Summary
Hier beschrijven we een murine xenograft model dat functioneel lijkt op een Ommaya reservoir bij patiënten. We ontwikkelden de Murine Ommaya om nieuwe therapieën te bestuderen voor de universeel fatale leptomeningeale ziekte.
Abstract
Leptomeningeale ziekte (LMD) is een ongewoon type metastase van het centrale zenuwstelsel (CZS) naar het hersenvocht (CSF). De meest voorkomende kankers die LMD veroorzaken zijn borst- en longkanker en melanoom. Patiënten met de diagnose LMD hebben een zeer slechte prognose en overleven over het algemeen slechts enkele weken of maanden. Een mogelijke reden voor het gebrek aan werkzaamheid van systemische therapie tegen LMD is het falen om therapeutisch effectieve concentraties van geneesmiddelen in de liquor te bereiken vanwege een intacte en relatief ondoordringbare bloed-hersenbarrière (BBB) of bloed-CSF-barrière over de choroïde plexus. Daarom kan het direct intrathecaal of intra-inventricular toedienen van geneesmiddelen deze barrières overwinnen. Deze groep heeft een model ontwikkeld dat de effectieve levering van therapeutica (d.w.z. geneesmiddelen, antilichamen en cellulaire therapieën) chronisch mogelijk maakt en de herhaalde bemonstering van CSF om medicijnconcentraties en doelmodulatie in de liquor te bepalen (wanneer de tumormicro-omgeving wordt gericht op muizen). Het model is het muizenequivalent van een magnetische resonantie beeldvorming-compatibel Ommaya reservoir, dat klinisch wordt gebruikt. Dit model, dat op de schedel is bevestigd, is aangeduid als de "Murine Ommaya". Als een therapeutisch bewijs van concept werden menselijke epidermale groeifactorreceptor 2-antilichamen (kloon 7.16.4) via de Murine Ommaya in de liquor afgeleverd om muizen met LMD van menselijke epidermale groeifactorreceptor 2-positieve borstkanker te behandelen. De Murine Ommaya verhoogt de efficiëntie van medicijnafgifte met behulp van een miniatuurtoegangspoort en voorkomt de verspilling van overtollige drugs; het interfereert niet met csf-bemonstering voor moleculaire en immunologische studies. De Murine Ommaya is nuttig voor het testen van nieuwe therapieën in experimentele modellen van LMD.
Introduction
Leptomeningeale ziekte (LMD) is een agressieve late-stage metastase van het CZS, waarbij tumorcellen toegang krijgen tot de liquor en het oppervlak van de hersenen en het ruggenmerg infiltreren1. De meest voorkomende kankers die LMD veroorzaken, zijn die van de borst en longen, evenals melanoom2. LMD resulteert in een aantal neurologische symptomen en tekenen zoals hoofdpijn, hersenzenuwverlammingen, stijve nek en radiculopathieën. De prognose voor patiënten met LMD is over het algemeen zeer slecht (gemiddelde overleving wordt gemeten in weken) en is universeel fataal3,4,5,6,7. Behandeling met chirurgie, bestraling en systemische chemotherapie is palliatief. Systemische therapie voor LMD kan mislukken vanwege onvoldoende penetratie van geneesmiddelen in de liquor over een intacte BBB- of bloed-CSF-barrière over de plexus choroidplexus 1.
Daarom kan het rechtstreeks toedienen van kankertherapieën (bijv. Geneesmiddelen en op antilichamen gebaseerde behandelingen, waaronder checkpointremmers en cellulaire therapieën) rechtstreeks in de liquor deze beperking overwinnen8. Toegang tot en bemonstering van CSF van patiënten is mogelijk via een Ommaya-reservoir dat onder de hoofdhuid wordt geïmplanteerd. Dit apparaat maakt de toediening van kankermiddelen (bijv. methotrexaat en trastuzumab) mogelijk, evenals de bemonstering van CSF voor diagnostische onderzoeken (bijv. de cytologische diagnose van LMD om te controleren op reacties op de behandeling) zonder een spinale tap uit te voeren. Een murine Ommaya-reservoir werd ontworpen om de klinisch gebruikte na te bootsen. Het reservoir vereist de assemblage van een toegangspoort en afstandsonderdelen en een wijziging van de muiskannulatietechniek, waardoor het apparaat permanent intact kan blijven gedurende de duur van het geneesmiddelenonderzoek. Dit apparaat is aangeduid als de "Murine Ommaya".
In tegenstelling tot de osmotische infusiepomptechniek, die de voorbereiding van overtollige vloeistofvolumes vereist om de lege ruimte in de slang voor te vullen en continue infusie over frequente injecties9, minimaliseert de Murine Ommaya de verspilling van medicijnoplossingen. Het maakt effectieve toediening van meerdere enkelvoudige doses behandelingen op elk gewenst moment in kleine hoeveelheden (3-7 μL) in de liquor mogelijk met behulp van een Hamilton-spuit, een miniatuurtoegangspoort en een automatische injector. In realtime kan de werkzaamheid van testgeneesmiddelen tegen LMD worden bepaald door middel van beeldvorming. Met behulp van deze aanpak kan een verscheidenheid aan chemotherapieën, antilichamen en celimmunotherapieën (als enkele of gecombineerde middelen) worden getest tegen LMD om in vivo bevindingen te vertalen in rationele behandelingsstrategieën voor patiënten. Om de beeldvormingscapaciteit voor een patiënt-afgeleid xenograft (PDX) model van LMD verder te verbeteren, werd een samenwerking aangegaan met een fabrikant om een magnetische resonantie beeldvorming (MRI) -compatibele versie van de Murine Ommaya te ontwikkelen, die geen assemblage vereist en klaar is voor gebruik. MRI-mogelijkheden zijn gunstig, vooral voor PDX-modellen waarbij de hoeveelheid circulerende tumorcellen (CTC's) van CSF soms de beperkende factor is, en vaak wanneer het vooraf labelen van CTC's onhaalbaar is.
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol dat begint met de injectie van CTC's om muizen met LMD weer te geven. De Murine Ommaya wordt vervolgens chirurgisch geïmplanteerd en meerdere medicamenteuze behandelingsstappen via de Murine Ommaya worden uitgevoerd. Als proof of concept voor demonstratie werd een in vivo side-by-side vergelijking uitgevoerd, waarbij het murine humane epidermale groeifactorreceptor 2 (Her2) antilichaam genaamd kloon 7.16.4 (het menselijke equivalent van trastuzumab) werd afgeleverd10. Het antilichaam richt zich op Her2+ borstkankercellen via de Murine Ommaya (direct gerichte of intrathecale therapie) of door intraperitoneale injectie (systemische therapie). De resultaten toonden aan dat muizen met LMD die directe intrathecale immunotherapie kregen significant langer leefden dan degenen die systemisch met dezelfde therapie werden behandeld. De CZS-metastasen bij muizen die via de Murine Ommaya werden behandeld, werden bijna volledig teruggevallen door de derde dosis van de derde week van de behandeling, wat resulteerde in een verbeterde algehele overleving.
Protocol
Het protocol werd goedgekeurd door de University of South Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IS00005974).
1. Injectie van CTC's in CSF om een LMD-model voor muizen te genereren
- Bereiding van CTC's
- Bereken het aantal CTC's dat nodig is voor injectie en bereid een eencellige suspensie voor op 1,0 ×10 4 cellen / μL in steriele fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS). Plaats de celsuspensie gedurende de hele procedure op ijs of bij 4 °C.
OPMERKING: Wanneer u cellijnen gebruikt die trypsinisatie vereisen, moet u cellen tweemaal wassen met steriel PBS om trypsine te verwijderen. Voer het aantal cellen uit met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. Als een groot cohort (>50 muizen) wordt gebruikt, hertel dan de cellen en valideer de levensvatbaarheid van de cel tussen injecties om ervoor te zorgen dat een consistent aantal cellen per muis wordt toegediend.
- Bereken het aantal CTC's dat nodig is voor injectie en bereid een eencellige suspensie voor op 1,0 ×10 4 cellen / μL in steriele fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS). Plaats de celsuspensie gedurende de hele procedure op ijs of bij 4 °C.
- Prechirurgische procedure
- Injecteer de muis subcutaan met 1 mg/kg buprenorfine met aanhoudende afgifte (Bup-SR).
OPMERKING: Injecteer het gebied van de voorgestelde incisie niet; kies een injectieplaats ver weg van de scapula. - Verdoof de muis met 2-3% isofluraan totdat deze geen tekenen van de rechtreflex vertoont. Controleer bovendien op staart- en / of pootknijperreflex om de toestand van anesthesie te bevestigen.
- Bereid de muis voor op een operatie op een locatie ver van het operatiegebied. Clip de operatieplaats (d.w.z. het dorsale oppervlak van de schedel) met voldoende randgebied om te voorkomen dat de vacht de incisieplaats verontreinigt; verzadig vervolgens de site met kiemdodend huidantisepticum, werk vanuit het midden van de site naar de periferie en laat vervolgens drogen. Breng steriel drape of een steriel plastic drapemateriaal met kleefkracht aan om de operatieplaats te beschermen tegen verontreiniging.
OPMERKING: Instrumenten moeten van tevoren worden geautoclaveerd en tips moeten opnieuw worden gesteriliseerd tussen dieren met behulp van een glazen kraalsterilisator. - Scheer de vacht van het hele ventrale oppervlak van het hoofd en bereid de huid voor met behulp van een steriele techniek.
- Situeer de neus met een gemodificeerde L-vormige neuskegel van het stereotactische apparaat, zodat de neusgaten helder en open blijven. Gebruik tape over de ventrale oppervlakken van beide pinnae, trek de huid voorzichtig naar voren om deze aan de neuskegel vast te zetten en buig de nek in een hoek van ongeveer 90 ° zodra deze is vastgezet. Dien 1,5% isofluraan toe om de anesthesie te behouden.
OPMERKING: De juiste positionering zal ertoe leiden dat het incisiegebied wordt gepresenteerd op een manier die de gemakkelijke identificatie van de caudale richel van het achterhoofdsbeen mogelijk maakt. - Plaats het lichaam om ervoor te zorgen dat de wervelkolom op gelijke hoogte wordt gehouden met de cisterna magna en plaats tijdens het aanbrengen van lichte tractie op de staartband op de staartbasis om vast te zetten.
- Injecteer de muis subcutaan met 1 mg/kg buprenorfine met aanhoudende afgifte (Bup-SR).
- Chirurgische cisterna magna injectie
- Met de nek in volledige extensie, en beginnend net tussen de pinnae, laat u de chirurgische schaarpunten naar beneden lopen met lichte druk over het achterhoofdsbeen.
OPMERKING: In deze middellijnpositie is een kleine depressie merkbaar wanneer de schaarpunten in het holle gebied over de cisterna magna duiken. - Maak een kleine 3-5 mm middellijnincisie net boven de gepalpeerde concaviteit. Trek 5 μL celsuspensie met 1,0 × 104 cellen/μL (totaal 5,0 × 104 cellen) in een Hamilton-spuit van 30 G.
- Gebruik een stompe tang met 1-2 mm tips om zachtjes op de cisterna magna te drukken. Breng tips in een gesloten positie en open ze terwijl u neerwaartse druk uitoefent op de dura.
- Herhaal stompe dissectie beschreven in de vorige stap totdat het durale membraan gemakkelijk kan worden geïdentificeerd en de bijbehorende bloedvaten zichtbaar zijn in het blootgestelde gebied.
OPMERKING: Het resulterende injectievenster zorgt ervoor dat de bloedvaten onbeschadigd zijn tijdens het inbrengen van de naald. - Terwijl u de tang openhoudt om de omringende spieren in te trekken, introduceert u een 30 G niet-coring naald onder de dura om de afschuining te visualiseren. Zorg ervoor dat de naald alleen net voorbij de schuine kant zelf wordt ingebracht. Zet langzaam een zuiger van de spuit in en lever cellen net onder de dura.
- Plaats de afschuining op de juiste manier om de injectie onder de dura te observeren. Dien de techniek zorgvuldig toe en gebruik de 30 G niet-coring naald om schade aan het membraan te voorkomen en minimale lekkage te garanderen. Als lekkage wordt opgemerkt, oefen dan zachte druk uit met een applicator met katoenen punt.
- Sluit de huid door een wondclip of microdruppel huidlijm aan te brengen. Zodra de injectie met succes is uitgevoerd, laat u de muizen herstellen van anesthesie op een warme deken, observeer ze continu totdat ze de sternale positie kunnen behouden en doelgerichte beweging kunnen laten zien.
- Controleer de muizen dagelijks na de operatie gedurende de eerste week. Als een muis pijn of angst lijkt te hebben, behandel hem dan met 10 mg / kg subcutane injectie van carprofen eenmaal per 12 tot 24 uur gedurende maximaal 5 dagen op basis van veterinair overleg en richtlijn. Laat muizen herstellen en controleer ze gedurende ten minste 48 tot 72 uur voordat u doorgaat naar de volgende stap.
