONANSavbildning (MR) kompatibel versjon av Murine Ommaya, som ikke krever montering og er klar til bruk. MR-kapasitet er gunstig, spesielt for PDX-modeller der mengden sirkulerende tumorceller (CTCer) fra CSF noen ganger er den begrensende faktoren, og ofte når prelabeling CTCs er umulig.
Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll som begynner med injeksjon av CTCer for å gjengi mus med LMD . Murine Ommaya blir deretter kirurgisk implantert, og flere behandlingstrinn via Murine Ommaya utføres. Som et konseptbevis for demonstrasjon ble det utført en in vivo side-by-side sammenligning, der murin menneskelig epidermal vekstfaktorreseptor 2 (Her2) antistoff kalt klone 7.16.4 (den menneskelige ekvivalenten til trastuzumab) ble levert10. Antistoffet retter seg mot Her2+ brystkreftceller enten via Murine Ommaya (direkte målrettet eller intratekal terapi) eller ved intraperitoneal injeksjon (systemisk terapi). Resultatene viste at mus med LMD som fikk direkte intratekal immunterapi levde betydelig lenger enn de som ble behandlet med samme terapi systemisk. CNS-metastasene hos mus behandlet via Murine Ommaya ble nesten fullstendig regressert av den tredje dosen av den tredje behandlingsuken, noe som resulterte i forbedret total overlevelse.
Protocol
Protokollen ble godkjent av University of South Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IS00005974).
1. Injeksjon av CTCer i CSF for å generere en mus LMD-modell
- Utarbeidelse av CTCer
- Beregn antall CTCer som trengs for injeksjon, og lag en encellet suspensjon ved 1,0 × 104 celler/μL i steril fosfatbufret saltvann (PBS). Plasser cellefjæringen på is eller ved 4 °C gjennom hele prosedyren.
MERK: Når du bruker cellelinjer som krever trypsinisering, må du vaske celler to ganger med steril PBS for å fjerne trypsin. Utfør celleantall ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller. Hvis en stor kohort (>50 mus) brukes, tell cellene og valider celle levedyktigheten mellom injeksjoner for å sikre at et konsekvent antall celler administreres per mus.
- Beregn antall CTCer som trengs for injeksjon, og lag en encellet suspensjon ved 1,0 × 104 celler/μL i steril fosfatbufret saltvann (PBS). Plasser cellefjæringen på is eller ved 4 °C gjennom hele prosedyren.
- Presurgisk prosedyre
- Injiser musen subkutant med 1 mg/kg buprenorfin vedvarende frigjøring (Bup-SR).
MERK: Ikke injiser området for foreslått snitt; injeksjonsstedet langt borte fra scapulaen. - Bedøv musen med 2-3% isofluran til den ikke viser tegn på høyre refleks. I tillegg må du se etter hale og / eller pote klype refleks for å bekrefte tilstanden til anestesi.
- Forbered musen for kirurgi på et sted fjernkontroll fra operasjonsområdet. Klipp det kirurgiske stedet (dvs. skallens dorsale overflate) med nok kantområde til å hindre pels fra å forurense snittstedet; Deretter metter du stedet med bakteriedrepende hud antiseptisk hud, arbeider fra midten av stedet til periferien, og deretter la det tørke. Påfør enten sterilt gardin eller et sterilt limstøttet plastgardinmateriale for å beskytte det kirurgiske stedet mot forurensning.
MERK: Instrumentene skal autoklaveres på forhånd og spisser steriliseres på nytt mellom dyr ved hjelp av en glassperlesterilisator. - Barber pelsen på hele lufteflaten på hodet, og forbered huden ved hjelp av steril teknikk.
- Plasser nesen med en modifisert L-formet nesekjegle av stereotaktisk apparat, slik at nares forblir klar og åpen. Bruk tape over de ventrale overflatene på begge pinnae, trekk huden forsiktig fremover for å feste den til nesekjeglen, og bøy nakken i en omtrent 90° vinkel når den er sikret. Administrer 1,5% isofluran for å opprettholde anestesi.
MERK: Riktig posisjonering vil føre til at snittområdet presenteres på en måte som gjør det enkelt å identifisere kaudalryggen i oksipitalbenet. - Plasser kroppen for å sikre at ryggraden holdes i vater med cisternamagnaten, og mens du bruker liten trekkraft på halen, plasser tape ved halebunnen for å sikre.
- Injiser musen subkutant med 1 mg/kg buprenorfin vedvarende frigjøring (Bup-SR).
- Kirurgisk cisterna magna injeksjon
- Med nakken i full forlengelse, og begynner like mellom pinnae, kjør kirurgiske saksespisser nedover med et lite trykk over oksipitalbenet.
MERK: Mens du er i denne midtlinjeposisjonen, er en liten depresjon merkbar når saksespissene dypper inn i det konkave området over cisternamagnaten. - Lag et lite 3-5 mm midtlinjeinnsnitt like over den palperte konkavititeten. Trekk 5 μL cellesuspensjon ved 1,0 × 104 celler/μL (totalt 5,0 × 104 celler) inn i en 30 G Hamilton-sprøyte.
- Bruk stumpe spisse tang med 1-2 mm spisser for å trykke forsiktig ned på cisternamagnaten. Innfør tips i lukket stilling og åpne dem mens du legger ned trykket på duraen.
- Gjenta stump disseksjon beskrevet i forrige trinn til duralmembranen er lett identifisert, og de tilhørende blodkarene er synlige i det eksponerte området.
MERK: Det resulterende injeksjonsvinduet sikrer at blodårene er uskadde under innsetting av nålen. - Mens du holder tangene åpne for å trekke tilbake omkringliggende muskulatur, introdusere en 30 G ikke-coring nål under dura for å visualisere skråkanten. Sørg for at nålen bare innføres like utenfor selve skråkanten. Utplasser sakte et sprøytestempee, og lever celler like under dura.
- Plasser skråkanten riktig for å observere injeksjonen under dura. Administrer teknikken nøye, og bruk 30 G ikke-koring nål for å forhindre skade på membranen og sikre minimal lekkasje. Hvis lekkasje er notert, bruk forsiktig trykk med en bomullsspisset applikator.
- Lukk huden ved å påføre et sårklemme eller mikrodråpe hudlim. Når injeksjonen er utført, la musene komme seg fra anestesi på et varmt teppe, observere dem kontinuerlig til de kan opprettholde sternal posisjon og demonstrere målrettet bevegelse.
- Overvåk musene daglig etter operasjonen den første uken. Hvis en mus ser ut til å være i smerte eller nød, behandle den med 10 mg / kg subkutan injeksjon av karprofen en gang hver 12 til 24 timer i opptil 5 dager basert på veterinær konsultasjon og direktiv. Tillat mus å gjenopprette og overvåke dem i minst 48 til 72 timer før du går videre til neste trinn.
MERK: Bup-SR, gitt preemptively, vil vare opptil 72 timer, så ytterligere smertestillende midler er normalt ikke nødvendig. Imidlertid vil dyr bli gitt ekstra smertestillende etter behov (hvis sløv, ikke å spise, ruffled). Hvis et kirurgisk sted utvikler tegn på postoperativ infeksjon (dvs. rødhet, hevelse, ømhet, allodynia, hyperalgesi, hyperpati eller suppuration), eller hvis musen vokter det berørte området, euthanize musen. Hvis kreftceller injiseres i CSF, vil LMD- og tumorprogresjon utvikle seg i CNS innen 1 eller 2 uker (avhengig av hvilke typer CTCer eller cellelinje som brukes) (Figur 1).
- Med nakken i full forlengelse, og begynner like mellom pinnae, kjør kirurgiske saksespisser nedover med et lite trykk over oksipitalbenet.
2. Murine Ommaya montering og implantasjon
- Forberedelse av stasjon
- Desinfiser stasjonsoverflaten. Plasser et blått belegg over overflaten, og hold klar alle steriliserte verktøy og forsyninger som er angitt i figur 2.
- Presurgisk prosedyre
- Påfør analgesi (Bup-SR), og oppretthold steril teknikk som beskrevet i pkt. 1.2.
- Kirurgisk implantasjon av Murine Ommaya
- Monter Murine Ommaya injeksjonsenhet ved hjelp av en 25 G (0,51 mm ytre diameter) miniatyr injeksjonsport og en 1 mm avstandsskive. Bruk et cyanoakrylat sterilt lim for å sikre penetrasjon av ca. 2,5 mm metallkanyle i høyre hjernehalvdel (Figur 3A-C).
MERK: En MR-kompatibel Mouse Ommaya-prototype ble utviklet i dette laboratoriet, som allerede har begge deler (miniatyrinjeksjonsport og avstandsstykke) 3D-trykt sammen som en enkelt enhet (Figur 3D). Enkeltenhetsversjonen ble testet av MR og kan spare tid ved å eliminere monteringstrinnet. - Bedøv musen med 2-3% isofluran til det ikke er tegn på høyre refleks. Videre, se etter hale og / eller pote klype refleks for å bekrefte tilstanden til anestesi.
