Summary
यहां, हम एक मुरीन ज़ेनोबेड़ा मॉडल का वर्णन करते हैं जो कार्यात्मक रूप से रोगियों में ओमाया जलाशय जैसा दिखता है। हमने सार्वभौमिक घातक लेप्टोमीनिंगियल बीमारी के लिए उपन्यास चिकित्सा विज्ञान का अध्ययन करने के लिए मुरीन ओमाया विकसित किया।
Abstract
लेप्टोमेनिंगियल रोग (एलएमडी) सेरेब्रल स्पाइनल फ्लूइड (सीएसएफ) के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) मेटास्टेसिस का एक असामान्य प्रकार है। सबसे आम कैंसर है कि LMD कारण स्तन और फेफड़ों के कैंसर और मेलानोमा हैं । एलएमडी के साथ निदान रोगियों को एक बहुत ही गरीब पूर्वानुमान है और आम तौर पर केवल कुछ हफ्तों या महीनों के लिए जीवित रहते हैं । एलएमडी के खिलाफ प्रणालीगत चिकित्सा की प्रभावकारिता की कमी का एक संभावित कारण सीएसएफ में दवा की चिकित्सीय प्रभावी सांद्रता प्राप्त करने में विफलता है क्योंकि एक अक्षुण्ण और अपेक्षाकृत अभेद्य रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) या कोरॉइड प्लेक्सस में रक्त-सीएसएफ बाधा है। इसलिए, सीधे दवाओं को इंट्राथेकैलाई या इंट्रावेंट्रिकुलर रूप से प्रशासित करने से इन बाधाओं को दूर किया जा सकता है। इस समूह ने एक मॉडल विकसित किया है जो लंबे समय से चिकित्सीय (यानी, ड्रग्स, एंटीबॉडी और सेलुलर चिकित्सा) के प्रभावी वितरण और सीएसएफ में दवा सांद्रता और लक्ष्य मॉड्यूलेशन निर्धारित करने के लिए सीएसएफ के बार-बार नमूने की अनुमति देता है (जब चूहों में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को लक्षित किया जाता है)। मॉडल एक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग-संगत ओमाया जलाशय के मुरीन समकक्ष है, जिसका उपयोग चिकित्सकीय रूप से किया जाता है। इस मॉडल, जो खोपड़ी से चिपका है, "Murine Ommaya के रूप में नामित किया गया है." अवधारणा के एक चिकित्सीय सबूत के रूप में, मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 एंटीबॉडी (क्लोन 7.16.4) को मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2-पॉजिटिव स्तन कैंसर से एलएमडी के साथ चूहों का इलाज करने के लिए मुरीन ओमाया के माध्यम से सीएसएफ में वितरित किया गया था। मुरीन ओमाया एक लघु पहुंच बंदरगाह का उपयोग करके दवा वितरण की दक्षता बढ़ाता है और अतिरिक्त दवा की बर्बादी को रोकता है; यह आणविक और प्रतिरक्षा अध्ययनों के लिए सीएसएफ नमूने में हस्तक्षेप नहीं करता है। मुरीन ओमाया एलएमडी के प्रायोगिक मॉडलों में उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के परीक्षण के लिए उपयोगी है।
Introduction
लेप्टोमेनिंगियल रोग (एलएमडी) सीएनएस का एक आक्रामक देर चरण मेटास्टेसिस है, जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं सीएसएफ तक पहुंचती हैं और मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी1की सतह में घुसपैठ करती हैं। एलएमडी का कारण यानी सबसे आम कैंसर में स्तन और फेफड़े के साथ - साथ मेलानोमा2भी शामिल है . एलएमडी के परिणामस्वरूप कई न्यूरोलॉजिक लक्षण और लक्षण जैसे सिरदर्द, कपाल तंत्रिका दोस्तों, कड़ी गर्दन और रेडियोकुलोपैथी। एलएमडी रोगियों का पूर्वानुमान आम तौर पर बहुत खराब होता है (सप्ताह में औसत अस्तित्व मापा जाता है) और यह सार्वभौमिक रूप से घातक है3,4,5,6,7. सर्जरी, विकिरण, और प्रणालीगत कीमोथेरेपी के साथ उपचार प्रशामक है। एलएमडी के लिए प्रणालीगत चिकित्सा एक अक्षुण्ण बीबीबी या रक्त-सीएसएफ बाधा में सीएसएफ में अपर्याप्त दवा प्रवेश के कारण विफल हो सकती है कोरॉइड प्लेक्सस1में।
इसलिए, कैंसर चिकित्सा विज्ञान (जैसे, चेकपॉइंट अवरोधकों और सेलुलर चिकित्सा सहित दवाओं और एंटीबॉडी आधारित उपचार) को सीधे सीएसएफ में प्रशासित करना इस सीमा8को दूर कर सकता है। रोगियों से सीएसएफ तक पहुंचना और नमूना करना एक ओमाया जलाशय के माध्यम से संभव है जो खोपड़ी के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है। यह डिवाइस कैंसर एजेंटों (जैसे, मेथोट्रेक्सेट और ट्रास्टुज़ुमाब) के साथ-साथ नैदानिक अध्ययनों के लिए सीएसएफ के नमूने (उदाहरण के लिए, उपचार के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए निगरानी करने के लिए एलएमडी का साइटोलॉजिकल निदान) के प्रशासन के लिए रीढ़ की हड्डी का नल निष्पादित किए बिना अनुमति देता है। एक मुरीन ओमाया जलाशय चिकित्सकीय रूप से इस्तेमाल किए गए लोगों की नकल करने के लिए डिजाइन किया गया था। जलाशय के लिए एक पहुंच बंदरगाह और स्पेसर भागों की असेंबली और माउस कैनुलेशन तकनीक का संशोधन आवश्यक है, जो डिवाइस को दवा अध्ययन की अवधि में स्थायी रूप से बरकरार रहने की अनुमति देता है। इस डिवाइस को "मुरीन ओमाया" के रूप में नामित किया गया है।
ऑस्मोटिक जलसेक पंप तकनीक के विपरीत, जिसके लिए ट्यूबिंग में खाली जगह को प्रीफिल करने के लिए अतिरिक्त तरल मात्रा की तैयारी की आवश्यकता होती है और लगातार इंजेक्शन9पर निरंतर जलसेक, मुरीन ओमाया दवा समाधानों की बर्बादी को कम करता है। यह एक हैमिल्टन सिरिंज, एक लघु पहुंच बंदरगाह, और एक स्वचालित इंजेक्टर का उपयोग कर CSF में कम मात्रा (3-7 μL) में किसी भी समय उपचार की कई एकल खुराक के प्रभावी प्रशासन की अनुमति देता है । वास्तविक समय में, एलएमडी के खिलाफ परीक्षण दवाओं की प्रभावकारिता इमेजिंग द्वारा निर्धारित की जा सकती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, विभिन्न प्रकार की कीमोथेरियों, एंटीबॉडी और सेल इम्यूनोथेरपी (एकल या संयुक्त एजेंटों के रूप में) का परीक्षण एलएमडी के खिलाफ एलएमडी के खिलाफ परीक्षण किया जा सकता है ताकि वीवो निष्कर्षों में रोगियों के लिए तर्कसंगत उपचार रणनीतियों में अनुवाद किया जा सके। एलएमडी के रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा (पीडीएक्स) मॉडल के लिए इमेजिंग क्षमता में और सुधार करने के लिए, मुरीन ओमाया के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) संगत संस्करण विकसित करने के लिए एक निर्माता के साथ सहयोग किया गया था, जिसके लिए कोई असेंबली की आवश्यकता नहीं है और उपयोग करने के लिए तैयार है। एमआरआई क्षमता फायदेमंद है, विशेष रूप से पीडीएक्स मॉडल के लिए जिसमें सीएसएफ से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) की मात्रा कभी-कभी सीमित कारक होती है, और अक्सर जब प्रीलेबलिंग सीटीसी अव्यवहार्य होती है।
यह पेपर एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो चूहों को एलएमडी के साथ प्रस्तुत करने के लिए सीटीसी के इंजेक्शन से शुरू होता है। मुरीन ओमाया तो शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित किया जाता है, और मुरीन Ommaya के माध्यम से कई दवा उपचार कदम किया जाता है । प्रदर्शन के लिए अवधारणा के सबूत के रूप में, वीवो साइड-बाय-साइड तुलना की गई थी, जिसमें मुरीन मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (Her2) एंटीबॉडी जिसे क्लोन 7.16.4 (trastuzumab के मानव समकक्ष) कहा जाता था10दिया गया था। एंटीबॉडी Her2+ स्तन कैंसर कोशिकाओं को या तो मुरीन ओमाया (प्रत्यक्ष लक्षित या इंट्राथेकल थेरेपी) या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (प्रणालीगत चिकित्सा) के माध्यम से लक्षित करता है। परिणामों से पता चला है कि एलएमडी के साथ चूहों कि प्रत्यक्ष इंट्राथेकल इम्यूनोथेरेपी प्राप्त एक ही चिकित्सा प्रणालीबद्ध के साथ इलाज उन लोगों की तुलना में काफी लंबे समय तक रहते थे । मुरीन ओमाया के माध्यम से इलाज चूहों में सीएनएस मेटास्टेस लगभग पूरी तरह से उपचार के तीसरे सप्ताह की तीसरी खुराक से पीछे हट गए थे, जिसके परिणामस्वरूप समग्र अस्तित्व में सुधार हुआ ।
Protocol
इस प्रोटोकॉल को यूनिवर्सिटी ऑफ साउथ फ्लोरिडा इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएस00005974) ने मंजूरी दी थी ।
1. सीआइएसएफ में सीटीसी का इंजेक्शन माउस एलएमडी मॉडल उत्पन्न करने के लिए
- सीटीसी की तैयारी
- इंजेक्शन के लिए आवश्यक सीटीसी की संख्या की गणना करें, और बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 1.0 ×10 4 कोशिकाओं/μL पर एक एकल कोशिका निलंबन तैयार करें। प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन रखें।
नोट: सेल लाइनों का उपयोग करते समय जिन्हें ट्राइपसिनाइजेशन की आवश्यकता होती है, ट्रिप्पसिन को हटाने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोना सुनिश्चित करें। हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल काउंट करें। यदि एक बड़ी पलटन (>50 चूहों) का उपयोग किया जाता है, तो कोशिकाओं को फिर से याद करें और इंजेक्शन के बीच कोशिका व्यवहार्यता को मान्य करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाओं की लगातार संख्या माउस प्रति प्रशासित की जाती है।
- इंजेक्शन के लिए आवश्यक सीटीसी की संख्या की गणना करें, और बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 1.0 ×10 4 कोशिकाओं/μL पर एक एकल कोशिका निलंबन तैयार करें। प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन रखें।
- प्रेग्नेंसी प्रक्रिया
- माउस को 1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन निरंतर रिलीज (Bup-SR) के साथ चमड़े के इंजेक्शन ।