OPMERKING: Bup-SR, preventief gegeven, gaat tot 72 uur mee, dus extra pijnstillers zijn normaal gesproken niet nodig. Dieren krijgen echter indien nodig extra pijnstillers (als ze lethargisch zijn, niet eten, gegolfd). Als een chirurgische site tekenen van postoperatieve infectie ontwikkelt (d.w.z. roodheid, zwelling, gevoeligheid, allodynie, hyperalgesie, hyperpathie of ettering), of als de muis het getroffen gebied bewaakt, euthanaseer de muis dan. Als kankercellen met succes in de liquor worden geïnjecteerd, zullen LMD en tumorprogressie zich binnen 1 of 2 weken in het CZS ontwikkelen (afhankelijk van de soorten CTC's of gebruikte cellijn) (figuur 1).
- Met de nek in volledige extensie, en beginnend net tussen de pinnae, laat u de chirurgische schaarpunten naar beneden lopen met lichte druk over het achterhoofdsbeen.
2. Murine Ommaya assemblage en implantatie
- Voorbereiding van het station
- Desinfecteer het oppervlak van het station. Plaats een blauwe bekleding over het oppervlak en houd alle gesteriliseerde gereedschappen en benodigdheden die in figuur 2 worden aangegeven,gereed.
- Prechirurgische procedure
- Breng analgesie (Bup-SR) aan en handhaaf de steriele techniek zoals beschreven in rubriek 1.2.
- Chirurgische implantatie van Murine Ommaya
- Monteer het Murine Ommaya-injectieapparaat met behulp van een miniatuurinjectiepoort van 25 G (0,51 mm buitendiameter) en een afstandsschijf van 1 mm. Gebruik een cyanoacrylaat steriele lijm om de penetratie van ongeveer 2,5 mm van de metalen canule in de rechter hersenhelft te garanderen (Figuur 3A-C).
OPMERKING: Een MRI-compatibel Mouse Ommaya-prototype werd ontwikkeld in dit laboratorium, dat beide onderdelen (miniatuur injectiepoort en spacer) al 3D-geprint samen als een enkele eenheid heeft(Figuur 3D). De versie met één eenheid is getest door MRI en kan tijd besparen door de montagestap te elimineren. - Verdoof de muis met 2-3% isofluraan totdat er geen tekenen van de rechtreflex zijn. Controleer verder op staart- en / of pootknijperreflex om de toestand van anesthesie te bevestigen.
- Scheer het gehele ventrale oppervlak van de kop van de vacht en bereid de huid voor volgens de steriele techniek, zoals eerder beschreven in stap 1.2.3. Plaats de muis in het stereotactische apparaat met een neuskegel om de toediening van isofluraan tijdens de procedure voort te zetten; verlaag het isofluraan tot 1,5%. Draai de oorstaven voorzichtig aan om het hoofd vast te zetten en breng oogsmeermiddel aan om de ogen van de muis te bedekken.
- Maak een kleine huidincisie (3 mm), gevolgd door stompe dissectie van de onderliggende onderhuidse weefsels om de schedel bloot te leggen. Droog de schedel met behulp van met waterstofperoxide doordrenkte applicatorsticks met wattenpunt.
- Boor een braamgat in de schedel 0,5 mm achteraan en 1,1 mm lateraal van de bregma - het anatomische punt op de schedel waar de coronale hechting loodrecht wordt doorsneden door de sagittale hechting (figuur 3A) - evenals een braamgat van 0,9 mm om de dura mater bloot te leggen. Beweeg de microdrill opzij en scoor voorzichtig het bot direct rond het braamgat voordat u een injectiepoort (diepte van ongeveer 2,5 mm) inbrengt, die met een steriele lijm van cyanoacrylaat op de schedel is aangebracht. Hechting rond de injectieplek met behulp van 4-0 nylon hechtingen zonder absorptie in een onderbroken steekpatroon of een hechting van detasstring 11.
- Huis postoperatieve muizen in individuele kooien voor operatieherstel.
OPMERKING: Het is mogelijk dat de Murine Ommaya loskomt wanneer meerdere door operaties herstelde muizen in dezelfde kooi worden gehuisvest, mogelijk als gevolg van constante manipulatie-interacties. Het wordt aanbevolen dat Murine Ommaya-geïmplanteerde muizen individueel (of niet meer dan 2 muizen per kooi) worden gehuisvest in de loop van de werkzaamheidsproef van het geneesmiddel.
