يتم تنظيم الجينوم في الفضاء النووي في هياكل مختلفة يمكن الكشف عنها من خلال تقنيات التقاط تكوين الكروموسومات. توفر طريقة Hi-C في النواة مجموعة على مستوى الجينوم من تفاعلات الكروماتين في خطوط خلايا Drosophila ، والتي تولد خرائط اتصال يمكن استكشافها بدقة megabase على مستوى جزء التقييد.
يتم تنظيم الجينوم في مجالات ربط طوبولوجية (TADs) محددة بحدود تعزل التفاعلات بين المجالات. وفي دروسوفيلا، لا تزال الآليات الكامنة وراء تكوين هذا المرض وحدوده قيد التحقيق. ساعد تطبيق طريقة Hi-C في النواة الموصوفة هنا على تشريح وظيفة مواقع الربط للبروتين المعماري (AP) عند حدود TAD التي تعزل جين Notch. يؤدي التعديل الوراثي لحدود النطاقات التي تسبب فقدان APs إلى دمج TAD ، والعيوب النسخية ، والتعديلات الطوبولوجية طويلة المدى. وقدمت هذه النتائج أدلة تثبت مساهمة العناصر الوراثية في تكوين حدود النطاق والتحكم في التعبير الجيني في دروسوفيلا. هنا، تم وصف طريقة Hi-C في النواة بالتفصيل، والتي توفر نقاط تفتيش مهمة لتقييم جودة التجربة جنبا إلى جنب مع البروتوكول. كما تظهر الأعداد المطلوبة من قراءات التسلسل وأزواج Hi-C الصالحة لتحليل التفاعلات الجينومية على نطاقات جينومية مختلفة. ويمكن أن يكون التحرير الجيني بوساطة CRISPR/Cas9 للعناصر التنظيمية والتنميط عالي الاستبانة للتفاعلات الجينية باستخدام هذا البروتوكول Hi-C في النواة مزيجا قويا للتحقيق في الوظيفة الهيكلية للعناصر الوراثية.
في eukaryotes ، يتم تقسيم الجينوم إلى كروموسومات تحتل مناطق محددة في الفضاء النووي خلال مرحلة ما بين المراحل1. يمكن تقسيم الكروماتين الذي يشكل الكروموسومات إلى ولايتين رئيسيتين: واحدة من الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه والمتساهل نسخيا ، والآخر من الكروماتين المضغوط القمعي النسخي. هذه الدول الكروماتين فصل ونادرا ما تختلط في الفضاء النووي، وتشكيل اثنين من مقصورات متميزة في النواة2. على مقياس قاعدة تحت megabase، حدود مجالات منفصلة من التفاعلات الكروماتين عالية التردد، ودعا TADs، التي علامة المنظمة الكروموسومية3،4،5. في الثدييات، وتحتل حدود TAD من قبل عامل التماسك وCCTC ملزمة (CTCF)6،7،8. المجمع التماسك ينقذ الكروماتين وتوقف في مواقع الربط CTCF التي يتم التخلص منها في اتجاه متقارب في تسلسل الجينوم لتشكيل حلقات الكروماتين مستقرة9،10،13،14. اضطراب وراثي من موقع ربط الحمض النووي CTCF عند الحدود أو الحد من CTCF ووفرة البروتين التماسك النتائج في تفاعلات غير طبيعية بين العناصر التنظيمية، وفقدان تشكيل TAD، والتعبير الجيني إلغاء الضوابطالتنظيمية 9،10،11،13،14.
في Drosophila ، تحتل الحدود بين TADs العديد من APs ، بما في ذلك عامل عنصر الحدود المرتبط 32 kDa (BEAF-32) ، Motif 1 بروتين ملزم (M1BP) ، بروتين سنتروسومي 190 (CP190) ، مثبط للأجنحة المشعرة (SuHW) ، و CTCF ، ويتم إثراء في تعديلات الهستون النشطة وبوليميراز الثاني16،17،18. وقد اقترح أن في Drosophila، TADs تظهر نتيجة للنسخ13،17،19، والدور الدقيق لAPs مستقلة في تشكيل الحدود وخصائص العزل لا يزال قيد التحقيق. وبالتالي، ما إذا كانت المجالات في دروسوفيلا هي نتيجة وحيدة لتجميع مناطق من الدول النسخية المماثلة أو ما إذا كانت الجهات الراعية، بما في ذلك لجنة مكافحة الإرهاب، تساهم في تشكيل الحدود، لا تزال غير مميزة تماما. وقد أمكن استكشاف الاتصالات الجينومية بدقة عالية من خلال تطوير تكنولوجيات التقاط تكوين الكروموسومات إلى جانب تسلسل الجيل التالي. وصف بروتوكول Hi-C لأول مرة مع خطوة الربط التي أجريت “في الحل” 2 فيمحاولة لتجنب منتجات الربط الزائفة بين شظايا الكروماتين. ومع ذلك، أشارت العديد من الدراسات إلى إدراك أن الإشارة المفيدة في البيانات جاءت من منتجات الربط التي تشكلت في نواة مشقوقة جزئيا لم تكن في الحل20،21.
ثم تم تعديل البروتوكول لتنفيذ الربط داخل النواة كجزء من تجربة Hi-C أحادية الخلية22. تم دمج بروتوكول Hi-C في النواة لاحقا في مجموعة الخلايا Hi-C لتحقيق تغطية أكثر اتساقا على النطاق الكامل للمسافات الجينومية وإنتاج بيانات ذات ضوضاء تقنية أقل23و24. ويستند البروتوكول، الموصوف بالتفصيل هنا، على السكان في النواة مرحبا-C بروتوكول23،24، وكان يستخدم للتحقيق في عواقب إزالة وراثيا زخارف الحمض النووي ملزمة لC CTCF و M1BP من حدود المجال في مكان الجين نوتش في Drosophila25. تظهر النتائج أن تغيير الزخارف الملزمة للحمض النووي ل APs عند الحدود له عواقب وخيمة على تكوين نطاق Notch ، وعيوب طوبولوجية أكبر في المناطق المحيطة بموضع Notch ، وإلغاء تحرير التعبير الجيني. وهذا يشير إلى أن العناصر الوراثية عند حدود المجال مهمة للحفاظ على طبولوجيا الجينوم والتعبير الجيني في Drosophila25.
وقد سمحت طريقة Hi-C في النواة المعروضة هنا بالاستكشاف التفصيلي لطبولوجيا الجينوم Drosophila بدقة عالية ، مما يوفر رؤية للتفاعلات الجينومية على نطاقات جينومية مختلفة ، من حلقات الكروماتين بين العناصر التنظيمية مثل المروجين والمحسنات إلى TADs وتحديد المقصورة الكبيرة25. كما تم تطبيق نف…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل برنامج دعم التكنولوجيا والبحوث التابع للبعثة رقم المنحة IN207319 ورقم منحة المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT-FORDECyT) 303068. أ.إ.ل. هو طالب ماجستير بدعم من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (كوناسي) رقم CVU 968128.
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
Cut Smart | NEB | B72002S | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
Ligation Buffer | NEB | B020S | |
MboI enzyme | NEB | R0147M | |
NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
RNAse | Roche | 10109142001 | |
SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |