Summary
כאן, אנו מתארים מודל קסנוגרפט מורין הדומה מבחינה תפקודית למאגר Ommaya בחולים. פיתחנו את מורין אומאיה כדי לחקור טיפולים חדשניים למחלת לפטומינגיאל הקטלנית באופן אוניברסלי.
Abstract
מחלת לפטומינגייל (LMD) היא סוג נדיר של גרורות במערכת העצבים המרכזית (CNS) לנוזל השדרה המוחי (CSF). סוגי הסרטן הנפוצים ביותר הגורמים ל- LMD הם סרטן השד והריאות ומלנומה. חולים שאובחנו עם LMD יש פרוגנוזה גרועה מאוד בדרך כלל לשרוד רק כמה שבועות או חודשים. אחת הסיבות האפשריות לחוסר היעילות של טיפול מערכתי נגד LMD היא הכישלון להשיג ריכוזים יעילים מבחינה טיפולית של תרופות ב- CSF בגלל מחסום דם - מוח שלם ובלתי חדיר יחסית (BBB) או מחסום דם-CSF על פני מקלעת הכורואיד. לכן, מתן ישיר תרופות תוך-חדרית או תוך-חדריות עשוי להתגבר על מחסומים אלה. קבוצה זו פיתחה מודל המאפשר אספקה יעילה של טיפולית (כלומר, תרופות, נוגדנים וטיפולים תאיים) באופן כרוני ודגימה חוזרת ונשנית של CSF כדי לקבוע ריכוזי תרופות אפנון היעד ב- CSF (כאשר microenvironment הגידול ממוקד בעכברים). המודל הוא המקבילה המורינית של מאגר Ommaya תואם תהודה מגנטית, אשר משמש קלינית. דגם זה, המודבק לגולגולת, הוגדר כ"מורין אומאיה". כהוכחה טיפולית של מושג, קולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי 2 נוגדנים (שיבוט 7.16.4) הועברו לתוך CSF באמצעות מורין Ommaya לטיפול בעכברים עם LMD מן קולטן גורם האפידרמיס האנושי 2 חיובי סרטן השד. מורין Ommaya מגביר את היעילות של אספקת סמים באמצעות נמל גישה מיניאטורי ומונע בזבוז של תרופות עודפות; זה לא מפריע לדגימה CSF למחקרים מולקולריים ואימוניולוגיים. מורין Ommaya שימושי לבדיקת טיפולים חדשניים במודלים ניסיוניים של LMD.
Introduction
מחלת לפטומיניאל (LMD) היא גרורות אגרסיביות בשלב מאוחר של מערכות החזה, שבה תאי הגידול ניגשים ל- CSF וחדירים לפני השטח של המוח וחוט השדרה1. סוגי הסרטן הנפוצים ביותר הגורמים ל- LMD כוללים את אלה של השד והריאה, כמו גם מלנומה2. LMD תוצאות מספר תסמינים נוירולוגיים וסימנים כגון כאבי ראש, שיתוק עצבי גולגולתי, צוואר נוקשה, רדיקולאופתיות. הפרוגנוזה עבור חולים עם LMD היא בדרך כלל גרועה מאוד (הישרדות ממוצעת נמדדת בשבועות) והיא קטלנית אוניברסלית3,4,5,6,7. הטיפול בניתוחים, הקרנות וכימותרפיה מערכתית הוא פליאטיבי. טיפול מערכתי עבור LMD עלול להיכשל בגלל חדירת סמים לקוי לתוך CSF על פני BBB שלם או מחסום CSF דם על פני מקלעת choroid1.
לכן, מתן טיפולים לסרטן (למשל, תרופות וטיפולים מבוססי נוגדנים כולל מעכבי מחסום וטיפולים תאיים) ישירות לתוך CSF עשוי להתגבר על מגבלה זו8. גישה ודגימה של CSF מחולים אפשרית באמצעות מאגר Ommaya המושתל מתחת לקרקפת. מכשיר זה מאפשר ניהול של סוכני סרטן (למשל, מטוטרקסט ו trastuzumab) כמו גם דגימה של CSF למחקרי אבחון (למשל, האבחנה הציטולוגית של LMD כדי לפקח על תגובות לטיפול) מבלי לבצע ברז בעמוד השדרה. מאגר אומאיה מורין תוכנן לחקות את אלה המשמשים קלינית. המאגר דורש הרכבה של חלקים ביציאה וברווחים ניגשים ושינוי של טכניקת שימור העכבר, המאפשרת למכשיר להישאר שלם לצמיתות לאורך כל תקופת מחקר התרופה. מכשיר זה הוגדר כ"מורין אומאיה ".
