Summary
Här beskriver vi en murin xenograft modell som funktionellt liknar en Ommaya reservoar hos patienter. Vi utvecklade Murine Ommaya för att studera nya terapier för den universellt dödliga leptomeningeal sjukdomen.
Abstract
Leptomeningeal sjukdom (LMD) är en ovanlig typ av centrala nervsystemet (CNS) metastasering till cerebral spinal vätska (CSF). De vanligaste cancerformerna som orsakar LMD är bröst- och lungcancer och melanom. Patienter som diagnostiserats med LMD har en mycket dålig prognos och överlever i allmänhet bara i några veckor eller månader. En möjlig orsak till bristen på effekt av systemisk terapi mot LMD är misslyckandet med att uppnå terapeutiskt effektiva koncentrationer av läkemedel i CSF på grund av en intakt och relativt ogenomtränglig blod- hjärnbarriär (BBB) eller blod-CSF-barriär över choroidplexus. Därför, direkt administrera läkemedel intratekalt eller intraventricularly kan övervinna dessa hinder. Denna grupp har utvecklat en modell som möjliggör effektiv leverans av terapier (dvs. läkemedel, antikroppar och cellulära terapier) kroniskt och upprepad provtagning av CSF för att bestämma läkemedelskoncentrationer och målmodulering i CSF (när tumörmikromiljön är riktad mot möss). Modellen är murin motsvarigheten till en magnetisk resonanstomografi-kompatibel Ommaya reservoar, som används kliniskt. Denna modell, som är fäst vid skallen, har utsetts till "Murine Ommaya". Som ett terapeutiskt konceptbevis levererades human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 antikroppar (klon 7.16.4) till CSF via Murine Ommaya för att behandla möss med LMD från human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2-positiv bröstcancer. Murine Ommaya ökar effektiviteten av läkemedelsleverans med hjälp av en miniatyråtkomstport och förhindrar slöseri med överskott av läkemedel; det stör inte CSF-provtagning för molekylära och immunologiska studier. Murine Ommaya är användbar för att testa nya terapier i experimentella modeller av LMD.
Introduction
Leptomeningeal sjukdom (LMD) är en aggressiv sena metastasering av CNS, där tumörceller kommer åt CSF och infiltrerar ytan av hjärnan ochryggmärgen 1. De vanligaste cancerformerna som orsakar LMD inkluderar bröst och lunga samt melanom2. LMD resulterar i ett antal neurologiska symtom och tecken såsom huvudvärk, hjärnskålen nerv palsies, stel nacke och radiculopathies. Prognosen för patienter med LMD är i allmänhet mycket dålig (genomsnittlig överlevnad mäts i veckor) och är universellt dödlig3,4,5,6,7. Behandling med kirurgi, strålning och systemisk kemoterapi är palliativ. Systemisk terapi för LMD kan misslyckas på grund av otillräcklig läkemedelspenetration i CSF över en intakt BBB- eller blod-CSF-barriär över choroidplexus1.
Att administrera cancerterapier (t.ex. läkemedel och antikroppsbaserade behandlingar inklusive kontrollpunktshämmare och cellterapier) direkt i CSF kan därför övervinna dennabegränsning 8. Tillgång till och provtagning av CSF från patienter är möjlig genom en Ommaya-reservoar som implanteras under hårbotten. Denna apparat möjliggör administrering av cancermedel (t.ex. metotrexat och trastuzumab) samt provtagning av CSF för diagnostiska studier (t.ex. cytologisk diagnos av LMD för att övervaka för behandlingssvar) utan att utföra en spinalkran. En murin Ommaya reservoar utformades för att efterlikna de som används kliniskt. Behållaren kräver montering av en åtkomstport och distansdelar och en modifiering av musens kannuleringsteknik, vilket gör att enheten kan förbli permanent intakt under hela läkemedelsstudiens varaktighet. Denna enhet har utsetts till "Murine Ommaya".