- Monteer het Murine Ommaya-injectieapparaat met behulp van een miniatuurinjectiepoort van 25 G (0,51 mm buitendiameter) en een afstandsschijf van 1 mm. Gebruik een cyanoacrylaat steriele lijm om de penetratie van ongeveer 2,5 mm van de metalen canule in de rechter hersenhelft te garanderen (Figuur 3A-C).
3. Murine Ommaya behandeling
- Muizen dozen met de Murine Ommaya
- Verdoof de muis met 2-3% isofluraan, totdat er geen tekenen van rechtreflex zijn. Controleer verder op staart- en / of pootknijpreflex om het behoud van de anesthesie te bevestigen.
- Toegang tot de Murine Ommaya met behulp van een poortinjectieadapter en een Hamilton-spuit. Houd met behulp van een tang de bovenkant van de miniatuurinjectiepoort vast en steek de poortinjectoradapter voorzichtig volledig in het septum van de poort.
OPMERKING: De poortinjector doorboort het septum van de poort op een manier die dode ruimte tot een minimum beperkt en gecontroleerde injectie mogelijk maakt via een gemotoriseerde spuitpomp(figuur 4A). Gerichte/nieuwe behandelingen worden geïnjecteerd met een stroomsnelheid van 1 μL/min onder narcose. De behandeling moet worden gegeven met bepaalde tussenpozen (dagelijks / wekelijks) voor een bepaalde duur (weken / maanden), volgens de discretie van de onderzoeker.
Een volume tussen 3 en 7 μL is optimaal, omdat een volume < 3 μL onbetrouwbaar is en een volume > 7 μL te veel druk kan veroorzaken. De grootte van de Hamilton-spuit kan variëren van 10 tot 100 μL, afhankelijk van het aantal muizen in elke behandelingsarm. Door het juiste volume vooraf in de Hamilton-spuit te laden, voorkomt u herhaalde vervanging van de spuit, waardoor fouten tot een minimum worden belet. Het is het beste om 1 Hamilton-spuit per behandelingsarm te wijden. - Zodra de injectie is gemaakt, maakt u de Murine Ommaya los van de poortinjectieadapter met behulp van een tang en brengt u de muis terug naar de kooi om te herstellen van de anesthesie, zoals hierboven beschreven in stap 1.3.7.
- Euthanasie
- Euthanaseer de muizen door inademing van koolstofdioxide (CO2)uit een gecomprimeerde tankbron. Stel de muizen bloot aan toenemende concentraties CO2 (d.w.z. een verplaatsingssnelheid van 10% tot 30% van het kamervolume / min moet worden gebruikt) om ongemak of angst te voorkomen of te minimaliseren. Controleer de muizen totdat de stopzetting van cardiovasculaire en respiratoire bewegingen is verzekerd.
Representative Results
Bij muizen is het totale volume van CSF ongeveer 35-40 μL en wordt geproduceerd met een snelheid van ongeveer 350 nL / min; het draait 12-13 keer per dag12. Om de route van de injectie te visualiseren, werd 2% Evans Blue geïnjecteerd via het Murine Ommaya-model, waarna 15 minuten en 30 minuten mochten verstrijken voordat de hersenen werden geoogst voor analyse. De kleurstof infiltreerde met succes de ventrikels en de hersenen in 15 minuten. Binnen 30 minuten werd de kleurstof zichtbaar op het ruggenmerg(figuur 4).
Als proof of concept werden BALB/c-muizen geïnjecteerd met een luciferase-gelabelde Her2+ TUBO borstkanker cellijn intracisternaal, en de Murine Ommayas werden geïmplanteerd. Ongeveer 1 week na de injectie van kankercellen begonnen de muizen LMD te ontwikkelen. Deze muizen werden eenmaal per week gedurende maximaal 4 weken behandeld met Her2-antilichaam immunotherapie, hetzij via systemische therapie via intraperitoneale injectie of intrathecaal via de Murine Ommaya(figuur 5A).
Hoewel onbehandelde muizen op dag 19 stierven, overleefden alle muizen die intrathecale therapie kregen via de Murine Ommaya(P = 0,004). In week 4 werd een volledige regressie van tumoren waargenomen. In vergelijking met muizen die werden behandeld met systemische therapie, die matig succes hadden bij de behandeling van LMD, hadden muizen die intrathecale therapie kregen een veel langere algehele overleving(figuur 5B).
Figuur 1: Injectie van circulerende tumorcellen in de cisterna magna in een murine xenograft model om leptomeningeale ziekte en metastasen van het centrale zenuwstelsel te bestuderen. ( A )Eenillustratie van de locatie van de cisterna magna en de csf-toegangsplaats, waarin CTC's worden geïnjecteerd met behulp van een Hamilton-spuit. (B)Een representatief IVIS-beeld van muizen die leptomeningeale ziekte en metastasen van het centrale zenuwstelsel (hersenen en langs het ruggenmerg) hadden ontwikkeld na 2 weken injectie met circulerende tumorcellen. Cellen werden gelabeld met een luciferase reporter gen. Controledieren geïnjecteerd met zoutoplossing ontwikkelden geen tumoren (n = 3) en het experiment werd in drievoud uitgevoerd. Afkortingen: CTC's = circulerende tumorcellen; IVIS = in vivo beeldvormingssysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een voorbeeld van een werkstationopstelling voor het uitvoeren van de Murine Ommaya-implantatie bij muizen. (1) Gas anesthesie apparaat/vaporizer. (2) Steriel blauw papier draperen dat een stereotaxische standaard bedekt. (3) Stereotaxisch apparaat (standaard / podium, oorstaven, neuskegel). (4) Microdrill. (5) Vergrootglas met licht. (6) Steriele applicatorsticks met katoenen tappen en steriele zoutoplossingspoelcontainer. (7) Waterstofperoxide. (8) Kraalsterilisator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De implantatie van het Murine Ommaya-apparaat. (A) Een illustratie met een pijl die wijst op de locatie van de bregma op de schedel, en de geschatte afstand waarop een braamgat in de schedel wordt geboord (0,5 mm achteraan / 1,1 mm lateraal) van de bregma met behulp van een microdrill. (B) Een Murine Ommaya wordt geassembleerd door een metalen canule en een afstandslijn van 1 mm te combineren als basis voor lijmbevestiging aan de schedel. (C) Representatieve beelden van muizen die Murine Ommayas hadden geïmplanteerd; deze muizen worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat ze helder, alert en reactief zijn voordat ze injecties krijgen. (D) Een voorbeeld van het prototype magnetische resonantie beeldvorming-compatibele Murine Ommaya en representatieve hersenen magnetische resonantie beeldvorming beelden van Murine Ommaya implantaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Intraventriculaire (centraal zenuwstelsel) injectie met behulp van de Murine Ommaya. (A) Een beeld van een injectie, toegang tot de ventrikel en het centrale zenuwstelsel via de Murine Ommaya. Muizen blijven onder narcose tijdens de injectie. In het voorbeeld is de Murine Ommaya verbonden met de miniatuurpoort die is bevestigd aan een voorgevulde Hamilton-spuit. Injecties worden uitgevoerd met behulp van een automatische injectieset met een infusiesnelheid van 1 μL/min en een volume van 5-7 μL. Een afbeelding van een muizenbrein geïnjecteerd met Evans Blue wordt getoond. De cirkel laat zien waar de Murine Ommaya was bevestigd. Er werd geen lekkage van de kleurstof waargenomen aan de buitenkant van de hersenen. Een dwarsdoorsnede van de hersenen laat zien dat de laterale ventrikels gevuld waren met de kleurstof; de kleurstof drong niet door in het parenchym van de hersenen. (B)Beelden van muizenhersenen na 15 en 30 min na de injectie van Evans Blue dye. De kleurstof infiltreerde de hersenen (15 min) en begon te circuleren op het ruggenmerg (30 min). Van de 5 muizen kregen er 4 kleurstof voor visualisatie en 1 diende als controle. Het experiment werd in drievoud herhaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Direct gerichte immunotherapie met behulp van de Murine Ommaya verhoogt de totale overleving van borstkanker-geassocieerde leptomeningeale ziekte muizen. (A) BALB / c muizen werden geïnjecteerd met luciferase reporter-gelabelde menselijke epidermale groeifactor receptor 2-positieve TUBO cellen, een murine borstkanker cellijn. Drie dagen na cisterna magna-injecties werden Murine Ommayas geïmplanteerd. Muizen begonnen 1 week na injectie leptomeningeale ziekte (LMD) te ontwikkelen. LMD-muizen werden systemisch behandeld met een humaan epidermaal groeifactorreceptorantilichaam via intraperitoneale injectie of via intrathecaal (Murine Ommaya) als een direct gerichte aanpak. Injecties werden eenmaal per week gegeven gedurende maximaal 4 weken. In vergelijking met onbehandelde muizen overleefden muizen die immunotherapie kregen veel langer. Murine Ommaya-muizen hadden volledige ziekteregressie tegen de vierde week en deze muizen werden uiteindelijk genezen van ziekte. (B) Deze muizen hadden ook een significant betere mediane overleving (Mantel-Cox-test; P = 0,004; n = 5 muizen per behandelingsarm) en een betere algehele overleving dan systematisch behandelde LMD-muizen. Afkortingen: LMD = leptomeningeal disease; IP = intraperitoneaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier is de Murine Ommaya beschreven als een betrouwbaar model, dat herhaalde toediening van antikankermiddelen in de CSF-ruimte mogelijk maakt in preklinische modellen van LMD en andere CZS-gerelateerde ziekten. CSF werd bemonsterd van muizen terwijl het apparaat nog steeds zonder onderbreking was bevestigd. Dit direct-gerichte xenografttherapiemodel is een belangrijke stap in het ontwikkelen en testen van rationele behandelingsstrategieën voor LMD. De tijd van cisterna magna-injecties tot het eerste teken van LMD-ontwikkeling varieert afhankelijk van het type kankercel. LMD- en CZS-metastasen beginnen zich rond 1 of 2 weken na CTC-inenting te vormen. Als een zeer proliferatieve kankercellijn wordt gebruikt, is het mogelijk dat metastase kan optreden in <7 dagen. In dit geval kan vascularisatie als gevolg van tumorgroei de implantatie van de Murine Ommaya soms een uitdaging maken. Een oplossing voor deze uitdaging is om het aantal kankercellen voor injectie in de CSF-ruimte te verminderen, waardoor er meer tijd is voor de ontwikkeling van de tumor. Bovendien is dit protocol geoptimaliseerd om de Murine Ommaya uiterlijk 72 uur na de cisterna magna-injectie te implanteren om ervoor te zorgen dat muizen voldoende tijd hebben om te herstellen van de operatie vóór de eerste behandeling. Onderzoekers moeten de groeisnelheid van de CTC's in xenograftmodellen berekenen voordat ze het behandelingsregime plannen.
Hoewel er andere directe intraventriculaire toedieningsmethoden zijn, zoals het gebruik van een osmotisch pompsysteem of een intracerebroventriculaire (ICV) bolusinjectie, zoals eerder beschreven9, zijn er verschillende voordelen aan het gebruik van het Murine Ommaya-model. Een ICV-bolusinjectie wordt bijvoorbeeld in één enkele bevalling gedaan, terwijl de Murine Ommaya op elk moment meerdere doses behandeling mogelijk maakt, ongeacht of deze als een enkel middel of als gecombineerde therapieën worden gegeven. De osmotische pomp is ontworpen om tot 14, 28 of 42 dagen mee te gaan voordat de pomp moet worden vervangen, en soms vaker als een kleinere muis met een kleinere pomp wordt gebruikt. Het veranderen van de osmotische pomp vereist een chirurgische ingreep, die stress toevoegt aan tumordragende muizen. Een Murine Ommaya-vervanging is niet nodig voor langdurige experimenten zolang het apparaat intact blijft. Het minimaliseert ook de potentiële variabiliteit die het gevolg is van het veranderen van de pomp9. Geïmplanteerde Murine Ommayas in de experimentele muizen bleef langer dan 42 dagen intact en deze duur maakte langlevende behandelingsregimes mogelijk.
Eerdere bevindingen suggereren dat een pulsatiele intermitterende toediening in de liquor een betere werkzaamheid tegen LMD heeft dan een langdurig medicijnafgifteproces door infusie13. Het zou onmogelijk zijn om herhaalde injecties met één dosis uit te voeren met behulp van het osmotische pompsysteem. Er is geen eenvoudige manier om de resterende opgesloten vloeistof na elke injectie weg te spoelen. De osmotische pomp is ook beperkt tot het leveren van mengsels van compatibele of afzonderlijke geneesmiddelen en vereist doorgaans hogere volumes van medicijnbereiding voor continue infusie. Daarentegen is de Murine Ommaya ontworpen voor nauwkeurige micro-injecties van slechts 3 tot 7 μL, zonder rekening te hoeven houden met dode ruimte, en er is geen beperking op het type medicijnen dat onderzoekers kunnen gebruiken, inclusief immuunceltherapie. De Murine Ommaya minimaliseert ook reagensafval als een bepaald monster kostbaar is en maximaliseert het gebruik van die bron. Voor elk behandelingsregime dat meerdere doses antikankertherapieën vereist, is de Murine Ommaya gemakkelijk te gebruiken en is er een minimaal risico op infectie of chirurgisch ongeluk, met de alternatieve benaderingen van herhaaldelijk toegang tot de liquor chirurgisch of via herhaalde toediening met een naald. De Murine Ommaya biedt onderzoekers de flexibiliteit om medicijnconcentraties en dosingfrequenties aan te passen en om doelmodulatie en duur van het onderzoek te beoordelen op basis van het onderzoek van belang.
Een beperking van de Murine Ommaya is dat onderzoekers het moeilijk kunnen vinden om het apparaat in kleinere muizen te implanteren. Daarom is het beter om muizen te gebruiken die minstens 8 tot 10 weken oud zijn. Het is mogelijk dat de Murine Ommaya loskomt tijdens de behandelingsproef als het apparaat tijdens de implantatiestappen niet aan de schedel is bevestigd en de lijm slijt, of als de muizen er schurend mee hebben geknoeid. Het laatste scenario komt vaker voor wanneer meerdere muizen in dezelfde kooi werden gehuisvest. Daarom wordt aanbevolen om niet meer dan twee Murine Ommaya-geïmplanteerde muizen per kooi te huisvesten voor de duur van het behandelingsschema. Dit protocol werd aangepast om cyanoacrylaat steriele lijm op de afstandsbeker aan te brengen, wat de meest effectieve lijm bleek te zijn om de afstandsruimte aan het schedeloppervlak te hechten en te voorkomen dat de Murine Ommaya loskwam. De resultaten toonden aan dat LMD-muizen baat had bij directe intrathecale therapie via de Murine Ommaya, met een verhoogde algehele overleving. Enkele microlitervolumes kunnen veilig worden toegediend, waarbij de BBB wordt omzeild, waardoor de hoeveelheid geneesmiddelpreparaat wordt verminderd. Het belangrijkste is dat de muizen die werden genezen van CZS-metastasen uit de Her2-antilichaam immunotherapiestudie gezond zijn gebleven.
Een samenwerking met een fabrikant had als doel een MRI-compatibele versie van de Murine Ommaya te ontwikkelen voor het PDX-model van LMD. Omdat deze prototypeversie een afstandsruimte heeft ingebouwd, is er geen montage nodig, waardoor een betere hechting aan de schedel mogelijk is. Een beperking van dit prototype is dat hoewel het apparaat MRI-compatibel is, het een schaduw genereert waar het apparaat wordt ingebracht, wat de zichtbaarheid van het beeld voor kwantificeringsanalyses vermindert. De MRI-compatibele versie is een goed alternatief hulpmiddel wanneer ex vivo CTC-bemonstering een beperkende factor is en het vooraf labelen van cellen niet haalbaar is. De combinatie van een LMD xenograft model en de Murine Ommaya techniek is gunstig voor het bestuderen van direct-gerichte drug werkzaamheid die de BBB omzeilt. De resultaten van deze in vivo studies zijn klinisch relevant voor het ontwerpen van rationele therapeutische strategieën voor patiënten met LMD.
Disclosures
Peter Forsyth is lid van adviesraden voor Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen en Ziopharm, buiten het ingediende werk. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson en de rest van het Comparative Medicine-team van de Universiteit van Zuid-Florida bedanken voor hun technische ondersteuning en het onderhoud van onze dieren. We bedanken Instech Laboratories, Inc. voor hun inspanningen om met ons samen te werken op basis van ons verzoek om een MRI-compatibele Murine Ommaya te ontwikkelen. Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (aan K.S.M. Smalley), Department of Defense (DOD) W81XWH1910675 (aan B. Czerniecki en P. Kalinski), en de Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (aan P. Forsyth en D. Duckett). Redactionele assistentie werd verleend door het Moffitt Cancer Center's Office of Scientific Writing door Dr. Paul Fletcher en Daley Drucker. Er werd geen vergoeding gegeven buiten hun reguliere salarissen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C. Leptomeningeal metastasis. Current Opinion in Neurology. 22 (6), 665-674 (2009).
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), Suppl 2 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiments. (75), e50265 (2013).
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