- Barber hele ventraloverflaten på pelshodet, og forbered huden i henhold til den sterile teknikken, som tidligere beskrevet i trinn 1.2.3. Plasser musen i det stereotaktiske apparatet med en nesekegle for å fortsette isofluranadministrasjonen under prosedyren; isofluran til 1,5%. Stram forsiktig ørestengene for å feste hodet, og bruk øyesmøremiddel for å dekke øynene til musen.
- Lag et lite hudinnsnitt (3 mm), etterfulgt av stump disseksjon av det underliggende subkutane vevet for å eksponere skallen. Tørk skallen med hydrogenperoksid-gjennomvåt bomull-tipped applikator pinner.
- Bor et burrhull i skallen 0,5 mm bakre og 1,1 mm lateral av bregma-det anatomiske punktet på skallen der koronal suturen krysses vinkelrett av sagittal sutur (Figur 3A)-samt et 0,9 mm burrhull for å eksponere dura mater. Flytt mikrodrillen til side, og skår forsiktig benet umiddelbart rundt burrhullet før du setter inn en injeksjonsport (dybde på ca. 2,5 mm), festet til skallen ved hjelp av et cyanokrylat sterilt lim. Tilstandssuging rundt injeksjonsstedet ved hjelp av 4-0 nylon suturer uten absorbans i et avbrutt sømmønster eller veskestrengsuging11.
- Hus etter operasjonen mus i individuelle bur for kirurgi utvinning.
MERK: Det er mulig at Murine Ommaya kan komme av når flere kirurgi-gjenopprettede mus er plassert i samme bur, muligens på grunn av konstant tukling interaksjoner. Det anbefales at Murine Ommaya-implanterte mus er plassert individuelt (eller ikke mer enn 2 mus per bur) i løpet av legemiddeleffektstudien.
- Monter Murine Ommaya injeksjonsenhet ved hjelp av en 25 G (0,51 mm ytre diameter) miniatyr injeksjonsport og en 1 mm avstandsskive. Bruk et cyanoakrylat sterilt lim for å sikre penetrasjon av ca. 2,5 mm metallkanyle i høyre hjernehalvdel (Figur 3A-C).
3. Murine Ommaya behandling
- Dosering av mus ved hjelp av Murine Ommaya
- Bedøv musen med 2-3% isofluran, til det ikke er tegn på høyre refleks. Videre, se etter hale og / eller pote klype refleks for å bekrefte vedlikehold av anestesi.
- Få tilgang til Murine Ommaya ved hjelp av en portinjeksjonsadapter og en Hamilton-sprøyte. Hold toppen av miniatyrinjeksjonsporten med tang og sett portinjektoradapteren forsiktig helt inn i portens septum.
MERK: Portinjektoren gjennomsyrer portens septum på en måte som reduserer død plass til et minimum og tillater kontrollert injeksjon via en motorisert sprøytepumpe (figur 4A). Målrettede/nye behandlinger injiseres med en strømningshastighet på 1 μL/min under anestesi. Behandlingen skal gis med angitte intervaller (daglig/ukentlig) for en bestemt varighet (uker/måneder), etter forskerens skjønn.
Et volum mellom 3 og 7 μL er optimalt, da et volum < 3 μL er upålitelig, og et volum > 7 μL kan forårsake for mye trykk. Størrelsen på Hamilton-sprøyten kan variere fra 10 til 100 μL, avhengig av antall mus i hver behandlingsarm. Hvis du forhåndslaster riktig volum i Hamilton-sprøyten, forhindrer du gjentatt utskifting av sprøyten og minimerer dermed feil. Det er best å dedikere 1 Hamilton sprøyte per behandlingsarm. - Når injeksjonen er gjort, løsne Murine Ommaya fra portinjeksjonsadapteren ved hjelp av tang, og returner musen til buret for å gjenopprette fra anestesi, som beskrevet ovenfor i trinn 1.3.7.
- Eutanasi
- Avlive musene ved innånding av karbondioksid (CO2) fra en komprimert tankkilde. Utsett musene for økende konsentrasjoner av CO2 (dvs. en forskyvningshastighet fra 10% til 30% av kammervolumet / min skal brukes) for å unngå eller minimere ubehag eller nød. Overvåk musene til forsikring om opphør av kardiovaskulære og respiratoriske bevegelser.
Representative Results
Hos mus er det totale volumet av CSF ca. 35-40 μL og produseres med en hastighet på ca. 350 nL / min; det snur 12-13 ganger om dagen12. For å visualisere injeksjonsruten ble 2% Evans Blue injisert via Murine Ommaya-modellen, hvoretter 15 min og 30 min fikk lov til å gå før høsting av hjernen for analyse. Fargestoffet infiltrerte vellykket ventriklene og hjernen på 15 min. Innen 30 min ble fargestoffet synlig på ryggmargen (figur 4).
Som et konseptbevis ble BALB/c-mus injisert med en luciferase-merket Her2+ TUBO brystkreftcellelinje intracisternally, og Murine Ommayas ble implantert. Omtrent 1 uke etter injeksjonen av kreftceller begynte musene å utvikle LMD. Disse musene ble behandlet en gang i uken i opptil 4 uker med Her2-antistoff immunterapi, enten gjennom systemisk terapi via intraperitoneal injeksjon eller intrathecally via Murine Ommaya (Figur 5A).
Selv om ubehandlede mus døde ved dag 19, overlevde alle mus som fikk intratekal terapi gjennom Murine Ommaya (P = 0,004). Ved uke 4 ble det observert en fullstendig regresjon av svulster. Sammenlignet med mus behandlet med systemisk terapi, som hadde moderat suksess med behandling av LMD, hadde mus som fikk intratekal terapi en mye lengre total overlevelse (figur 5B).
Figur 1: Injeksjon av sirkulerende tumorceller i cisterna magna i en murine xenograft modell for å studere leptomeningeal sykdom og sentralnervesystemet metastaser. (A) En illustrasjon som viser plasseringen av cisterna magna og CSF tilgangssted, der CTCer injiseres ved hjelp av en Hamilton sprøyte. (B) Et representativt IVIS-bilde av mus som hadde utviklet leptomeningeal sykdom og sentralnervesystemet metastaserer (hjerne og langs ryggmargen) etter 2 ukers injeksjon med sirkulerende tumorceller. Celler ble merket med et luciferase reportergen. Kontrolldyr injisert med saltvann utviklet ikke svulster (n = 3), og eksperimentet ble utført i triplikat. Forkortelser: CTCer = sirkulerende tumorceller; IVIS = in vivo bildebehandlingssystem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Et eksempel på et arbeidsstasjonsoppsett for å utføre Murine Ommaya-implantasjonen hos mus. (1) Gassbedøvelse maskin / fordamper. (2) Sterilt blått papir draperi som dekker et stereotaxisk stativ. (3) Stereotaxic enhet (stativ/scene, ørestenger, nesekjegle). (4) Mikrodrill. (5) Forstørrelsesglass med lys. (6) Steril bomull tappet applikator pinner med steril saltvann skyllebeholder. (7) Hydrogenperoksid. (8) Perle sterilisator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Implantasjonen av Murine Ommaya-enheten. (A) En illustrasjon med en pil som peker på bregmaens plassering på skallen, og omtrentlig avstand der et burrhull bores i skallen (0,5 mm bakre / 1,1 mm lateral) fra bregmaen ved hjelp av en mikrodrill. (B) En Murine Ommaya monteres ved å kombinere en metallkanyle og en 1 mm avstandsstykke som base for limfeste til skallen. (C) Representative bilder av mus som hadde Murine Ommayas implantert; Disse musene overvåkes for å sikre at de er lyse, årvåkne og reaktive før de mottar injeksjoner. (D) Et eksempel på prototypen magnetisk resonansavbildningskompatibel Murine Ommaya og representative hjernemagnetiske resonansavbildningsbilder av Murine Ommaya-implantater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Intraventrikulær injeksjon (sentralnervesystemet) ved hjelp av Murine Ommaya. (A) Et bilde av en injeksjon, tilgang til ventrikelen og sentralnervesystemet via Murine Ommaya. Mus forblir under anestesi under injeksjonen. I eksemplet er Murine Ommaya koblet til miniatyrporten som er festet til en ferdigfylt Hamilton-sprøyte. Injeksjoner utføres ved hjelp av et automatisk injeksjonssett med en infusjonshastighet på 1 μL / min og et volum på 5-7 μL. Et bilde av en musehjerne injisert med Evans Blue vises. Sirkelen viser hvor Murine Ommaya var festet. Ingen lekkasje av fargestoffet ble observert på utsiden av hjernen. Et tverrsnitt av hjernen viser at