I motsats till den osmotiska infusionspumptekniken, som kräver beredning av överskott av vätskevolymer för att fylla det tomma utrymmet i slangen och kontinuerlig infusion över frekventainjektioner 9, minimerar Murine Ommaya slöseriet med läkemedelslösningar. Det möjliggör effektiv administrering av flera enstaka doser av behandlingar vid en given tidpunkt i små mängder (3-7 μL) till CSF med hjälp av en Hamilton-spruta, en miniatyråtkomstport och en automatisk injektor. I realtid kan effekten av testläkemedel mot LMD bestämmas genom avbildning. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan en mängd olika kemoterapier, antikroppar och cellimmunterapier (som enstaka eller kombinerade medel) testas mot LMD för att översätta in vivo-fynd till rationella behandlingsstrategier för patienter. För att ytterligare förbättra bildframställningskapaciteten för en patientledd xenograftmodell (PDX) av LMD, genomfördes ett samarbete med en tillverkare för att utveckla en magnetisk resonanstomografi (MRT)-kompatibel version av Murine Ommaya, som inte kräver någon montering och är klar att användas. MRI-kapacitet är fördelaktigt, särskilt för PDX-modeller där mängden cirkulerande tumörceller (CTC) från CSF ibland är den begränsande faktorn, och ofta när prelabeling CTCs är ogenomförbar.
Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll som börjar med injektion av CTC för att göra möss med LMD . Murine Ommaya implanteras sedan kirurgiskt, och flera läkemedelsbehandlingssteg via Murine Ommaya utförs. Som ett konceptbevis för demonstration utfördes en in vivo sida vid sida jämförelse, där murin mänskliga epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (Her2) antikroppar kallas klon 7.16.4 (den mänskliga motsvarigheten till trastuzumab) levererades10. Antikroppen riktar sig till Her2+ bröstcancerceller antingen via Murine Ommaya (direkt eller intratekal behandling) eller genom intraperitoneal injektion (systemisk terapi). Resultaten visade att möss med LMD som fick direkt intratekal immunterapi levde betydligt längre än de som behandlades med samma behandling systemiskt. CNS-metastaserna hos möss som behandlades via Murine Ommaya återgått nästan helt av den tredje dosen av den tredje behandlingsveckan, vilket resulterade i förbättrad total överlevnad.
Protocol
Protokollet godkändes av University of South Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IS00005974).
1. Injektion av CTC i CSF för att generera en mus LMD-modell
- Förberedelse av CTC
- Beräkna antalet CTC som behövs för injektion och förbered en encellig suspension vid 1,0 × 104 celler/μL i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Placera cellfjädringen på is eller vid 4 °C under hela proceduren.
OBS: När du använder cellinjer som kräver trypsinisering, var noga med att tvätta cellerna två gånger med steril PBS för att ta bort trypsin. Utför cellantal med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare. Om en stor kohort (>50 möss) används, berätta om cellerna och validera cellens livskraft mellan injektioner för att säkerställa att ett konsekvent antal celler administreras per mus.
- Beräkna antalet CTC som behövs för injektion och förbered en encellig suspension vid 1,0 × 104 celler/μL i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Placera cellfjädringen på is eller vid 4 °C under hela proceduren.
- Presurgiskt förfarande
- Injicera musen subkutant med 1 mg/kg buprenorfin ihållande frisättning (Bup-SR).
OBS: Injicera inte det föreslagna snittet. välj ett injektionsställe långt bort från scapula. - Söv musen med 2-3% isofluran tills den inte visar några tecken på högerreflex. Dessutom, kontrollera om svans och / eller tass nypa reflex för att bekräfta anestesi.
- Förbered musen för operation på en plats som är avlägsen från operationsområdet. Kläm det kirurgiska området (dvs. skallens dorsala yta) med tillräckligt med gränsområde för att hindra päls från att förorena snittplatsen. mätta sedan platsen med bakteriedubstanshud antiseptisk, arbeta från mitten av platsen till periferin och låt sedan torka. Applicera antingen sterilt draperi eller ett sterilt självhäftande plastdraperimaterial för att skydda operationsstället från kontaminering.
OBS: Instrumenten ska autoklaveras i förväg och tipsen steriliseras igen mellan djur med hjälp av en glaspärlasteriliserare. - Raka pälsen på hela huvudets ventrala yta och förbered huden med steril teknik.
- Placera näsan med en modifierad L-formad noskon i stereotaktisk apparaten, se till att nares förblir tydliga och öppna. Använd tejp över båda pinnaes ventrala ytor, dra försiktigt huden framåt för att fästa den på näskonen och böj nacken i en cirka 90° vinkel när den är säkrad. Administrera 1,5% isofluran för att bibehålla anestesi.