בניגוד לטכניקת משאבת עירוי אוסמוטי, הדורשת הכנת נפחים נוזליים עודפים כדי למלא מראש את החלל הריק בצינורות וחליטה רציפה על זריקות תכופות9, מורין Ommaya ממזער את בזבוז של פתרונות סמים. הוא מאפשר ניהול יעיל של מנות בודדות מרובות של טיפולים בכל זמן נתון בכמויות קטנות (3-7 μL) לתוך CSF באמצעות מזרק המילטון, יציאת גישה מיניאטורית, מזרק אוטומטי. בזמן אמת, היעילות של תרופות בדיקה נגד LMD יכול להיקבע על ידי הדמיה. באמצעות גישה זו, ניתן לבדוק מגוון של כימותרפיה, נוגדנים ואימונותרפיות של תאים (כסוכנים יחידים או משולבים) נגד LMD כדי לתרגם בממצאי vivo לאסטרטגיות טיפול רציונליות עבור חולים. כדי לשפר עוד יותר את יכולת ההדמיה של דגם קסנוגרפט (PDX) שמקורו במטופל של LMD, נעשה שיתוף פעולה עם יצרן לפיתוח גרסה תואמת דימות תהודה מגנטית (MRI) של מורין אומאיה, שאינה דורשת הרכבה ומוכנה לשימוש. יכולת MRI מועילה, במיוחד עבור דגמי PDX שבהם כמות תאי הגידול במחזור (CTCs) מ- CSF היא לפעמים הגורם המגביל, ולעתים קרובות כאשר CTCs prelabeling אינו אפשרי.
מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט שמתחיל בהזרקת CTCs לעיבוד עכברים עם LMD . לאחר מכן מושתלת מורין אומאיה בניתוח, ומבצעים מספר שלבי טיפול תרופתי באמצעות מורין אומאיה. כהוכחה למושג להדגמה, בוצעה השוואה בין-זו של in vivo, שבה הועבר נוגדן גורם הגדילה האפידרמלי האנושי מורין 2 (Her2) הנקרא שיבוט 7.16.4 (המקבילה האנושית לטרסטוזומב)10. הנוגדן מכוון Her2+ תאים סרטניים השד או באמצעות מורין Ommaya (טיפול ממוקד ישיר או תוך-מערכתי) או על ידי הזרקה תוך פטרייתונית (טיפול מערכתי). התוצאות הראו כי עכברים עם LMD שקיבלו אימונותרפיה תוך-ת-אופן ישיר חיו זמן רב יותר באופן משמעותי מאלה שטופלו באותו טיפול באופן שיטתי. גרורות מערכת החיות בעכברים שטופלו באמצעות מורין אומאיה נסוגו כמעט לחלוטין על ידי המנה השלישית של השבוע השלישי של הטיפול, וכתוצאה מכך הישרדות כללית משופרת.
Protocol
הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת דרום פלורידה מוסדית טיפול ושימוש הוועדה (IS00005974).
1. הזרקת CTCs ל- CSF כדי ליצור דגם LMD של עכבר
- הכנת CTCs
- חשב את מספר CTCs הדרוש להזרקה, ולהכין השעיה של תא יחיד ב 1.0 × 104 תאים / μL מלוחים חוצצי פוספט סטריליים (PBS). מניחים את השעיית התא על קרח או ב 4 °C (5 °F) לאורך כל ההליך.
הערה: בעת שימוש בקווי תאים הדורשים טריפסיניזציה, הקפד לשטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילי כדי להסיר טריפסין. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. אם נעשה שימוש בקוהורטה גדולה (>50 עכברים), ספר מחדש את התאים ואמת את הכדאיות של התא בין זריקות כדי להבטיח שמספר עקבי של תאים מנוהלים לכל עכבר.
- חשב את מספר CTCs הדרוש להזרקה, ולהכין השעיה של תא יחיד ב 1.0 × 104 תאים / μL מלוחים חוצצי פוספט סטריליים (PBS). מניחים את השעיית התא על קרח או ב 4 °C (5 °F) לאורך כל ההליך.
- הליך פרסוקרתי
- הזרק לעכבר באופן תת עורי 1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין בשחרור מתמשך (Bup-SR).
הערה: אין להזריק את אזור ההסתה המוצע; בחר אתר הזרקה הרחק משען השכם. - להעשיר את העכבר עם 2-3% איזופלוראן עד שהוא לא מראה סימנים של רפלקס הימין. בנוסף, לבדוק אם יש רפלקס צביטת זנב ו/או כף רגל כדי לאשר את מצב ההרדמה.
- הכן את העכבר לניתוח במיקום מרוחק מאזור הניתוח. קליפ את האתר הכירורגי (כלומר, פני השטח של הגולגולת) עם מספיק אזור גבול כדי למנוע פרווה מזהם את אתר החתך; לאחר מכן, להרוות את האתר עם חיטוי עור נבט, עובד ממרכז האתר לפריפריה, ולאחר מכן לאפשר להתייבש. יש למרוח וילון סטרילי או חומר וילון פלסטיק סטרילי המגובה בדבק כדי להגן על האתר הכירורגי מפני זיהום.
הערה: יש לעבוד על מכשירים באופן אוטומטי מראש וטיפים מעוקרים מחדש בין בעלי חיים באמצעות מעקר חרוזי זכוכית. - לגלח את הפרווה של כל פני השטח הגחון של הראש, ולהכין את העור באמצעות טכניקה סטרילית.
- למקם את האף עם חרוט האף בצורת L שונה של המנגנון סטריאוטקטי, להבטיח את nares להישאר ברור ופתוח. באמצעות סרט על פני המשטחים הגחון של שני הפינה, משכו בעדינות את העור קדימה כדי לאבטח אותו לקונוס האף, וכיופפו את הצוואר בזווית של כ-90° לאחר המאובטח. תן 1.5% איזופלוראן כדי לשמור על הרדמה.
הערה: מיקום נכון יגרום לכך שאזור ההחתכה יוצג באופן המאפשר זיהוי קל של הרכס העגול של העצם העורפית. - מקם את הגוף כדי להבטיח את עמוד השדרה נשמר ברמה עם מגנה בור, ותוך כדי החלת משיכה קלה על הזנב, מניחים סרט בבסיס הזנב כדי לאבטח.
- הזרק לעכבר באופן תת עורי 1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין בשחרור מתמשך (Bup-SR).
- הזרקת מגנה בור כירורגית
- עם הצוואר בהרחבה מלאה, ומתחיל רק בין הפינה, הפעל את קצות המספריים הניתוחיים כלפי מטה עם לחץ קל על פני העצם העורפית.
הערה: בעוד בתנוחה זו באמצע הקו, דיכאון קטן מורגש כאשר קצות המספריים לטבול לתוך האזור קער מעל מגנה בור. - הפוך 3-5 מ"מ קטן 3-מ"מ קו האמצע ין יתד ממש מעל קישוש חישי. צייר 5 μL של השעיית תא ב 1.0 × 104 תאים / μL (סה"כ 5.0 × 104 תאים) לתוך מזרק 30 G המילטון.
- השתמש במלקחיים קהים עם טיפים של 1-2 מ"מ כדי ללחוץ בעדינות על מגנה הבור. הציגו טיפים במצב סגור ופתחו אותם תוך הפעלת לחץ כלפי מטה על הדורה.
- חזור על ניתוח בוטה המתואר בשלב הקודם עד קרום dural מזוהה בקלות, ואת כלי הדם הקשורים נראים באזור החשוף.
הערה: חלון ההזרקה המתקבל מבטיח שכלי הדם לא ניזוקו במהלך החדרת מחט. - תוך החזקת המלקחיים פתוחים כדי לחזור בהם מהשרירים שמסביב, הציגו מחט 30 גרם שאינה קורינג מתחת לדורה כדי לדמיין את שיפוע. ודא המחט הוא הציג רק מעבר שיפוע עצמו. פרוס לאט בוכנה מזרק, ולספק תאים ממש מתחת דורה.
- מניחים כראוי את שיכול כדי לצפות בזריקה מתחת לדורה. בזהירות לנהל את הטכניקה, ולהשתמש במחט 30 G non-coring כדי למנוע נזק לממברנה ולהבטיח דליפה מינימלית. אם נודע על דליפה, יש להפעיל לחץ עדין עם אפליקטור עם קצה כותנה.
- סגור את העור על ידי מריחת קליפ פצע או מיקרו טיפה של דבק העור. לאחר ההזרקה מבוצעת בהצלחה, לאפשר לעכברים להתאושש מהרדמה על שמיכה חמה, התבוננות בהם ברציפות עד שהם יכולים לשמור על תנוחה בעצם ולהפגין תנועה תכליתית.
- פקח על העכברים מדי יום לאחר הניתוח בשבוע הראשון. אם עכבר נראה בכאב או במצוקה, לטפל בו עם 10 מ"ג / קילוגרם הזרקה תת עורית של carprofen אחת ל 12 עד 24 שעות עד 5 ימים בהתבסס על ייעוץ וטרינרי והוראה. אפשר לעכברים להתאושש ולנטר אותם לפחות 48 עד 72 שעות לפני שתמשיך לשלב הבא.
הערה: Bup-SR, נתון מראש, יימשך עד 72 שעות, כך שבדרך כלל אין צורך במכאומי כפיים נוספים. עם זאת, בעלי חיים יקבלו משען נוסף לפי הצורך (אם רדומים, לא אוכלים, וולאנים). אם אתר כירורגי מפתח סימנים של זיהום לאחר הניתוח (כלומר, אדמומיות, נפיחות, רגישות, אלודיניה, היפראלגזיה, היפרפתיה או החלפה), או אם העכבר שומר על האזור הפגוע, המת תחסד את העכבר. אם תאים סרטניים מוזרקים בהצלחה ל- CSF, התקדמות LMD וגידול תתפתח במערכת החזותית בתוך שבוע או שבועיים (בהתאם לסוגי ה- CTCs או קו התא המשמשים) (איור 1).
- עם הצוואר בהרחבה מלאה, ומתחיל רק בין הפינה, הפעל את קצות המספריים הניתוחיים כלפי מטה עם לחץ קל על פני העצם העורפית.
2. הרכבה והשתלה של מורין אומאיה
- הכנת תחנה
- לחטא את פני השטח של התחנה. הניחו כיסוי כחול על פני השטח, והכנו את כל הכלים והאספקה המעוקרים המצוינים באיור 2.
- הליך פרסוקרתי
- החלת שך לשון (Bup-SR), ולשמור על טכניקה סטרילית כמתואר בסעיף 1.2.
- השתלה כירורגית של מורין אומאיה
- להרכיב את התקן הזרקת מורין Ommaya באמצעות 25 G (0.51 מ"מ קוטר חיצוני) יציאת הזרקה מיניאטורית דיסק מרווח 1 מ"מ. השתמשו בדבק סטרילי ציאנואקרילט כדי להבטיח חדירה של כ-2.5 מ"מ של צינורית המתכת לחצי הכדור הימני(איור 3A-C).
הערה: אב טיפוס של עכבר אומאיה תואם MRI פותח במעבדה זו, שכבר כוללת את שני החלקים (יציאת הזרקה מיניאטורית ומרווח) מודפסים יחד כיחידה אחת(איור 3D). גירסת היחידה היחידה נבדקה על-ידי MRI ויכולה לחסוך זמן על-ידי ביטול שלב ההרכבה. - להעשיר את העכבר עם 2-3% איזופלוראן עד שאין סימנים של רפלקס ימין. יתר על כן, לבדוק את הזנב ו /או כף רגל לצבוט רפלקס כדי לאשר את מצב ההרדמה.
- לגלח את כל פני השטח הגחון של ראש הפרווה, ולהכין את העור על פי הטכניקה סטרילית, כפי שתואר בעבר בשלב 1.2.3. מניחים את העכבר במנגנון הסטריאו-קטרקטי עם חרוט האף כדי להמשיך בניהול איזופלוראן במהלך ההליך; להקטין את האיזופלוריין ל-1.5%. הדק בעדינות את מוטות האוזן כדי לאבטח את הראש, והחיל חומר סיכה לעיניים כדי לכסות את עיני העכבר.
- הפוך חתך עור קטן (3 מ"מ), ואחריו ניתוח בוטה של הרקמות התת עוריות הבסיסיות כדי לחשוף את הגולגולת. יבשו את הגולגולת באמצעות מקלות אפליקטור ספוגי מי חמצן עם קצה כותנה.
- לקדוח חור בר בגולגולת 0.5 מ"מ אחורי ו 1.1 מ"מ לרוחב של ברגמה - הנקודה האנטומית על הגולגולת שבו התפר קורונל מצטלב בניצב על ידי תפירת sagittal (איור 3A) - כמו גם חור burr 0.9 מ"מ לחשוף את dura mater. הזז את המיקרודריל הצידה, והבקיע בעדינות את העצם המקיפה את חור הבר לפני הכנסת יציאת הזרקה (עומק של כ -2.5 מ"מ), המודבקת לגולגולת באמצעות דבק סטרילי ציאנואקרילט. תפר המדינה סביב נקודת ההזרקה באמצעות תפרי ניילון ללא ספיגה 4-0 בתבנית תפר מופרעת או תפר מחרוזת ארנק11.
- עכברים לאחר ניתוח בית בכלובים בודדים להחלמה ניתוח.
הערה: ייתכן כי מורין Ommaya עשוי לרדת כאשר עכברים רבים התאושש ניתוח שוכנים באותו כלוב, אולי בשל אינטראקציות שיבוש מתמיד. מומלץ כי עכברים מושתלים מורין Ommaya שוכנים בנפרד (או לא יותר מ 2 עכברים לכלוב) במהלך הניסוי יעילות התרופה.
- להרכיב את התקן הזרקת מורין Ommaya באמצעות 25 G (0.51 מ"מ קוטר חיצוני) יציאת הזרקה מיניאטורית דיסק מרווח 1 מ"מ. השתמשו בדבק סטרילי ציאנואקרילט כדי להבטיח חדירה של כ-2.5 מ"מ של צינורית המתכת לחצי הכדור הימני(איור 3A-C).
3. טיפול מורין אומאיה
- עכברים מנונים באמצעות מורין אומאיה
- למרדים את העכבר עם 2-3% איזופלוראן, עד שאין סימנים של רפלקס ימין. יתר על כן, לבדוק את הזנב ו /או כף רגל לצבוט רפלקס כדי לאשר תחזוקה של הרדמה.
- גש למורין אומאיה באמצעות מתאם הזרקת יציאה ומזרק המילטון. באמצעות מלקחיים, החזק את החלק העליון של יציאת הזרקה מיניאטורית ולהכניס בעדינות את מתאם מזרק היציאה באופן מלא לתוך המחיצה של הנמל.
הערה: מזרק היציאה חודר את המחיצה של הנמל באופן שמצמצם את שטח המת למינימום ומאפשר הזרקה מבוקרת באמצעות משאבת מזרק ממונעת (איור 4A). טיפולים ממוקדים/חדשניים מוזרקים בקצב זרימה של 1 μL / min בזמן הרדמה. הטיפול יינתן במרווחי זמן מוגדרים (יומיים/שבועיים) למשך זמן מוגדר (שבועות/חודשים), בהתאם לשיקול דעתו של החוקר.
אמצעי אחסון בין 3 ל- 7 μL הוא אופטימלי, מכיוון שנפח < 3 μL אינו אמין, ואמצעי אחסון > 7 μL עלול לגרום ללחץ רב מדי. גודל מזרק המילטון יכול לנוע בין 10 ל 100 μL, בהתאם למספר העכברים בכל זרוע טיפול. טעינה מראש של הנפח המתאים למזרק המילטון תמנע החלפה חוזרת ונשנית של המזרק, ובכך תמזער שגיאות. עדיף להקדיש מזרק המילטון אחד לכל זרוע טיפול. - לאחר ההזרקה נעשית, לנתק את מורין Ommaya ממתאם הזרקת הנמל באמצעות מלקחיים, ולהחזיר את העכבר לכלוב להתאושש הרדמה, כפי שתואר לעיל בשלב 1.3.7.
- המתת חסד
- להרדים את העכברים על ידי שאיפת פחמן דו חמצני (CO2) ממקור טנק דחוס. לחשוף את העכברים לריכוזים הולכים וגדלים של CO2 (כלומר, שיעור עקירה מ 10% עד 30% של נפח החדר / דקה הוא לשמש) כדי למנוע או למזער אי נוחות או מצוקה. נטר את העכברים עד להבטחה של הפסקת תנועות לב וכלי דם ונשימה.
Representative Results
בעכברים, הנפח הכולל של CSF הוא כ 35-40 μL והוא מיוצר בקצב של כ 350 nL / דקה; זה הופך מעל 12-13 פעמים ביום12. לצורך הדמיית מסלול הזריקה, 2% אוונס בלו הוזרק דרך מודל מורין Ommaya, ולאחר מכן 15 דקות ו 30 דקות הורשו לחלוף לפני קצירת המוח לניתוח. הצבע חדר בהצלחה לחדרים ולמוח ב-15 דקות. תוך 30 דקות, הצבע הפך גלוי על חוט השדרה(איור 4).
כהוכחה לרעיון, עכברי BALB/c הוזרקו עם קו תאים סרטן השד Her2+ TUBO שכותרתו לוציפראז באופן תפו"א, ואת מורין Ommayas הושתלו. כשבוע לאחר הזרקת תאים סרטניים, העכברים החלו לפתח LMD. עכברים אלה טופלו פעם בשבוע עד 4 שבועות עם אימונותרפיה של נוגדנים שלה, בין אם באמצעות טיפול מערכתי באמצעות הזרקה תוך-פטרייתונית או תוך-אט-ececally באמצעות מורין אומאיה(איור 5A).
למרות שעכברים שלא טופלו מתו ביום ה -19, כל העכברים שקיבלו טיפול תוך-תיא-תקלי דרך מורין אומאיה שרדו (P = 0.004). בשבוע 4 נצפתה רגרסיה מוחלטת של גידולים. בהשוואה לעכברים שטופלו בטיפול מערכתי, שזכה להצלחה מתונה בטיפול ב-LMD, לעכברים שקיבלו טיפול תוך-תרופתי הייתה הישרדות כוללת ארוכה בהרבה (איור 5B).
איור 1: הזרקת תאי גידול במחזור לתוך בור המים במודל קסנוגרפט מורין כדי לחקור מחלות לפטומינגייל וגרורות של מערכת העצבים המרכזית. (A)איור המציג את המיקום של מגנה הבור ואתר הגישה ל- CSF, שבו CTCs מוזרקים באמצעות מזרק המילטון. (B)תמונת IVIS מייצגת של עכברים שפיתחו מחלת לפטומינגייל ו גרורות של מערכת העצבים המרכזית (המוח ולאורך חוט השדרה) לאחר שבועיים של הזרקה עם תאים סרטניים במחזור. תאים תויגו עם גן כתב לוציפראז. בעלי חיים שליטה שהוזרקו עם תמיסת מלח לא פיתחו גידולים (n = 3), והניסוי בוצע במשולש. קיצורים: CTCs = תאים סרטניים במחזור; IVIS = במערכת הדמיה של ויוו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה להקמת תחנת עבודה לביצוע השתלת מורין אומאיה בעכברים. (1) מכונת הרדמה גז / מאדה. (2) וילון נייר כחול סטרילי המכסה מעמד סטריאוטקסי. (3) התקן סטריאוטקסי (מעמד/במה, מוטות אוזניים, חרוט באף). (4) מיקרודריל. (5) זכוכית מגדלת עם אור. (6) מקלות אפליקטור סטריליים עם מיכל שטיפת מלח סטרילי. (7) מי חמצן. (8) מחטא חרוזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השתלת מכשיר מורין אומאיה. (א)איור עם חץ המצביע על מיקום ברגמה על הגולגולת, והמרחק המשוער שבו נקדח חור בר בגולגולת (0.5 מ"מ אחורי/1.1 מ"מ לרוחב) מהבורגמה באמצעות מיקרודריל. (B)מורין אומאיה מורכבת על ידי שילוב צינורית מתכת ומרווח 1 מ"מ כבסיס לדבק מצורף לגולגולת. (ג)תמונות מייצגות של עכברים שהושתלו מורין אומאיאס; עכברים אלה מנוטרים כדי להבטיח שהם בהירים, ערניים, תגובתי לפני קבלת כל זריקות. (D)דוגמה לאב טיפוס של אב טיפוס של דימות תהודה מגנטית תואם מוריס אומאיה ותמונות הדמיה מייצגות של תהודה מגנטית במוח של שתלי מורין אומאיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הזרקה תוך-חדרית (מערכת העצבים המרכזית) באמצעות מורין אומאיה. (A)תמונה של זריקה, גישה לחדר ולמערכת העצבים המרכזית דרך מורין אומאיה. עכברים נשארים תחת הרדמה במהלך ההזרקה. בדוגמה, מורין אומאיה מחוברת ליציאה המיניאטורית המחוברת למזרק המילטון ממולא מראש. זריקות מבוצעות באמצעות הזרקה אוטומטית להגדיר בקצב עירוי של 1 μL / min ונפח של 5-7 μL. תמונה של מוח עכבר מוזרק עם אוונס כחול מוצג. המעגל מראה היכן היה מחובר מורין אומאיה. לא נצפתה דליפה של הצבע בחלק החיצוני של המוח. חתך רוחב של המוח מראה שהחדרים לרוחב היו מלאים בצבע; הצבע לא חדר לפרנצ'ימה במוח. (B)תמונות של מוחות עכבר לאחר 15 ו -30 דקות בעקבות הזרקת צבע כחול אוונס. הצבע חדר למוח (15 דקות) והחל להסתובב על חוט השדרה (30 דקות). מתוך 5 עכברים, 4 קיבלו צבע להדמיה, ו-1 שימש כשליטה. הניסוי חזר על עצמו בטריפליק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אימונותרפיה ממוקדת ישירה באמצעות מורין אומאיה מגבירה את ההישרדות הכוללת של עכברי מחלות לפטומיניאל הקשורות לסרטן השד. (A) עכברי BALB/c הוזרקו עם קולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי שכותרתו לוציפראז 2 תאי TUBO חיוביים, קו תאים של סרטן השד מורין. שלושה ימים לאחר זריקות ציססטרנה מגנה, מורין אומאיאס הושתלה. עכברים החלו לפתח מחלת לפטומינגייל (LMD) שבוע לאחר ההזרקה. עכברי LMD טופלו עם נוגדן קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי באופן שיטתי באמצעות הזרקה תוך-איפריטונית או באמצעות תוך-מערכתית (מורין אומאיה) כגישה ממוקדת ישירה. זריקות ניתנו פעם בשבוע עד 4 שבועות. בהשוואה לעכברים שלא טופלו, עכברים שקיבלו אימונותרפיה שרדו זמן רב יותר. עכברי מורין אומאיה סבלו מרגרסיה מלאה של המחלה עד השבוע הרביעי, ובסופו של דבר עכברים אלה נרפאו ממחלות. (B)לעכברים אלה הייתה גם הישרדות חציונית טובה יותר באופן משמעותי (מבחן מנטל-קוקס; P = 0.004; n = 5 עכברים לכל זרוע טיפול) והישרדות כללית טובה יותר מאשר עכברי LMD מטופלים באופן שיטתי. קיצורים: LMD = מחלת לפטומינגייל; IP = intraperitoneal. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