नोट: प्रस्तावित चीरा के क्षेत्र सुई मत करो; स्कैपुला से अच्छी तरह से दूर एक इंजेक्शन साइट चुनें। - माउस को 2-3% आइसोफ्लुन के साथ एनेस्थेटाइज करें जब तक कि यह राइटिंग पलटा के कोई संकेत नहीं दिखाता है। इसके अलावा, संज्ञाहरण की स्थिति की पुष्टि करने के लिए पूंछ और/या पंजा चुटकी पलटा के लिए जांच करें ।
- ऑपरेटिंग क्षेत्र से दूर एक स्थान में सर्जरी के लिए माउस तैयार करें। चीरा साइट को दूषित करने से फर रखने के लिए पर्याप्त सीमा क्षेत्र के साथ शल्य चिकित्सा साइट (यानी, खोपड़ी की पृष्ठीय सतह) क्लिप; फिर, साइट के केंद्र से परिधि तक काम करते हुए, रोगाणुरोधी त्वचा एंटीसेप्टिक के साथ साइट को संतृप्त करें, और फिर सूखने दें। सर्जिकल साइट को दूषित होने से बचाने के लिए या तो बाँझ कपड़ा या बाँझ चिपकने वाली प्लास्टिक ड्रेप सामग्री लागू करें।
नोट: उपकरणों को पहले से ऑटोक्लेव किया जाना है और एक ग्लास मनका स्टरलाइजर का उपयोग करके जानवरों के बीच फिर से निष्फल युक्तियां हैं। - सिर की पूरी वेंट्रल सतह के फर को शेव करें, और बाँझ तकनीक का उपयोग करके त्वचा तैयार करें।
- स्टीरियोटैक्टिक तंत्र के एक संशोधित एल के आकार की नाक शंकु के साथ नाक को स्थित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि नार्स स्पष्ट और खुले रहें। दोनों pinnae के वेंट्रल सतहों भर में टेप का उपयोग करना, धीरे से त्वचा को आगे खींचने के लिए यह नाक शंकु को सुरक्षित है, और एक बार सुरक्षित लगभग ९० डिग्री कोण पर गर्दन मोड़ । संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए 1.5% आइसोफ्लुना को प्रशासित करें।
नोट: उचित स्थिति चीरा क्षेत्र में परिणाम होगा एक तरह से प्रस्तुत किया जा रहा है कि ऑक्सीपिटल हड्डी के कौडल रिज की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है । - यह सुनिश्चित करने के लिए शरीर की स्थिति को सिस्टर्ना मैग्ना के साथ स्तर पर रखा जाता है, और पूंछ पर मामूली कर्षण लागू करते समय, सुरक्षित करने के लिए पूंछ के आधार पर टेप रखें।
- माउस को 1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन निरंतर रिलीज (Bup-SR) के साथ चमड़े के इंजेक्शन ।
- सर्जिकल सिस्टर्ना मैग्ना इंजेक्शन
- पूर्ण विस्तार में गर्दन के साथ, और सिर्फ पिनाने के बीच शुरुआत, ऑक्सीपिटल हड्डी में मामूली दबाव के साथ नीचे की ओर सर्जिकल कैंची युक्तियों को चलाएं।
नोट: जबकि इस मिडलाइन स्थिति में, एक छोटा सा अवसाद ध्यान देने योग्य है जब कैंची युक्तियां सिस्टर्ना मैग्ना पर अवतल क्षेत्र में डुबकी लगाते हैं। - एक छोटे से 3-5 मिमी मिडलाइन चीरा बस palpated concavity के ऊपर बनाओ। 1.0 × 104 कोशिकाओं/μL (कुल 5.0 × 10 4 कोशिकाओं) पर सेल निलंबन के5 μL ड्रा एक 30 जी हैमिल्टन सिरिंज में।
- सिस्टर्ना मैग्ना पर धीरे-धीरे दबाने के लिए 1-2 मिमी युक्तियों के साथ कुंद-इत्तला दी संदंश का उपयोग करें। एक बंद स्थिति में सुझाव ों का परिचय और ड्यूरा पर नीचे दबाव लागू करते हुए उन्हें खोलने के लिए।
- पिछले चरण में वर्णित कुंद विच्छेदन दोहराएं जब तक कि ड्यूरल झिल्ली की आसानी से पहचान नहीं हो जाती है, और संबंधित रक्त वाहिकाएं उजागर क्षेत्र में दिखाई देती हैं।
नोट: जिसके परिणामस्वरूप इंजेक्शन खिड़की सुनिश्चित करता है रक्त वाहिकाओं सुई प्रविष्टि के दौरान अक्षतिग्रस्त हैं । - आसपास की मांसपेशी को वापस लेने के लिए संदंश को खुला रखते हुए, बेवेल की कल्पना करने के लिए ड्यूरा के नीचे 30 ग्राम गैर-स्कोरिंग सुई पेश करें। सुनिश्चित करें कि सुई केवल बेवेल से परे ही पेश की गई है। धीरे-धीरे एक सिरिंज प्लंजर तैनात करें, और ड्यूरा के ठीक नीचे कोशिकाओं को वितरित करें।
- ड्यूरा के नीचे इंजेक्शन का निरीक्षण करने के लिए बेवेल को ठीक से रखें। तकनीक को सावधानीपूर्वक प्रशासित करें, और झिल्ली को नुकसान को रोकने और न्यूनतम रिसाव सुनिश्चित करने के लिए 30 जी गैर-स्कोरिंग सुई का उपयोग करें। यदि रिसाव नोट किया जाता है, तो कपास-इत्तला वाले एप्लिकेटर के साथ कोमल दबाव लागू करें।
- त्वचा चिपकने वाली घाव क्लिप या माइक्रो-ड्रॉप लगाने से त्वचा को बंद कर दें। एक बार इंजेक्शन सफलतापूर्वक किया जाता है, चूहों को गर्म कंबल पर संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति दें, उन्हें लगातार देख सकें जब तक कि वे स्टर्नल स्थिति बनाए रख सकें और उद्देश्यपूर्ण आंदोलन प्रदर्शित न कर सकें।
- पहले सप्ताह के लिए सर्जरी के बाद दैनिक चूहों की निगरानी करें। यदि कोई माउस दर्द या संकट में दिखाई देता है, तो पशु चिकित्सा परामर्श और निर्देश के आधार पर 5 दिनों तक हर 12 से 24 घंटे में एक बार कारप्रोफेन के 10 मिलीग्राम/किलोग्राम चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ इसका इलाज करें । चूहों को अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले कम से कम 48 से 72 घंटे तक ठीक होने और उनकी निगरानी करने की अनुमति दें।
