Genom, nükleer uzayda kromozom konformasyon yakalama teknolojileri ile ortaya sunulabilen farklı yapılara düzenlenmiştir. Çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila hücre hatlarında, kısıtlama parçası düzeyinde megabase çözünürlükte keşfedilebilen temas haritaları üreten, genom çapında bir kromatin etkileşimi koleksiyonu sağlar.
Genom, etki alanları arasındaki etkileşimleri yalıtlayan sınırlarla sınırlandırılmış topolojik olarak ilişkili etki alanları (TAD’ ler) halinde düzenlenmiştir. Drosophila’da TAD oluşumu ve sınırlarının altında kalan mekanizmalar halen araştırılmaktadır. Burada açıklanan çekirdek içi Hi-C yönteminin uygulanması, Çentik genini izole eden TAD sınırlarında mimari protein (AP) bağlayıcı bölgelerin işlevinin parçalanarak parçalanmasına yardımcı oldu. APS kaybına neden olan etki alanı sınırlarının genetik modifikasyonu TAD füzyonu, transkripsiyon kusurları ve uzun menzilli topolojik değişikliklerle sonuçlanır. Bu sonuçlar, Drosophila’da genetik elementlerin etki alanı sınır oluşumuna ve gen ekspresyon kontrolüne katkısını gösteren kanıtlar sağlamıştır. Burada, protokolle birlikte deneyin kalitesini değerlendirmek için önemli kontrol noktaları sağlayan çekirdek içi Hi-C yöntemi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ayrıca, farklı genomik ölçeklerdeki genomik etkileşimleri analiz etmek için gerekli sayıda sıralama okuması ve geçerli Hi-C çiftleri gösterilmiştir. CRISPR/Cas9 aracılı genetik düzenleme düzenleyici unsurların ve bu çekirdek içi Hi-C protokolü kullanılarak genomik etkileşimlerin yüksek çözünürlüklü profillenmesi, genetik elementlerin yapısal işlevinin araştırılması için güçlü bir kombinasyon olabilir.
Ökaryotlarda, genom, ara faz1sırasında nükleer alandaki belirli bölgeleri işgal eden kromozomlara bölünür. Kromozomları oluşturan kromatin iki ana hale ayrılabilir: biri transkripsiyonel olarak izin verilen erişilebilir kromatin ve diğeri transkripsiyonel olarak baskıcı olan kompakt kromatin. Bu kromatin durumları nükleer uzayda ayrışır ve nadiren karışır, çekirdekte iki ayrı bölme oluşturur2. Alt megabase ölçeğinde, sınırlar, kromozomal kuruluş3,4,5‘i işaretleyen TAD adı verilen yüksek frekanslı kromatin etkileşimlerinin etki alanlarını ayırır. Memelilerde, TAD sınırları cohesin ve CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF)6,7,8tarafından işgal edilir. Cohesin kompleksi kromatin ekstrüzyonları ve kararlı kromatin döngüleri oluşturmak için genomik dizideki yakınsak bir yönde bertaraf edilen CTCF bağlayıcı bölgelerde durur9,10,13,14. CTCF DNA bağlayıcı bölgenin sınırlarda genetik bozulması veya CTCF ve cohesin protein bolluğunda azalma, düzenleyici elementler arasında anormal etkileşimlere, TAD oluşumu kaybına ve gen ekspresyon deregülasyonuna neden olur9,10,11,13,14.
Drosophila’da, TAD’ler arasındaki sınırlar, sınır elemanı ile ilişkili faktör 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bağlayıcı protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), kıllı kanadın baskılayıcısı (SuHW) ve CTCF dahil olmak üzere çeşitliAP’ler tarafından işgal edilir ve aktif histone modifikasyonları ve Polymerase II16,17,18ile zenginleştirilir. Drosophila’da, TAD’lerin transkripsiyon13 , 17,19’unbir sonucu olarak ortaya çıktığı ve bağımsız AS’lerin sınır oluşumu ve yalıtım özelliklerindeki tam rolünün hala araştırıldığu ileri sürlenmiştir. Bu nedenle, Drosophila’daki etki alanlarının benzer transkripsiyon durumlarındaki bölgelerin toplanmasının tek sonucu olup olmadığı veya CTCF de dahil olmak üzere AP’lerin sınır oluşumuna katkıda bulunup bulunmadığı tam olarak karakterize olmaya devam etmektedir. Genomik temasların yüksek çözünürlükte araştırılması, kromozom konformasyon yakalama teknolojilerinin geliştirilmesi ve yeni nesil dizileme ile mümkün olmuştur. Hi-C protokolü ilk olarak kromatin parçaları arasında sahte ligasyon ürünlerini önlemek amacıyla “çözeltide”2 gerçekleştirilen ligasyon adımı ile tanımlanmıştır. Bununla birlikte, birkaç çalışma, verilerdeki yararlı sinyalin, çözelti20,21’deolmayan kısmen lile çekirdeklerinde oluşturulan ligasyon ürünlerinden geldiğinin farkına işaret etti.
Protokol daha sonra tek hücreli Hi-C deneyi22’ninbir parçası olarak çekirdeğin içindeki ligasyonu gerçekleştirmek için değiştirildi. Çekirdek içi Hi-C protokolü daha sonra tüm genomik mesafelerde daha tutarlı bir kapsama alanı sağlamak ve daha az teknik gürültü ile veri üretmek için hücre popülasyonuHi-C’yedahil edildi23,24. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, çekirdek içi Hi-C protokolü23,24’e dayanmaktadır ve CTCF ve M1BP için DNA bağlayıcı motiflerin Drosophila25’teki Çentik gen çekirgesinde bir etki alanı sınırından genetik olarak çıkarılmasının sonuçlarını araştırmak için kullanılmıştır. Sonuçlar, sınırdaki AP’ler için DNA bağlayıcı motiflerin değiştirilmesinin Çentik etki alanı oluşumu, Çentik çekirgesini çevreleyen bölgelerde daha büyük topolojik kusurlar ve gen ekspresyon deregülasyonu için büyük sonuçlar doğurdığını göstermektedir. Bu, etki alanı sınırlarındaki genetik elementlerin Drosophila25’tegenom topolojisinin ve gen ekspresyonunun sürdürülmesi için önemli olduğunu gösterir.
Burada sunulan çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila genom topolojisinin yüksek çözünürlükte ayrıntılı olarak araştırılmasına izin verdi, farklı genomik ölçeklerdeki genomik etkileşimlerin bir görünümünü sağladı, organizatörler ve arttırıcılar gibi düzenleyici elementler arasındaki kromatin döngülerinden TAD’lere ve büyük bölmetanımlamasına 25. Aynı teknoloji bazı değişikliklerle memeli dokularına da verimli bir şekilde uygulanmıştır<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma UNAM Teknoloji Yenilik ve Araştırma Destek Programı (PAPIIT) hibe numarası IN207319 ve Bilim ve Teknoloji Ulusal Konseyi (CONACyT-FORDECyT) hibe numarası 303068 tarafından desteklendi. A.E.-L. Bilim ve Teknoloji Ulusal Konseyi (CONACyT) CVU numarası 968128 tarafından desteklenen bir yüksek lisans öğrencisidir.
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
Cut Smart | NEB | B72002S | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
Ligation Buffer | NEB | B020S | |
MboI enzyme | NEB | R0147M | |
NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
RNAse | Roche | 10109142001 | |
SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |