Summary

Hi-C en el núcleo en células de Drosophila

Published: September 15, 2021
doi:

Summary

El genoma está organizado en el espacio nuclear en diferentes estructuras que pueden revelarse a través de tecnologías de captura de conformación cromosómica. El método Hi-C en el núcleo proporciona una colección de interacciones de cromatina en líneas celulares de Drosophila en todo el genoma, que genera mapas de contacto que se pueden explorar a resolución de megabase a nivel de fragmento de restricción.

Abstract

El genoma está organizado en dominios topológicamente asociativos (TADs) delimitados por límites que aíslan las interacciones entre dominios. En Drosophila, los mecanismos subyacentes a la formación y los límites de TAD aún están bajo investigación. La aplicación del método Hi-C en el núcleo descrito aquí ayudó a diseccionar la función de los sitios de unión a proteínas arquitectónicas (AP) en los límites de TAD aislando el gen Notch. La modificación genética de los límites del dominio que causan la pérdida de AP da como resultado la fusión de TAD, defectos transcripcionales y alteraciones topológicas de largo alcance. Estos resultados proporcionaron evidencia que demuestra la contribución de los elementos genéticos a la formación de límites de dominio y al control de la expresión génica en Drosophila. Aquí, se ha descrito en detalle el método Hi-C en el núcleo, que proporciona puntos de control importantes para evaluar la calidad del experimento junto con el protocolo. También se muestran los números requeridos de lecturas de secuenciación y pares Hi-C válidos para analizar las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas. La edición genética mediada por CRISPR/Cas9 de elementos reguladores y el perfil de alta resolución de las interacciones genómicas utilizando este protocolo Hi-C en el núcleo podrían ser una combinación poderosa para la investigación de la función estructural de los elementos genéticos.

Introduction

En los eucariotas, el genoma se divide en cromosomas que ocupan territorios específicos en el espacio nuclear durante la interfase1. La cromatina que forma los cromosomas se puede dividir en dos estados principales: uno de cromatina accesible que es transcripcionalmente permisiva, y el otro de cromatina compacta que es transcripcionalmente represiva. Estos estados de cromatina segregan y rara vez se mezclan en el espacio nuclear, formando dos compartimentos distintos en el núcleo2. En la escala sub-megabase, los límites separan los dominios de las interacciones de cromatina de alta frecuencia, llamadas TADs, que marcan la organización cromosómica3,4,5. En los mamíferos, los límites tad están ocupados por la cohesina y el factor de unión a CCCTC (CTCF)6,7,8. El complejo de cohesina extruye la cromatina y se detiene en los sitios de unión a CTCF que se disponen en una orientación convergente en la secuencia genómica para formar bucles de cromatina estables9,10,13,14. La alteración genética del sitio de unión al ADN de CTCF en los límites o la reducción de la abundancia de CTCF y proteína de cohesina da como resultado interacciones anormales entre los elementos reguladores, la pérdida de la formación de TAD y la desregulación de la expresión génica9,10,11,13,14.

En Drosophila, los límites entre los TADs están ocupados por varios AP, incluyendo el factor asociado al elemento límite 32 kDa (BEAF-32), la proteína de unión al Motivo 1 (M1BP), la proteína centrosómica 190 (CP190), el supresor del ala peluda (SuHW) y el CTCF, y están enriquecidos en modificaciones activas de histonas y polimerasa II16,17,18. Se ha sugerido que en Drosophila, los TADs aparecen como consecuencia de la transcripción13, 17,19,y el papel exacto de los AP independientes en la formación de límites y las propiedades de aislamiento aún está bajo investigación. Por lo tanto, queda por caracterizar completamente si los dominios en Drosophila son una consecuencia exclusiva de la agregación de regiones de estados transcripcionales similares o si los AP, incluido el CTCF, contribuyen a la formación de límites. La exploración de contactos genómicos a alta resolución ha sido posible a través del desarrollo de tecnologías de captura de conformación cromosómica junto con la secuenciación de próxima generación. El protocolo Hi-C se describió por primera vez con la etapa de ligadura realizada “en solución”2 en un intento de evitar productos de ligadura espurios entre fragmentos de cromatina. Sin embargo, varios estudios apuntaron a la comprensión de que la señal útil en los datos provenía de productos de ligadura formados en núcleos parcialmente lisados que no estaban en la solución20,21.