नोट: Bup-SR, पहले से ही दिया, ७२ घंटे तक पिछले जाएगा, तो अतिरिक्त एनाल्जेसिक आम तौर पर आवश्यक नहीं हैं । हालांकि, जानवरों को आवश्यक के रूप में अतिरिक्त एनाल्जेसिक प्रदान किया जाएगा (यदि सुस्त, खाने नहीं, झालरदार)। यदि एक शल्य चिकित्सा साइट पश्चात संक्रमण (यानी, लालिमा, सूजन, कोमलता, एलोडिनिया, हाइपरएलजेसिया, हाइपरपैथिया, या सुपौण) के लक्षण विकसित करती है, या यदि माउस प्रभावित क्षेत्र की रक्षा कर रहा है, तो माउस को इच्छामृत्यु दें। यदि कैंसर कोशिकाओं को सफलतापूर्वक सीएसएफ में इंजेक्ट किया जाता है, तो एलएमडी और ट्यूमर प्रगति सीएनएस में 1 या 2 सप्ताह के भीतर विकसित होगी (सीटीसी या सेल लाइन के प्रकारों के आधार पर)(चित्रा 1)।
- पूर्ण विस्तार में गर्दन के साथ, और सिर्फ पिनाने के बीच शुरुआत, ऑक्सीपिटल हड्डी में मामूली दबाव के साथ नीचे की ओर सर्जिकल कैंची युक्तियों को चलाएं।
2. मुरीन ओमाया विधानसभा और प्रत्यारोपण
- स्टेशन की तैयारी
- स्टेशन की सतह को कीटाणुरहित करें। सतह पर एक नीला आवरण रखें, और चित्रा 2में इंगित सभी निष्फल उपकरण और आपूर्ति तैयार रखें।
- प्रेग्नेंसी प्रक्रिया
- एनाल्जेसिया (Bup-SR) लागू करें, और धारा 1.2 में वर्णित बाँझ तकनीक को बनाए रखें।
- मुरीन ओमाया का सर्जिकल प्रत्यारोपण
- 25 जी (0.51 मिमी बाहरी व्यास) लघु इंजेक्शन बंदरगाह और 1 मिमी स्पेसर डिस्क का उपयोग करके मुरीन ओमाया इंजेक्शन डिवाइस को इकट्ठा करें। सही सेरेब्रल गोलार्द्ध(चित्रा 3ए-सी)में धातु कैनुला के लगभग 2.5 मिमी की पैठ सुनिश्चित करने के लिए एक साइनोक्रिलेट बाँझ चिपकने वाला का उपयोग करें।
नोट: इस प्रयोगशाला में एक एमआरआई-संगत माउस ओमाया प्रोटोटाइप विकसित किया गया था, जिसमें पहले से ही दोनों भाग (लघु इंजेक्शन बंदरगाह और स्पेसर) 3डी-मुद्रित एक इकाई(चित्रा 3 डी)के रूप में एक साथ मुद्रित किया गया था। एकल इकाई संस्करण एमआरआई द्वारा परीक्षण किया गया था और विधानसभा कदम को नष्ट करने से समय बचा सकता है । - माउस को 2-3% आइसोफ्लुन के साथ एनेस्थेटाइज करें जब तक कि राइटिंग रिफ्लेक्स के कोई संकेत न हों। इसके अलावा, संज्ञाहरण की स्थिति की पुष्टि करने के लिए पूंछ और/या पंजा चुटकी पलटा के लिए जांच करें ।
- फर के सिर की पूरी वेंट्रल सतह को शेव करें, और बाँझ तकनीक के अनुसार त्वचा तैयार करें, जैसा कि पहले चरण 1.2.3 में वर्णित है। प्रक्रिया के दौरान आइसोफ्लुरेन प्रशासन जारी रखने के लिए नाक शंकु के साथ स्टीरियोटाटिक उपकरण में माउस रखें; आइसोफ्लुरेन को घटाकर 1.5% कर दिया गया है। सिर को सुरक्षित करने के लिए कान की सलाखों को धीरे से कस लें, और माउस की आंखों को कवर करने के लिए आंख स्नेहक लागू करें।
- एक छोटी त्वचा चीरा (3 मिमी), खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए अंतर्निहित चमड़े के नीचे ऊतकों के कुंद विच्छेदन के बाद बनाओ। हाइड्रोजन पेरोक्साइड से लथपथ कपास से लथपथ एप्लिकेटर चिपक जाती है का उपयोग कर खोपड़ी सूखी।
- खोपड़ी में एक बर्र छेद ड्रिल 0.5 मिमी पीछे और ब्रेग्मा के 1.1 मिमी पार्श्व - खोपड़ी पर शारीरिक बिंदु जहां कोरोनल सीवन को धनु सीवन(चित्रा 3 ए)द्वारा लंबवत रूप से काट दिया जाता है - साथ ही ड्यूरा मेटर को बेनकाब करने के लिए 0.9 मिमी बर्र होल। माइक्रोड्रिल को एक तरफ ले जाएं, और धीरे-धीरे एक इंजेक्शन पोर्ट (लगभग 2.5 मिमी की गहराई) डालने से पहले बर्र छेद के आसपास की हड्डी को स्कोर करें, जो एक साइनोक्रेलेट बाँझ चिपकने वाला का उपयोग करके खोपड़ी से चिपका हुआ है। इंजेक्शन स्पॉट के चारों ओर राज्य सीवन एक बाधित सिलाई पैटर्न या पर्स स्ट्रिंग सीवन11में 4-0 नो-अवशोषण नायलॉन टांके का उपयोग कर रहा है।
- सर्जरी वसूली के लिए व्यक्तिगत पिंजरों में हाउस के बाद सर्जरी चूहों ।
नोट: यह संभव है कि मुरीन Ommaya बंद आ सकता है जब कई सर्जरी बरामद चूहों एक ही पिंजरे में रखे हैं, संभवतः लगातार छेड़छाड़ बातचीत के कारण । यह सिफारिश की जाती है कि दवा प्रभावकारिता परीक्षण के दौरान मुरीन ओमाया-प्रत्यारोपित चूहों को व्यक्तिगत रूप से रखा जाता है (या प्रति पिंजरे 2 चूहों से अधिक नहीं)।
- 25 जी (0.51 मिमी बाहरी व्यास) लघु इंजेक्शन बंदरगाह और 1 मिमी स्पेसर डिस्क का उपयोग करके मुरीन ओमाया इंजेक्शन डिवाइस को इकट्ठा करें। सही सेरेब्रल गोलार्द्ध(चित्रा 3ए-सी)में धातु कैनुला के लगभग 2.5 मिमी की पैठ सुनिश्चित करने के लिए एक साइनोक्रिलेट बाँझ चिपकने वाला का उपयोग करें।
3. मुरीन ओमाया उपचार
- मुरीन ओमाया का उपयोग कर चूहों डोजिंग
- माउस को 2-3% आइसोफ्लुनान के साथ एनेस्थेटाइज करें, जब तक कि राइटिंग रिफ्लेक्स के कोई संकेत न हों। इसके अलावा, संज्ञाहरण के रखरखाव की पुष्टि करने के लिए पूंछ और/या पंजा चुटकी पलटा के लिए जांच करें ।
- एक बंदरगाह इंजेक्शन एडाप्टर और एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर मुरीन Ommaya का उपयोग करें । संदंश का उपयोग करना, लघु इंजेक्शन बंदरगाह के शीर्ष पकड़ो और धीरे बंदरगाह इंजेक्टर एडाप्टर पूरी तरह से बंदरगाह के पट में डालें ।
नोट: बंदरगाह इंजेक्टर बंदरगाह के पट को इस तरीके से छेदता है जो मृत स्थान को न्यूनतम तक कम कर देता है और मोटराइज्ड सिरिंज पंप(चित्रा 4A)के माध्यम से नियंत्रित इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है। लक्षित/उपन्यास उपचार संज्ञाहरण के तहत 1 μL/मिनट की प्रवाह दर पर इंजेक्ट किए जाते हैं । शोधकर्ता के विवेक के अनुसार, उपचार एक निर्धारित अवधि (सप्ताह/महीने) के लिए निर्दिष्ट अंतराल (दैनिक/साप्ताहिक) पर दिया जाना है ।
3 और 7 माइक्रोन के बीच की मात्रा इष्टतम है, क्योंकि 3 माइक्रोन < मात्रा अविश्वसनीय है, और 7 माइक्रोन > मात्रा बहुत अधिक दबाव पैदा कर सकती है। हैमिल्टन सिरिंज का आकार प्रत्येक उपचार बांह में चूहों की संख्या के आधार पर 10 से 100 माइक्रोन तक हो सकता है। हैमिल्टन सिरिंज में उचित मात्रा को प्रीलोड करने से सिरिंज के बार-बार प्रतिस्थापन को रोका जा सकेगा, जिससे त्रुटियों को कम किया जा सकेगा । उपचार बांह के अनुसार 1 हैमिल्टन सिरिंज समर्पित करना सबसे अच्छा है। - एक बार इंजेक्शन बनाने के बाद, संदंश का उपयोग करके बंदरगाह इंजेक्शन एडाप्टर से मुरीन ओमाया को अलग कर दें, और माउस को संज्ञाहरण से उबरने के लिए पिंजरे में वापस करें, जैसा कि कदम 1.3.7 में ऊपर वर्णित है।
- इच्छामृत्यु
- एक संकुचित टैंक स्रोत से कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)के साँस लेने से चूहों को इच्छामृत्यु। परेशानी या परेशानी से बचने या कम करने के लिए सीओ2 (यानी, चैंबर वॉल्यूम/मिन के 10% से 30% तक विस्थापन दर का उपयोग करने के लिए चूहों को बेनकाब करें। हृदय और श्वसन आंदोलनों की समाप्ति के आश्वासन तक चूहों की निगरानी करें।
Representative Results
चूहों में, सीएसएफ की कुल मात्रा लगभग 35-40 माइक्रोन है और लगभग 350 एन एल/न्यूनतम की दर से उत्पादित की जाती है; यह 12-13 बार एक दिन12से अधिक बदल जाता है . इंजेक्शन के मार्ग की कल्पना करने के उद्देश्य से, 2% इवांस ब्लू को मुरीन ओमाया मॉडल के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था, जिसके बाद विश्लेषण के लिए दिमाग की कटाई से पहले 15 मिनट और 30 मिनट को बीतने की अनुमति दी गई थी। डाई ने सफलतापूर्वक 15 मिनट में वेंट्रिकल्स और मस्तिष्क में घुसपैठ की । 30 मिनट के भीतर, डाई रीढ़ की हड्डी(चित्र 4)पर दिखाई दे रही थी।
अवधारणा के एक सबूत के रूप में, BALB/c चूहों एक लूसिफ़ेरेस लेबल Her2+ TUBO स्तन कैंसर सेल लाइन intracisternally के साथ इंजेक्शन थे, और Murine Ommayas प्रत्यारोपित किया गया । कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन के लगभग 1 सप्ताह बाद, चूहों ने एलएमडी विकसित करना शुरू किया। इन चूहों का इलाज सप्ताह में एक बार हर् 2-एंटीबॉडी इम्यूनोथेरेपी के साथ 4 सप्ताह तक किया गया था, या तो इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से प्रणालीगत चिकित्सा के माध्यम से या मुरीन ओमाया(चित्रा 5A)के माध्यम से इंट्राथेकैली के माध्यम से।
हालांकि अनुपचारित चूहों 19 दिन से मर गया, सभी चूहों कि Murine Ommaya के माध्यम से इंट्राथेकल चिकित्सा प्राप्त बच(पी = ०.००४) । 4 सप्ताह तक, ट्यूमर का एक पूर्ण प्रतिगमन देखा गया था। प्रणालीगत चिकित्सा के साथ इलाज चूहों की तुलना में, जो LMD के इलाज में मध्यम सफलता थी, चूहों कि इंट्राथेकल थेरेपी प्राप्त एक बहुत लंबे समय तक समग्र अस्तित्व(चित्रा 5B)था ।
चित्रा 1:लेप्टोमेनेनेरियल रोग और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मेटास्टेस का अध्ययन करने के लिए एक मुरीन ज़ेनोग्रेफ्ट मॉडल में सिस्टर्ना मैग्ना में ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचारी का इंजेक्शन। (ए)एक उदाहरण जिसमें सिस्टर्ना मैग्ना और सीएसएफ एक्सेसिंग साइट का स्थान दिखाया गया है, जिसमें सीटीसी को हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके इंजेक्ट किया जाता है। (ख)चूहों की एक प्रतिनिधि आईवीआईएस छवि जिसने ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचारी के साथ इंजेक्शन के 2 सप्ताह के बाद लेप्टोमीनिंगियल रोग और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मेटास्टेस (मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के साथ) विकसित किया था। कोशिकाओं को एक लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर जीन के साथ लेबल किया गया था । खारा के साथ इंजेक्शन जानवरों को नियंत्रित ट्यूमर (एन = 3) विकसित नहीं किया था, और प्रयोग त्रिपाल में किया गया था। संक्षिप्त रूप: CTCs = परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं; आईविस = वीवो इमेजिंग सिस्टम में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:चूहों में मुरीन ओमाया प्रत्यारोपण प्रदर्शन के लिए एक वर्कस्टेशन सेटअप का एक उदाहरण। (1) गैस एनेस्थीसिया मशीन/वाष्पीकरण । (2) बाँझ नीले कागज एक स्टीरियोटैक्सिक स्टैंड को कवर कपड़ा । (3) स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस (स्टैंड/स्टेज, कान की सलाखों, नाक शंकु) । (4) माइक्रोड्रिल। (5) प्रकाश के साथ आवर्धक ग्लास। (6) बाँझ नमकीन कुल्ला कंटेनर के साथ बाँझ कपास टेप एप्लिकेटर चिपक जाती है । (7) हाइड्रोजन पेरोक्साइड। (8) मनका स्टरलाइजर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:मुरीन ओमाया डिवाइस का प्रत्यारोपण। (क)खोपड़ी पर ब्रेग्मा के स्थान पर इशारा करते हुए एक तीर के साथ एक उदाहरण, और अनुमानित दूरी जिस पर एक बर्र छेद खोपड़ी में ड्रिल किया जाता है (०.५ मिमी पीछे/१.१ मिमी पार्श्व) एक माइक्रोड्रिल का उपयोग कर ब्रेग्मा से । (ख)एक मुरीन ओमाया को खोपड़ी में गोंद लगाव के आधार के रूप में एक धातु कैनुला और एक 1 मिमी स्पेसर के संयोजन से इकट्ठा किया जाता है । (ग)चूहों की प्रतिनिधि छवियां जिनमें मुरीन ओमायेस प्रत्यारोपित किए गए थे; इन चूहों को यह सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जाती है कि वे किसी भी इंजेक्शन प्राप्त करने से पहले उज्ज्वल, सतर्क और प्रतिक्रियाशील हैं। (घ)प्रोटोटाइप चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग-संगत मुरीन ओमाया और प्रतिनिधि मस्तिष्क चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग छवियों का एक उदाहरण मुरीन ओमाया प्रत्यारोपण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4:मुरीन ओमाया का उपयोग करके इंट्रावेंट्रिकुलर (केंद्रीय तंत्रिका तंत्र) इंजेक्शन। (ए)एक इंजेक्शन की एक छवि, मुरीन ओममाया के माध्यम से वेंट्रिकल और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र तक पहुंचने। इंजेक्शन के दौरान चूहे संज्ञाहरण के नीचे रहते हैं। उदाहरण में, मुरीन ओमाया लघु बंदरगाह से जुड़ा हुआ है जो एक प्रीफिल्ड हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ा हुआ है। इंजेक्शन 1 μL/मिनट की जलसेक दर और 5-7 μL की मात्रा पर एक स्वचालित इंजेक्शन सेट का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं । इवांस ब्लू के साथ इंजेक्ट किए गए माउस ब्रेन की एक छवि दिखाई गई है । सर्कल से पता चलता है कि मुरीन ओमाया कहां अटैच था । मस्तिष्क के बाहरी हिस्से पर डाई का रिसाव नहीं देखा गया। मस्तिष्क का एक क्रॉस सेक्शन दिखाता है कि पार्श्व वेंट्रिकल्स डाई से भरे हुए थे; डाई मस्तिष्क परेन्चिमा में प्रवेश नहीं करती थी। (ख)इवांस ब्लू डाई के इंजेक्शन के बाद 15 और 30 मिनट के बाद माउस दिमाग की छवियां । डाई मस्तिष्क (15 मिनट) में घुसपैठ की और रीढ़ की हड्डी (30 मिनट) पर प्रसारित करने के लिए शुरू किया । 5 चूहों में से, 4 दृश्य के लिए डाई प्राप्त किया, और 1 नियंत्रण के रूप में कार्य किया । यह प्रयोग ट्रिपलीकेट में दोहराया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5:मुरीन ओमाया का उपयोग कर प्रत्यक्ष लक्षित इम्यूनोथेरेपी स्तन कैंसर से जुड़े लेप्टोमीनिंगियल रोग चूहों के समग्र अस्तित्व को बढ़ाता है । (A)BALB/c चूहों लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर लेबल मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2-पॉजिटिव TUBO कोशिकाओं, एक murine स्तन कैंसर सेल लाइन के साथ इंजेक्शन थे । सिस्टर्ना मैग्ना इंजेक्शन के तीन दिन बाद मुरीन ओमायस प्रत्यारोपित किए गए । चूहों को इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद लेप्टोमेनिंगियल बीमारी (एलएमडी) विकसित करना शुरू हुआ। एलएमडी चूहों को या तो एक मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर एंटीबॉडी के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से या इंट्राथिकल (मुरीन ओमाया) के माध्यम से प्रत्यक्ष लक्षित दृष्टिकोण के रूप में इलाज किया गया था। 