OBS: Korrekt positionering kommer att resultera i att snittområdet presenteras på ett sätt som gör det möjligt att enkelt identifiera den kaudala åsen på det occipitala benet. - Placera kroppen för att säkerställa att ryggraden hålls i nivå med cisterna magna, och samtidigt som du applicerar liten dragkraft på svansen, placera tejpen vid svansbasen för att säkra.
- Injicera musen subkutant med 1 mg/kg buprenorfin ihållande frisättning (Bup-SR).
- Kirurgisk cisterna magna injektion
- Med nacken i full förlängning, och börjar precis mellan pinnae, kör de kirurgiska saxspetsarna nedåt med lätt tryck över occipitalbenet.
OBS: I detta mittlinjeläge märks en liten depression när saxspetsarna doppar sig i det konkava området över cisterna magna. - Gör ett litet 3-5 mm mittlinjesnitt strax ovanför den palpapaed concavity. Dra 5 μL cellfjädring vid 1,0 × 104 celler/μL (totalt 5,0 × 104 celler) i en 30 G Hamilton-spruta.
- Använd trubbigt tippade tångar med 1-2 mm spetsar för att försiktigt trycka ner cisterna magna. Inför tips i stängt läge och öppna dem samtidigt som du tryck nedåt på duran tryck.
- Upprepa trubbig dissekering som beskrivs i föregående steg tills hamburg membranet är lätt att identifiera, och de associerade blodkärlen är synliga i det exponerade området.
OBS: Det resulterande injektionsfönstret säkerställer att blodkärlen är oskadade under nålinsättning. - Medan du håller tången öppen för att dra tillbaka omgivande muskulatur, introducera en 30 G icke-coring nål under duran för att visualisera avfasningen. Se till att nålen endast införs strax bortom själva avfasningen. Sätt långsamt ut en sprutkolv och leverera celler precis under duran.
- Placera avfasningen ordentligt för att observera injektionen under duran. Administrera tekniken noggrant och använd 30 G icke-coring nål för att förhindra skador på membranet och säkerställa minimalt läckage. Om läckage noteras, applicera försiktigt tryck med en bomullsspetsad applikator.
- Stäng huden genom att applicera ett sårklämma eller mikrodroppe av hudlim. När injektionen har utförts framgångsrikt, låt mössen återhämta sig från anestesi på en varm filt, observera dem kontinuerligt tills de kan upprätthålla sternal position och visa målmedveten rörelse.
- Övervaka mössen dagligen efter operationen under den första veckan. Om en mus verkar ha ont eller ångest, behandla den med 10 mg/kg subkutan injektion av karprofen en gång var 12:e till 24:e timme i upp till 5 dagar på grundval av veterinärt samråd och direktiv. Låt möss återhämta sig och övervaka dem i minst 48 till 72 timmar innan de går vidare till nästa steg.
OBS: Bup-SR, givet förebyggande, kommer att vara upp till 72 h, så ytterligare smärtstillande medel är normalt inte nödvändiga. Djur kommer dock att ges ytterligare smärtstillande medel vid behov (om slö, inte äta, ruffled). Om ett kirurgiskt ställe utvecklar tecken på postoperativ infektion (dvs. rodnad, svullnad, ömhet, allodyni, hyperalgesi, hyperpathia eller suppuration), eller om musen skyddar det drabbade området, avliva musen. Om cancerceller framgångsrikt injiceras i CSF kommer LMD och tumörprogression att utvecklas i CNS inom 1 eller 2 veckor (beroende på vilka typer av CTC eller cellinje som används) (Figur 1).
- Med nacken i full förlängning, och börjar precis mellan pinnae, kör de kirurgiska saxspetsarna nedåt med lätt tryck över occipitalbenet.
2. Murine Ommaya montering och implantation
- Förberedelse av station
- Desinficera stationsytan. Placera ett blått hölje över ytan och håll alla steriliserade verktyg och förnödenheter som anges i figur 2 redo.
- Presurgiskt förfarande
- Applicera analgesi (Bup-SR) och behåll steril teknik enligt beskrivningen i avsnitt 1.2.
- Kirurgisk implantation av Murine Ommaya
- Montera Murine Ommaya-injektionsanordningen med en miniatyrinsprutningsport på 25 G (0,51 mm ytterdiameter) och en 1 mm distansskiva. Använd ett cyanoakrylatsterilt lim för att säkerställa penetration av cirka 2,5 mm av metallkantylen i höger hjärnhalva (figur 3A-C).