כאן, מורין Ommaya תוארה כמודל אמין, המאפשר ניהול חוזר ונשנה של סוכנים נגד סרטן לתוך שטח CSF במודלים פרה-אקליניים של LMD ומחלות אחרות הקשורות ל- CNS. CSF נדגם מעכברים בזמן שההתקן עדיין היה מחובר ללא הפרעה. מודל קסנוגרפט טיפול ממוקד זה הוא צעד חשוב בפיתוח ובדיקת אסטרטגיות טיפול רציונלי עבור LMD. הזמן מזריקות מגנה צ'יסטרנה לסימן הראשוני של התפתחות LMD משתנה בהתאם לסוג התא הסרטני. גרורות LMD ו- CNS מתחילות ללבוש צורה כ- 1 או 2 שבועות לאחר חיסון CTC. אם נעשה שימוש בקו תאים סרטני שגשוג מאוד, ייתכן כי גרורות יכול להתרחש <7 ימים. במקרה זה, כלי דם עקב גידול יכול לפעמים עושה השתלה של מורין Ommaya מאתגר. פתרון אחד לאתגר זה הוא להפחית את מספר התאים הסרטניים להזרקה לחלל CSF, ומאפשר זמן נוסף לפני התפתחות הגידול. יתר על כן, פרוטוקול זה כבר אופטימיזציה להשתיל Murine Ommaya לא יאוחר מ 72 שעות לאחר הזרקת מגנה בור כדי להבטיח מספיק זמן לעכברים להתאושש מניתוח לפני הטיפול הראשון. החוקרים צריכים לחשב את קצב הצמיחה של CTCs במודלים קסנוגרפט לפני תכנון משטר הטיפול.
למרות שיש שיטות משלוח תוך חדריות ישירות אחרות, כגון שימוש במערכת משאבה אוסמוטית או הזרקת בולוס תוך-חדרית (ICV), כפי שתואר קודם לכן9, ישנם מספר יתרונות לשימוש במודל מורין אומאיה. לדוגמה, הזרקת בולוס ICV נעשית במשלוח יחיד, ואילו מורין Ommaya מאפשר מינונים מרובים של טיפול בכל עת, אם ניתנו כסוכן יחיד או כטיפולים משולבים. המשאבה האוסמוטית מיועדת לקיים עד 14, 28 או 42 ימים לפני המשאבה זקוקה להחלפה, ולפעמים בתדירות גבוהה יותר אם משתמשים בעכבר קטן יותר עם משאבה קטנה יותר. שינוי המשאבה האוסמוטית דורש הליך כירורגי, מה שמוסיף מתח לעכברים הנושאים גידולים. החלפת מורין אומאיה אינה הכרחית לניסויים ארוכי טווח כל עוד המכשיר נשאר שלם. זה גם ממזער את השונות הפוטנציאלית הנובעת משינוי המשאבה9. מושתל מורין Ommayas בעכברים הניסיוניים נשאר שלם במשך יותר מ 42 ימים, ומשך זה אפשר משטרי טיפול ארוכי טווח.
ממצאים קודמים מראים כי ממתק לסירוגין פועם לתוך CSF יש יעילות טובה יותר נגד LMD מאשר תהליך אספקת תרופות ממושך על ידי עירוי13. זה יהיה בלתי אפשרי לבצע זריקות חד-מנה חוזרות ונשנות באמצעות מערכת המשאבה האוסמוטית. אין דרך קלה לשטוף את הנוזל הלכוד הנותר לאחר כל זריקה. המשאבה האוסמוטית מוגבלת גם לאספקת תערובות של תרופות תואמות או בודדות ובדרך כלל דורשת כמויות גבוהות יותר של הכנת תרופות לעירוי מתמשך. לעומת זאת, מורין Ommaya מיועד מיקרו זריקות מדויקות ככל 3 עד 7 μL, ללא צורך להסביר שטח מת, ואין הגבלה על סוג התרופות חוקרים יכולים להשתמש, כולל טיפול בתאי החיסון. מורין אומאיה גם ממזערת את פסולת ריאגנט אם מדגם מסוים הוא יקר וממקסם את השימוש במשאב זה. עבור כל משטר טיפול הדורש מינונים מרובים של טיפולים נגד סרטן, מורין Ommaya קל לשימוש, ויש סיכון מינימלי של זיהום או חוסר מזל כירורגי, עם הגישות החלופיות של גישה חוזרת ונשנית CSF בניתוח או באמצעות משלוח חוזר עם מחט. Murine Ommaya מספק לחוקרים את הגמישות להתאים את ריכוזי התרופות ותדרי מינה ולהעריך אפנון היעד ומשך המחקר על פי מחקר של עניין.