4 सप्ताह तक के लिए सप्ताह में एक बार इंजेक्शन दिए गए थे। अनुपचारित चूहों की तुलना में, इम्यूनोथेरेपी प्राप्त करने वाले चूहे बहुत लंबे समय तक जीवित रहे। मुरीन ओमाया चूहों को चौथे सप्ताह तक पूरी बीमारी का प्रतिगमन था, और इन चूहों अंततः बीमारी से ठीक हो गए थे । (ख)इन चूहों में भी काफी बेहतर औसत अस्तित्व था (Mantel-कॉक्स परीक्षण; पी = 0.004; n = उपचार हाथ प्रति 5 चूहों) और व्यवस्थित रूप से इलाज एलएमडी चूहों की तुलना में बेहतर समग्र अस्तित्व। संक्षिप्त रूप: एलएमडी = लेप्टोमेनेनेरियल रोग; आईपी = इंट्रापेरिटोनियल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
यहां मुरीन ओमाया को एक भरोसेमंद मॉडल बताया गया है, जो एलएमडी और अन्य सीएनएस से संबंधित बीमारियों के प्रीक्लिनिकल मॉडल्स में सीएसएफ स्पेस में एंटी कैंसर एजेंट्स के बार-बार प्रशासन की अनुमति देता है । सीएसएफ चूहों से नमूना लिया गया था, जबकि डिवाइस अभी भी बिना किसी रुकावट के जुड़ा हुआ था । यह प्रत्यक्ष लक्षित चिकित्सा xenograft मॉडल एलएमडी के लिए तर्कसंगत उपचार रणनीतियों के विकास और परीक्षण में एक महत्वपूर्ण कदम है। सिस्टर्ना मैग्ना इंजेक्शन से एलएमडी विकास के प्रारंभिक संकेत तक का समय कैंसर सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होता है। सीटीसी टीका लगाने के लगभग 1 या 2 सप्ताह बाद एलएमडी और सीएनएस मेटास्टेस फॉर्म लेना शुरू कर देते हैं। यदि अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव कैंसर सेल लाइन का उपयोग किया जाता है, तो यह संभव है कि मेटास्टेसिस <7 दिनों में हो सकता है। इस मामले में, ट्यूमर के विकास के कारण संवहनी कभी-कभी मुरीन ओमाया को चुनौतीपूर्ण बना सकता है। इस चुनौती का एक समाधान सीएसएफ अंतरिक्ष में इंजेक्शन के लिए कैंसर कोशिकाओं की संख्या को कम करना है, जिससे ट्यूमर के विकास से पहले अधिक समय के लिए अनुमति दी जा सके। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को पहले उपचार से पहले चूहों से उबरने के लिए पर्याप्त समय सुनिश्चित करने के लिए सिस्टर्ना मैग्ना इंजेक्शन के बाद 72 घंटे से बाद में मुरीन ओमाया को प्रत्यारोपित करने के लिए अनुकूलित किया गया है। शोधकर्ताओं को उपचार आहार की योजना बनाने से पहले xenograft मॉडल में सीटीसी की वृद्धि दर की गणना करनी चाहिए ।
यद्यपि अन्य प्रत्यक्ष इंट्रावेंट्रिकुलर डिलीवरी विधियां हैं, जैसे कि एक ऑस्मोटिक पंप सिस्टम या इंट्राचेरेब्रोवेंट्रिकुलर (आईसीवी) बोलस इंजेक्शन का उपयोग करना, जैसा कि पहले9वर्णित है, मुरीन ओममाया मॉडल का उपयोग करने के कई फायदे हैं। उदाहरण के लिए, एक आईसीवी बोलस इंजेक्शन एक ही प्रसव में किया जाता है, जबकि मुरीन ओमाया किसी भी समय उपचार की कई खुराक के लिए अनुमति देता है, चाहे एक एजेंट के रूप में दिया गया हो या संयुक्त उपचार के रूप में। ओस्मोटिक पंप को पंप के प्रतिस्थापन की आवश्यकता से पहले 14, 28 या 42 दिनों तक बनाए रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और कभी-कभी अधिक बार यदि छोटे पंप के साथ एक छोटे माउस का उपयोग किया जाता है। ऑस्मोटिक पंप बदलने के लिए एक शल्य प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, जो ट्यूमर-असर चूहों के लिए तनाव जोड़ता है। जब तक डिवाइस बरकरार रहता है, तब तक लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए मुरीन ओमाया रिप्लेसमेंट जरूरी नहीं है । यह संभावित परिवर्तनशीलता को भी कम करता है जिसके परिणामस्वरूप पंप 9 बदलजाताहै । प्रायोगिक चूहों में प्रत्यारोपित मुरीन ओममायेस 42 दिनों से अधिक समय तक बरकरार रहे, और इस अवधि को लंबे समय तक रहने वाले उपचार आहार के लिए अनुमति दी गई।
पिछले निष्कर्षों से पता चलता है कि सीएसएफ में एक स्पंदन आंतरायिक डोजिंग में एलएमडी के खिलाफ13जलसेक द्वारा लंबे समय तक दवा वितरण प्रक्रिया की तुलना में बेहतर प्रभावकारिता है । ऑस्मोटिक पंप सिस्टम का उपयोग करके बार-बार एकल खुराक इंजेक्शन करना असंभव होगा। प्रत्येक इंजेक्शन के बाद शेष फंसे तरल को बाहर निकालने का कोई आसान तरीका नहीं है। ऑस्मोटिक पंप संगत या एकल दवाओं के मिश्रण देने तक भी सीमित है और आमतौर पर निरंतर जलसेक के लिए दवा तैयार करने की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, Murine Ommaya सटीक माइक्रो इंजेक्शन के लिए डिज़ाइन किया गया है के रूप में छोटे रूप में 3 से 7 μL, मृत अंतरिक्ष के लिए खाते के बिना, और वहां दवाओं के प्रकार शोधकर्ताओं का उपयोग कर सकते है पर कोई सीमा नहीं है, प्रतिरक्षा सेल थेरेपी सहित । यदि कोई विशेष नमूना कीमती है और उस संसाधन के उपयोग को अधिकतम करता है तो मुरीन ओमाया भी अभिवाक अपशिष्ट को कम करता है। किसी भी उपचार आहार के लिए जिसमें कैंसर रोधी उपचारों की कई खुराकों की आवश्यकता होती है, मुरीन ओमाया का उपयोग करना आसान है, और संक्रमण या सर्जिकल दुस्साहस का न्यूनतम जोखिम होता है, जिसमें सीएसएफ को बार-बार शल्य चिकित्सा या सुई के साथ बार-बार डिलीवरी के माध्यम से पहुंचने के वैकल्पिक दृष्टिकोण होते हैं। मुरीन ओमाया शोधकर्ताओं को दवा सांद्रता और डोजिंग आवृत्तियों को समायोजित करने और रुचि के अनुसंधान के अनुसार अध्ययन के लक्ष्य मॉड्यूलेशन और अवधि का आकलन करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है ।
मुरीन ओमाया की एक सीमा यह है कि शोधकर्ताओं को छोटे चूहों में डिवाइस प्रत्यारोपित करने में मुश्किल हो सकती है । इसलिए, चूहों का उपयोग करना बेहतर है जो कम से कम 8 से 10 सप्ताह की उम्र के हैं। यह संभव है Murine Ommaya उपचार परीक्षण के दौरान बंद आने के लिए अगर डिवाइस प्रत्यारोपण कदम के दौरान खोपड़ी के लिए सुरक्षित नहीं है और गोंद बंद पहनता है, या यदि चूहों घर्षण इसके साथ छेड़छाड़ की है । बाद परिदृश्य अधिक बार होता है जब कई चूहों को एक ही पिंजरे में रखे गए थे। इसलिए, उपचार अनुसूची की अवधि के लिए प्रति पिंजरे में दो से अधिक मुरीन ओमाया-प्रत्यारोपित चूहों को घर देने की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल को स्पेसर पर साइनोक्रिलेट बाँझ चिपकने वाला लागू करने के लिए संशोधित किया गया था, जो खोपड़ी की सतह पर स्पेसर का पालन करने और मुरीन ओमाया को बंद आने से रोकने के लिए सबसे प्रभावी गोंद पाया गया था। परिणामों से पता चला है कि एलएमडी चूहों को मुरीन ओमाया के माध्यम से सीधे इंट्राथेकल थेरेपी से लाभ हुआ, जिसमें समग्र अस्तित्व में वृद्धि हुई । बीबीबी को दरकिनार करते हुए एकल माइक्रोलीटर की मात्रा को सुरक्षित रूप से प्रशासित किया जा सकता है, जिससे दवा तैयार करने की मात्रा कम हो जाती है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि Her2-एंटीबॉडी इम्यूनोथेरेपी अध्ययन से सीएनएस मेटास्टेस के ठीक हुए चूहे स्वस्थ बने हुए हैं।
एलएमडी के पीडीएक्स मॉडल के लिए मुरीन ओमाया के एमआरआई-संगत संस्करण को विकसित करने के उद्देश्य से निर्माता के साथ सहयोग। क्योंकि इस प्रोटोटाइप संस्करण में एक स्पेसर शामिल है, इसलिए खोपड़ी के बेहतर पालन के लिए किसी असेंबली की आवश्यकता नहीं है। इस प्रोटोटाइप की एक सीमा यह है कि हालांकि डिवाइस एमआरआई-संगत है, यह एक छाया उत्पन्न करता है जहां डिवाइस डाला जाता है, जो मात्राकरण विश्लेषण के लिए छवि की दृश्यता को कम करता है। एमआरआई-संगत संस्करण एक अच्छा वैकल्पिक उपकरण है जब पूर्व वीवो सीटीसी नमूना एक सीमित कारक है, और प्रीलेबलिंग कोशिकाएं संभव नहीं हैं। बीबीबी को दरकिनार करते हुए डायरेक्ट-टारगेटेड ड्रग प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एलएमडी क्सीनोबेड़ा मॉडल और मुरीन ओमाया तकनीक का संयोजन फायदेमंद है। वीवो अध्ययन में इन से परिणाम चिकित्सकीय एलएमडी के साथ रोगियों के लिए तर्कसंगत चिकित्सकीय रणनीतियों डिजाइन करने के लिए प्रासंगिक हैं ।
Disclosures
पीटर फोर्सिथ प्रस्तुत काम के बाहर, Abvie इंक, बायर, ब्रिस्टल मेयर्स फुलैब, बीटीजी, इनोवियो, नोवोक्योर, टोकाजेन और Ziopharm के लिए सलाहकार बोर्डों पर कार्य करता है । अन्य सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है ।
Acknowledgments
हम मिशेल एल डैनियलसन, Tricia एहसान-वाटसन, और दक्षिण फ्लोरिडा विश्वविद्यालय में तुलनात्मक चिकित्सा टीम के बाकी उनके तकनीकी समर्थन के लिए और हमारे जानवरों को बनाए रखने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम एक एमआरआई संगत Murine Ommaya विकसित करने के लिए हमारे अनुरोध के आधार पर हमारे साथ काम करने के प्रयास के लिए Instech प्रयोगशालाओं, इंक धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) R21 CA216756 (K.S..M smalley), रक्षा विभाग (DOD) W81XWH10675 (बी Czerniecki और पी Kalinski के लिए) द्वारा समर्थित है, और Moffitt कैंसर केंद्र CBMM अभिनव पुरस्कार (पी Forsyth और D. Duckett के लिए) । संपादकीय सहायता डॉ पॉल फ्लेचर और Daley ड्रकर द्वारा वैज्ञानिक लेखन के Moffitt कैंसर केंद्र के कार्यालय द्वारा प्रदान की गई थी । उनके नियमित वेतन से अधिक कोई मुआवजा नहीं दिया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
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