laterale ventrikler ble fylt med fargestoffet; fargestoffet trengte ikke inn i hjernen parenchyma. (B) Bilder av musehjerner etter 15 og 30 min etter injeksjon av Evans Blue fargestoff. Fargestoffet infiltrerte hjernen (15 min) og begynte å sirkulere på ryggmargen (30 min). Av 5 mus fikk 4 fargestoff for visualisering, og 1 tjente som kontroll. Eksperimentet ble gjentatt i triplikat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Direkte målrettet immunterapi ved hjelp av Murine Ommaya øker den totale overlevelsen av brystkreft-assosierte leptomeningeal sykdom mus. (A) BALB / c mus ble injisert med luciferase reporter-merket menneskelig epidermal vekstfaktor reseptor 2-positive TUBO celler, en murin brystkreft celle linje. Tre dager etter cisterna magna injeksjoner, Murine Ommayas ble implantert. Mus begynte å utvikle leptomeningeal sykdom (LMD) 1 uke etter injeksjon. LMD-mus ble behandlet med enten en human epidermal vekstfaktorreseptor antistoff systemisk via intraperitoneal injeksjon eller via intratekal (Murine Ommaya) som en direkte målrettet tilnærming. Injeksjoner ble gitt en gang i uken i opptil 4 uker. Sammenlignet med ubehandlede mus overlevde mus som fikk immunterapi mye lenger. Murine Ommaya mus hadde fullstendig sykdomsregresjon innen den fjerde uken, og disse musene ble til slutt kurert for sykdom. (B) Disse musene hadde også betydelig bedre median overlevelse (Mantel-Cox test; P = 0,004; n = 5 mus per behandlingsarm) og bedre total overlevelse enn systematisk behandlede LMD-mus. Forkortelser: LMD = leptomeningeal sykdom; IP = intraperitoneal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Her har Murine Ommaya blitt beskrevet som en pålitelig modell, som gjør det mulig å gjentatt administrering av kreftmidler i CSF-rommet i prekliniske modeller av LMD og andre CNS-relaterte sykdommer. CSF ble samplet fra mus mens enheten fortsatt var festet uten avbrudd. Denne direkte målrettede terapi xenograft-modellen er et viktig skritt i å utvikle og teste rasjonelle behandlingsstrategier for LMD. Tiden fra cisterna magna injeksjoner til det første tegn på LMD utvikling varierer avhengig av kreftcelle type. LMD- og CNS-metastaser begynner å ta form rundt 1 eller 2 uker etter CTC-inokulering. Hvis en svært proliferativ kreftcellelinje brukes, er det mulig at metastase kan forekomme om <7 dager. I dette tilfellet kan vaskularisering på grunn av tumorvekst noen ganger gjøre implantasjon av Murine Ommaya utfordrende. En løsning på denne utfordringen er å redusere antall kreftceller til injeksjon i CSF-rommet, noe som gir mer tid før tumorutvikling. Videre har denne protokollen blitt optimalisert for å implantere Murine Ommaya senest 72 timer etter cisterna magna injeksjonen for å sikre nok tid for mus til å komme seg etter operasjonen før den første behandlingen. Forskeren bør beregne vekstraten for CTCene i xenograftmodeller før de planlegger behandlingsregimet.
Selv om det finnes andre direkte intraventrikulære leveringsmetoder, for eksempel bruk av et osmotisk pumpesystem eller en intracerebroventricular (ICV) bolusinjeksjon, som beskrevet tidligere9, er det flere fordeler med å bruke Murine Ommaya-modellen. For eksempel gjøres en ICV bolusinjeksjon i en enkelt levering, mens Murine Ommaya tillater flere doser behandling når som helst, enten gitt som et enkelt middel eller som kombinerte terapier. Den osmotiske pumpen er designet for å opprettholde i opptil 14, 28 eller 42 dager før pumpen må byttes ut, og noen ganger oftere hvis en mindre mus med en mindre pumpe brukes. Endring av osmotisk pumpe krever en kirurgisk prosedyre, noe som gir stress til tumorbærende mus. En Murine Ommaya-erstatning er ikke nødvendig for langvarige eksperimenter så lenge enheten forblir intakt. Det minimerer også potensiell variasjon som skyldes endring av pumpen9. Implanterte Murine Ommayas i eksperimentelle mus forble intakt i mer enn 42 dager, og denne varigheten tillot langvarige behandlingsregimer.