El protocolo se modificó para realizar la ligadura dentro del núcleo como parte del experimento Hi-C unicelular22. El protocolo Hi-C en el núcleo se incorporó posteriormente a la población celular Hi-C para producir una cobertura más consistente en todo el rango de distancias genómicas y producir datos con menos ruido técnico23,24. El protocolo, descrito en detalle aquí, se basa en el protocolo Hi-C de la población en el núcleo23,24 y se utilizó para investigar las consecuencias de eliminar genéticamente los motivos de unión al ADN para CTCF y M1BP de un límite de dominio en el locus del gen Notch en Drosophila25. Los resultados muestran que la alteración de los motivos de unión al ADN para los AP en el límite tiene consecuencias drásticas para la formación del dominio Notch, defectos topológicos más grandes en las regiones que rodean el locus Notch y la desregulación de la expresión génica. Esto indica que los elementos genéticos en los límites del dominio son importantes para el mantenimiento de la topología del genoma y la expresión génica en Drosophila25.

Protocol

1. Fijación Comience con 10 millones de células de la línea 2 plus (S2R+) de Schneider para preparar 17,5 ml de suspensión celular en medio Schneider que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) a temperatura ambiente (RT). Añadir formaldehído libre de metanol para obtener una concentración final del 2%. Mezclar e incubar durante 10 min en RT, teniendo cuidado de mezclar cada minuto.NOTA: El formaldehído es un producto químico peligroso. Siga las normas de salud y seguridad apropiadas,…

Representative Results

A continuación se describen los resultados de un protocolo Hi-C exitoso (consulte un resumen del flujo de trabajo del protocolo Hi-C en la Figura 1A). Hay varios puntos de control de calidad durante el experimento Hi-C en el núcleo. Las alícuotas de muestra se recogieron antes (UD) y después (D) del paso de restricción de cromatina, así como después de la ligadura (L). Los enlaces cruzados se invirtieron, y el ADN se purificó y se ejecutó en un gel de agarosa. Se observó un frotis …

Discussion

El método Hi-C en núcleo que aquí se presenta ha permitido una exploración detallada de la topología del genoma de Drosophila a alta resolución, proporcionando una visión de las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas, desde bucles de cromatina entre elementos reguladores como promotores y potenciadores hasta TADs e identificación de grandes compartimentos25. La misma tecnología también se ha aplicado eficientemente a los tejidos de mamíferos con algunas modificaciones<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la subvención número IN207319 del Programa de Apoyo a la Innovación Tecnológica y la Investigación (PAPIIT) de la UNAM y la beca número 303068 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-FORDECyT). A.E.-L. es un estudiante de maestría apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) CVU número 968128.

Materials

16% (vol/vol) paraformaldehyde solution Agar Scientific R1026
Biotin-14-dATP Invitrogen CA1524-016
ClaI enzyme NEB R0197S
COVARIS Ultrasonicator Covaris LE220-M220
Cut Smart NEB B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Life Technologies 41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 Invitrogen 65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered Sigma F9665
Klenow Dna PolI large fragment NEB M0210L
Klenow exo(-) NEB M0210S
Ligation Buffer NEB B020S
MboI enzyme NEB R0147M
NP40-Igepal SIGMA CA-420 Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0 Illumina 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0 Illumina 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0 Illumina 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0 Illumina 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 SIGMA P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) Sigma 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) Sigma 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693132001
Proteinase K Roche 3115879001
Qubit ThermoFisher Q33327
RNAse Roche 10109142001
SPRI Beads Beckman B23318
T4 DNA ligase Invitrogen 15224-025
T4 DNA polymerase NEB M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)  NEB M0201L
TaqPhusion NEB M0530S DNA polymerase
Triton X-100 Non-ionic surfactant for quenching of SDS

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
  36. Ong, C. -. T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

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Cite This Article
Esquivel-López, A., Arzate-Mejía, R., Pérez-Molina, R., Furlan-Magaril, M. In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells. J. Vis. Exp. (175), e62106, doi:10.3791/62106 (2021).

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