OBS: En MRI-kompatibel Mouse Ommaya prototyp utvecklades i detta laboratorium, som redan har båda delarna (miniatyrinjektionsport och distans) 3D-printade tillsammans som en enda enhet (Figur 3D). Den enda enhetsversionen testades av MRT och kan spara tid genom att eliminera monteringssteget. - Söv musen med 2-3% isofluran tills det inte finns några tecken på högerreflex. Kontrollera vidare svans och / eller tass nyp reflex för att bekräfta anestesitillståndet.
- Raka hela den ventrala ytan på pälshuvudet och förbered huden enligt den sterila tekniken, som tidigare beskrivits i steg 1.2.3. Placera musen i stereotaktiska apparaten med en noskon för att fortsätta isofluranadministrationen under proceduren. minska isofluranen till 1,5%. Dra försiktigt åt öronstängerna för att säkra huvudet och applicera ögonsmörjmedel för att täcka musens ögon.
- Gör ett litet hudsnitt (3 mm), följt av trubbig dissekering av de underliggande subkutana vävnaderna för att exponera skallen. Torka skallen med hjälp av väteperoxiddränkta applikatorpinnar med bomullsspets.
- Borra ett borrhål i skallen 0,5 mm bakre och 1,1 mm lateralt av knägma-den anatomiska punkten på skallen där koronal suturen skärs vinkelrätt av sagittal suturen (Figur 3A) - samt ett 0,9 mm graders hål för att exponera dura mater. Flytta mikrodrillen åt sidan och poängsätta försiktigt benet omedelbart runt borrhålet innan du sätter in en injektionsport (djup på cirka 2,5 mm), fäst på skallen med ett cyanoakrylatsterilt lim. Tillstånd sutur runt injektionsstället med 4-0 no-absorbance nylon suturer i ett avbrutet stygn mönster eller handväska sträng sutur11.
- Hus efter operationen möss i enskilda burar för kirurgi återhämtning.
OBS: Det är möjligt att Murine Ommaya kan lossna när flera kirurgi-återhämtade möss är inhysta i samma bur, möjligen på grund av konstant manipulering interaktioner. Det rekommenderas att Murine Ommaya-implanterade möss inhyses individuellt (eller högst 2 möss per bur) under läkemedelseffektstudien.
- Montera Murine Ommaya-injektionsanordningen med en miniatyrinsprutningsport på 25 G (0,51 mm ytterdiameter) och en 1 mm distansskiva. Använd ett cyanoakrylatsterilt lim för att säkerställa penetration av cirka 2,5 mm av metallkantylen i höger hjärnhalva (figur 3A-C).
3. Behandling med Murine Ommaya
- Dosmöss som använder Murine Ommaya
- Söv musen med 2-3% isofluran, tills det inte finns några tecken på högerreflex. Kontrollera vidare om svans och/eller tass nyp reflex för att bekräfta underhåll av anestesi.
- Få tillgång till Murine Ommaya med hjälp av en portinjektionsadapter och en Hamilton-spruta. Håll toppen av miniatyrinjektionsporten med tång och sätt försiktigt in injektoradaptern helt i portens septum.
OBS: Portinjektorn genomborrar portens septum på ett sätt som minskar det döda utrymmet till ett minimum och möjliggör kontrollerad injektion via en motoriserad sprutpump (figur 4A). Riktade/nya behandlingar injiceras med en flödeshastighet på 1 μL/min under narkos. Behandlingen ska ges med angivna intervaller (dagligen/veckovis) under en bestämd tid (veckor/månader), enligt forskarens bedömning.
En volym mellan 3 och 7 μL är optimal, eftersom en volym < 3 μL är opålitlig och en volym > 7 μL kan orsaka för mycket tryck. Storleken på Hamilton-sprutan kan variera från 10 till 100 μL, beroende på antalet möss i varje behandlingsarm. Förladdning av lämplig volym i Hamilton-sprutan förhindrar upprepad ersättning av sprutan, vilket minimerar fel. Det är bäst att dedikera 1 Hamilton spruta per behandlingsarm. - När injektionen är gjord lossar du Murine Ommaya från portinsprutningsadaptern med tång och returnerar musen till buret för att återhämta sig från anestesi, enligt beskrivningen ovan i steg 1.3.7.
- Dödshjälp
- Avliva mössen genom inandning av koldioxid (CO2)från en komprimerad tankkälla. Utsätt mössen för ökande koncentrationer av CO2 (dvs. en deplacementhastighet från 10% till 30% av kammarens volym/min ska användas) för att undvika eller minimera obehag eller ångest. Övervaka mössen tills de är säkra på att kardiovaskulära rörelser och andningsrörelser upphör.
Representative Results
Hos möss är den totala volymen CSF cirka 35-40 μL och produceras med en hastighet av ca 350 nL/min. den vänder över 12-13 gånger om dagen12. För att visualisera injektionens väg injicerades 2% Evans Blue via Murine Ommaya-modellen, varefter 15 min och 30 min tilläts förfluta innan hjärnan skördades för analys. Färgämnet infiltrerade framgångsrikt ventriklarna och hjärnan på 15 minuter. Inom 30 min blev färgämnet synligt på ryggmärgen (Figur 4).
Som ett konceptbevis injicerades BALB/c möss med en luciferase-märkt Her2+ TUBO bröstcancer cellinje intratracisternally, och Murine Ommayas implanterades. Ungefär 1 vecka efter injektionen av cancerceller började mössen utveckla LMD. Dessa möss behandlades en gång i veckan i upp till 4 veckor med Her2- antikroppsimmunterapi, antingen genom systemisk behandling via intraperitoneal injektion eller intratekalt via Murine Ommaya (Figur 5A).
Även om obehandlade möss dog dag 19, överlevde alla möss som fick intratekal terapi genom Murine Ommaya (P = 0,004). Vecka 4 observerades en fullständig regression av tumörer. I jämförelse med möss som behandlades med systemisk terapi, som hade måttlig framgång vid behandling av LMD, hade möss som fick intratekal behandling en mycket längre total överlevnad (Figur 5B).
Figur 1: Injektion av cirkulerande tumörceller i cisterna magna i en murin xenograft modell för att studera leptomeningeal sjukdom och centrala nervsystemet metastaser. (A) En illustration som visar platsen för cisterna magna och CSF åtkomst plats, där CTCs injiceras med hjälp av en Hamilton spruta. (B) En representativ IVIS-bild av möss som hade utvecklat leptomeningeal sjukdom och centrala nervsystemet metastaser (hjärnan och längs ryggmärgen) efter 2 veckors injektion med cirkulerande tumörceller. Cellerna var märkta med en luciferase reporter gen. Kontroll djur injiceras med saltlösning utvecklade inte tumörer (n = 3), och experimentet utfördes i tre exemplar. Förkortningar: CTC = cirkulerande tumörceller; IVIS = in vivo bildsystem. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Ett exempel på en arbetsstationsinställning för att utföra Murine Ommaya-implantationen hos möss. (1) Gasbedövningsmaskin/vaporizer. (2) Sterilt blått pappersdraperi som täcker ett stereotaxiskt stativ. (3) Stereotaxisk anordning (stativ/scen, öronstänger, noskon). (4) Mikrodrill. (5) Förstoringsglas med ljus. (6) Sterila bomullstapplikatorpinnar med steril saltlösningssköljbehållare. (7) Väteperoxid. (8) Pärlsteriliserare. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Implantation av Murine Ommaya-anordningen. (A) En illustration med en pil som pekar på knäckedjuret på skallen och det ungefärliga avståndet vid vilket ett borrhål borras i skallen (0,5 mm bakre/1,1 mm lateralt) från bregman med hjälp av en mikrodrill. B)En Murine Ommaya monteras genom att kombinera en metall kanyl och en 1 mm distans som bas för limfäste på skallen. C)Representativa bilder av möss som hade Murine Ommayas implanterade. dessa möss övervakas för att säkerställa att de är ljusa, alerta och reaktiva innan de får några injektioner. (D) Ett exempel på prototypen magnetisk resonanstomografi-kompatibel Murine Ommaya och representativa hjärnan magnetisk resonanstomografi bilder av Murine Ommaya implantat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Intraventricular (centrala nervsystemet) injektion med Murine Ommaya. (A) En bild av en injektion, tillgång till ventrikeln och centrala nervsystemet via Murine Ommaya. Möss förblir under anestesi under injektionen. I exemplet är Murine Ommaya ansluten till miniatyrporten som är fäst vid en förfylld Hamilton-spruta. Injektioner utförs med en automatisk injektionsset med en infusionshastighet på 1 μL/min och en volym på 5-7 μL. En bild av en mushjärna injicerad med Evans Blue visas. Cirkeln visar var Murine Ommaya var fäst. Inget läckage av färgämnet observerades på utsidan av hjärnan. Ett tvärsnitt av hjärnan visar att laterala ventriklarna fylldes med färgämnet; färgämnet penetrerade inte hjärnan parenkym. (B) Bilder av mushjärnor efter 15 och 30 min efter injektionen av Evans Blue färgämne. Färgämnet infiltrerade hjärnan (15 min) och började cirkulera på ryggmärgen (30 min). Av 5 möss fick 4 färgämne för visualisering och 1 fungerade som kontroll. Experimentet upprepades i tre exemplar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Direktriktad immunterapi med Murine Ommaya ökar den totala överlevnaden för bröstcancerassocierade leptomeningealsjukdomsmöss. (A) BALB/ c möss injicerades med luciferas reporter-märkta mänskliga epidermal tillväxtfaktorreceptor 2-positiva TUBO-celler, en murin bröstcancer cellinje. Tre dagar efter cisterna magna injektioner, Murine Ommayas implanterades. Möss började utveckla leptomeningeal sjukdom (LMD) 1 vecka efter injektion. LMD möss behandlades med antingen en human epidermal tillväxtfaktor receptor antikropp systemiskt via intraperitoneal injektion eller via intratekal (Murine Ommaya) som en direkt riktad strategi. Injektioner gavs en gång i veckan i upp till 4 veckor. Jämfört med obehandlade möss överlevde möss som fick immunterapi mycket längre. Murine Ommaya möss hade fullständig sjukdom regression av den fjärde veckan, och dessa möss botades så småningom av sjukdom. B)Dessa möss hade också betydligt bättre medianöverlevnad (Mantel-Cox-testet; P = 0,004; n = 5 möss per behandlingsarm) och bättre total överlevnad än systematiskt behandlade LMD-möss. Förkortningar: LMD = leptomeningeal sjukdom; IP = intraperitoneal. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Här har Murine Ommaya beskrivits som en pålitlig modell, vilket möjliggör upprepad administrering av cancermedel till CSF-utrymmet i prekliniska modeller av LMD och andra CNS-relaterade sjukdomar. CSF provtogs från möss medan enheten fortfarande var fastsatt utan avbrott. Denna direktriktade terapi xenograft modell är ett viktigt steg i att utveckla och testa rationella behandlingsstrategier för LMD. Tiden från cisterna magna injektioner till det första tecknet på LMD utveckling varierar beroende på cancercellstyp. LMD- och CNS-metastaser börjar bildas cirka 1 eller 2 veckor efter CTC-inokulering. Om en mycket proliferativ cancercelllinje används är det möjligt att metastasering kan uppstå på <7 dagar. I det här fallet kan vaskularisering på grund av tumörtillväxt ibland göra implantation av Murine Ommaya utmanande. En lösning på denna utmaning är att minska antalet cancerceller för injektion i CSF-utrymmet, vilket ger mer tid före tumörutveckling. Dessutom har detta protokoll optimerats för att implantera Murine Ommaya senast 72 timmar efter cisterna magna injektionen för att säkerställa tillräckligt med tid för möss att återhämta sig från kirurgi före den första behandlingen. Forskare bör beräkna tillväxttakten för CTC i xenograftmodeller innan behandlingsregimen planeras.
Även om det finns andra direkta intraventricular leveransmetoder, såsom att använda ett osmotic pumpsystem eller en intratracerebroventricular (ICV) bolus injektion, som beskrivitstidigare 9, det finns flera fördelar med att använda Murine Ommaya modell. Till exempel görs en ICV bolus injektion i en enda leverans, medan Murine Ommaya tillåter flera doser av behandling när som helst, oavsett om det ges som ett enda medel eller som kombinerade terapier. Den osmotiska pumpen är utformad för att hålla i upp till 14, 28 eller 42 dagar innan pumpen behöver bytas ut, och ibland oftare om en mindre mus med en mindre pump används. Att byta osmotisk pump kräver ett kirurgiskt ingrepp, vilket ökar stressen hos tumörbärande möss. En Murine Ommaya ersättning är inte nödvändig för långvariga experiment så länge enheten förblir intakt. Det minimerar också potentiell variabilitet som är resultatet av att byta pump9. Implanterade Murine Ommayas i de experimentella mössen förblev intakta längre än 42 dagar, och denna varaktighet tillät långlivade behandlingsregimer.
Tidigare resultat tyder på att en pulsatil intermittent dosering i CSF har bättre effekt mot LMD än en långvarig drug delivery process genom infusion13. Det skulle vara omöjligt att utföra upprepade endosinjektioner med hjälp av osmotic pumpsystemet. Det finns inget enkelt sätt att spola ut den återstående fångade vätskan efter varje injektion. Den osmotiska pumpen är också begränsad till att leverera blandningar av kompatibla eller enstaka läkemedel och kräver vanligtvis högre volymer läkemedelspreparat för kontinuerlig infusion. Murine Ommaya är däremot utformad för exakta mikroinjektioner så lite som 3 till 7 μL, utan att behöva ta hänsyn till dött utrymme, och det finns ingen begränsning för vilken typ av läkemedel forskare kan använda, inklusive immuncellsterapi. Murine Ommaya minimerar också reagensavfall om ett visst prov är värdefullt och maximerar användningen av den resursen. För alla behandlingsregimer som kräver flera doser av cancerbehandlingar är Murine Ommaya lätt att använda, och det finns minimal risk för infektion eller kirurgiskt missöden, med alternativa metoder för att upprepade gånger komma åt CSF kirurgiskt eller via upprepad leverans med en nål. Murine Ommaya ger forskare flexibilitet att justera läkemedelskoncentrationer och dosfrekvenser och att bedöma målmodulering och studiens varaktighet enligt intresseforskningen.
En begränsning av Murine Ommaya är att forskare kan ha svårt att implantera enheten hos mindre möss. Därför är det bättre att använda möss som är minst 8 till 10 veckor gamla. Det är möjligt för Murine Ommaya att lossna under behandlingsförsöket om enheten inte är fastsatt på skallen under implantationsstegen och limet avtar, eller om mössen har nött manipulering med den. Det senare scenariot inträffar oftare när flera möss var inhyst i samma bur. Därför rekommenderas att inte hysa mer än två Murine Ommaya-implanterade möss per bur under behandlingsschemat. Detta protokoll ändrades för att applicera cyanoakrylat sterilt lim på distansen, som befanns vara det mest effektiva limet för att vidhäfta distansen på skallytan och förhindra Murine Ommaya från att lossna. Resultaten visade att LMD möss gynnades av direkt intratekal terapi via Murine Ommaya, med ökad total överlevnad. Enstaka mikrolitervolymer kan administreras säkert, kringgå BBB, vilket minskar mängden läkemedelspreparat. Viktigast av allt, mössen som botades av CNS metastaser från Her2-antikropp immunterapi studie har förblivit friska.
Ett samarbete med en tillverkare syftade till att utveckla en MR-kompatibel version av Murine Ommaya för PDX-modellen av LMD. Eftersom denna prototypversion har en distans inkorporerad krävs ingen montering, vilket möjliggör bättre anslutning till skallen. En begränsning av denna prototyp är att även om enheten är MR-kompatibel, genererar den en skugga där enheten sätts in, vilket minskar synligheten för bilden för kvantifieringsanalyser. Den MRI-kompatibla versionen är ett bra alternativt verktyg när ex vivo CTC-sampling är en begränsande faktor, och förmärkning av celler är inte genomförbart. Kombinationen av en LMD xenograft modell och Murine Ommaya tekniken är fördelaktigt för att studera direkt riktade läkemedel effektivitet kringgå BBB. Resultaten från dessa in vivo-studier är kliniskt relevanta för att utforma rationella terapeutiska strategier för patienter med LMD.
Disclosures
Peter Forsyth sitter i advisory boards för Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen och Ziopharm, utanför det inlämnade arbetet. Alla andra författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson och resten av komparativ medicinteamet vid University of South Florida för deras tekniska stöd och underhåll av våra djur. Vi tackar Instech Laboratories, Inc. för deras arbete med oss baserat på vår begäran att utveckla en MR-kompatibel Murine Ommaya. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (till K.S.M. Smalley), Department of Defense (DOD) W81XWH1910675 (till B. Czerniecki och P. Kalinski) och Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (till P. Forsyth och D. Duckett). Redaktionell hjälp tillhandahölls av Moffitt Cancer Centers Kontor för vetenskapligt skrivande av Dr. Paul Fletcher och Daley Drucker. Ingen ersättning gavs utöver deras ordinarie löner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C.
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), Suppl 2 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al.
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