Tidligere funn tyder på at en pulsatile periodisk dosering i CSF har bedre effekt mot LMD enn en langvarig legemiddelleveringsprosess ved infusjon13. Det ville være umulig å utføre gjentatte endoseinjeksjoner ved hjelp av det osmotiske pumpesystemet. Det er ingen enkel måte å skylle ut den gjenværende fanget væsken etter hver injeksjon. Den osmotiske pumpen er også begrenset til å levere blandinger av kompatible eller enkle legemidler og krever vanligvis høyere mengder legemiddelforberedelse for kontinuerlig infusjon. Derimot er Murine Ommaya designet for nøyaktige mikroinjeksjoner så lite som 3 til 7 μL, uten å måtte ta hensyn til død plass, og det er ingen begrensning på hvilken type medikamenter forskere kan bruke, inkludert immuncelleterapi. Murine Ommaya minimerer også reagensavfall hvis en bestemt prøve er dyrebar og maksimerer bruken av den ressursen. For ethvert behandlingsregime som krever flere doser anti-kreftbehandlinger, er Murine Ommaya enkel å bruke, og det er minimal risiko for infeksjon eller kirurgisk feiloppfinnelse, med de alternative tilnærmingene til gjentatte ganger tilgang til CSF kirurgisk eller via gjentatt levering med en nål. Murine Ommaya gir forskere fleksibilitet til å justere legemiddelkonsentrasjoner og doseringsfrekvenser og vurdere målmodulering og varighet av studien i henhold til forskningen av interesse.
En begrensning av Murine Ommaya er at forskere kan finne det vanskelig å implantere enheten i mindre mus. Derfor er det bedre å bruke mus som er minst 8 til 10 uker. Det er mulig for Murine Ommaya å komme av under behandlingsstudien hvis enheten ikke er festet til skallen under implantasjonstrinnene og limet slites av, eller hvis musene har tuklet med den. Sistnevnte scenario oppstår oftere når flere mus ble plassert i samme bur. Derfor anbefales det å huse ikke mer enn to Murine Ommaya-implanterte mus per bur i løpet av behandlingsplanen. Denne protokollen ble modifisert for å påføre cyanokrylat sterilt lim på avstandsstykket, som ble funnet å være det mest effektive limet for å feste avstandsstykken til skalleoverflaten og forhindre at Murine Ommaya kom av. Resultatene viste at LMD-mus hadde nytte av direkte intratekal terapi via Murine Ommaya, med økt total overlevelse. Enkelt mikrolitervolumer kan trygt administreres, omgå BBB, og dermed redusere mengden legemiddelforberedelse. Viktigst av alt, musene som ble kurert av CNS-metastaser fra Her2-antistoff immunterapistudien har forblitt sunne.
Et samarbeid med en produsent hadde som mål å utvikle en MR-kompatibel versjon av Murine Ommaya for PDX-modellen til LMD. Fordi denne prototypeversjonen har en spacer innlemmet, er det ikke nødvendig med montering, noe som gir bedre overholdelse av skallen. En begrensning av denne prototypen er at selv om enheten er MR-kompatibel, genererer den en skygge der enheten settes inn, noe som reduserer synligheten til bildet for kvantifiseringsanalyser. Den MR-kompatible versjonen er et godt alternativt verktøy når ex vivo CTC-prøvetaking er en begrensende faktor, og prelabeling av celler er ikke mulig. Kombinasjonen av en LMD xenograft modell og Murine Ommaya-teknikken er gunstig for å studere direkte målrettet legemiddeleffekt som omgår BBB. Resultatene fra disse in vivo-studiene er klinisk relevante for å designe rasjonelle terapeutiske strategier for pasienter med LMD.
Disclosures
Peter Forsyth sitter i rådgivende styrer for Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen og Ziopharm, utenfor det innsendte arbeidet. Alle andre forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson og resten av Comparative Medicine-teamet ved University of South Florida for deres tekniske støtte og vedlikehold av dyrene våre. Vi takker Instech Laboratories, Inc. for deres innsats i samarbeid med oss basert på vår forespørsel om å utvikle en MR-kompatibel Murine Ommaya. Dette arbeidet støttes av National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (til K.S.M. Smalley), Department of Defense (DOD) W81XWH1910675 (til B. Czerniecki og P. Kalinski), og Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (til P. Forsyth og D. Duckett). Redaksjonell bistand ble gitt av Moffitt Cancer Centers Office of Scientific Writing av Dr. Paul Fletcher og Daley Drucker. Det ble ikke gitt noen kompensasjon utover deres vanlige lønn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C.
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), Suppl 2 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al.
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