מגבלה של מורין Ommaya היא כי החוקרים עשויים להתקשות להשתיל את המכשיר בעכברים קטנים יותר. לפיכך, עדיף להשתמש בעכברים שהם לפחות 8 עד 10 שבועות של גיל. זה אפשרי עבור מורין Ommaya לרדת במהלך הניסוי הטיפולי אם המכשיר אינו מאובטח לגולגולת במהלך שלבי ההשתלה והדבק מתפוגג, או אם העכברים התעסקו עם זה באופן שוחק. התרחיש האחרון מתרחש בתדירות גבוהה יותר כאשר עכברים מרובים שוכנו באותו כלוב. לפיכך, מומלץ לאכלס לא יותר משני עכברים מושתלים מורין Ommaya לכלוב למשך לוח הזמנים של הטיפול. פרוטוקול זה שונה כדי להחיל דבק סטרילי ציאנואקרילט על המרווח, אשר נמצאה כדבק היעיל ביותר לדבקות המרווח על פני הגולגולת ומניעת לרדת מורין אומאיה. התוצאות הראו כי עכברי LMD נהנו מטיפול תוך-תרופתי ישיר באמצעות מורין אומאיה, עם הישרדות כללית מוגברת. נפחי microliter יחיד יכול להינתן בבטחה, לעקוף את BBB, ובכך להפחית את כמות הכנת התרופה. והכי חשוב, העכברים שנרפאו גרורות מערכת ן ממחקר האימונותרפיה של נוגדני Her2 נותרו בריאים.
שיתוף פעולה עם יצרן שמטרתו לפתח גרסה תואמת MRI של מורין אומאיה לדגם ה-PDX של LMD. מכיוון שלגרסת אב טיפוס זו משולב מרווח, אין צורך בהרכבה, המאפשרת דבקות טובה יותר בגולגולת. מגבלה של אב טיפוס זה היא שלמרות שההתקן תואם MRI, הוא יוצר צל שבו המכשיר מוכנס, מה שמקטין את הנראות של התמונה עבור ניתוחי כימות. הגרסה תואמת ה-MRI היא כלי חלופי טוב כאשר דגימת CTC ex vivo היא גורם מגביל, ותאי קדם-תווית אינם אפשריים. השילוב של מודל קסנוגרפט LMD וטכניקת מורין אומאיה מועיל לחקר יעילות התרופה המיועדת הישירה תוך עקיפת ה- BBB. התוצאות של מחקרים אלה ב- vivo רלוונטיות קלינית לעיצוב אסטרטגיות טיפוליות רציונליות עבור חולים עם LMD.
Disclosures
פיטר פורסייט מכהן בוועדות המייעצות של Abvie Inc. , באייר, בריסטול מאיירס סקוויב, BTG, אינוביו, נובור, טוקאגן וזיופארם, מחוץ לעבודה שהוגשה. לכל הסופרים האחרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למישל ל. דניאלסון, טרישה פייבורס-ווטסון, ולשאר צוות הרפואה ההשוואתית באוניברסיטת דרום פלורידה על התמיכה הטכנית שלהם ושמירה על בעלי החיים שלנו. אנו מודים למעבדות אינסטק בע"מ על המאמץ לעבוד איתנו על סמך בקשתנו לפתח מורין אומאיה תואמת MRI. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R21 CA216756 (ל K.S.M. סמולאי), משרד ההגנה (DOD) W81XWH1910675 (ל B. Czerniecki ו P. Kalinski), ואת מרכז מופיט לסרטן CBMM פרסים חדשניים (ל P. פורסייט ו ד ד דקט). עזרת העורכים ניתנה על ידי המשרד לכתיבה מדעית של מרכז מופיט לסרטן על ידי ד"ר פול פלטשר ודיילי דרוקר. לא ניתן פיצוי מעבר למשכורותיהם הרגילות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C.
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), Suppl 2 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al.
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
