Геном организован в ядерном пространстве в различные структуры, которые могут быть выявлены с помощью технологий захвата конформации хромосом. Метод Hi-C в ядре обеспечивает общегеномную коллекцию взаимодействий хроматинов в клеточных линиях дрозофилы, которая генерирует контактные карты, которые могут быть исследованы с разрешением мегабазы на уровне рестстриктного фрагмента.
Геном организован в топологически ассоциирующие домены (TAD), разграниченные границами, которые изолируют взаимодействия между доменами. У дрозофилы механизмы, лежащие в основе формирования и границ TAD, все еще исследуются. Применение описанного здесь метода Hi-C в ядре помогло препарировать функцию архитектурных белковых (AP)-связывающих сайтов на границах TAD, изолируя ген Notch. Генетическая модификация границ доменов, которая вызывает потерю ТОП, приводит к слиянию TAD, транскрипционным дефектам и дальнодейственным топологическим изменениям. Эти результаты предоставили доказательства, демонстрирующие вклад генетических элементов в формирование границ домена и контроль экспрессии генов у дрозофилы. Здесь подробно описан метод Hi-C в ядре, который обеспечивает важные контрольные точки для оценки качества эксперимента вместе с протоколом. Также показано необходимое количество показанных показаний секвенирования и действительных пар Hi-C для анализа геномных взаимодействий в различных геномных масштабах. CRISPR/Cas9-опосредованное генетическое редактирование регуляторных элементов и профилирование геномных взаимодействий с высоким разрешением с использованием этого протокола Hi-C в ядре может стать мощной комбинацией для исследования структурной функции генетических элементов.
У эукариот геном разделен на хромосомы, которые занимают определенные территории в ядерном пространстве во время интерфазы1. Хроматин, образующий хромосомы, можно разделить на два основных состояния: одно из доступных хроматинов, которые являются транскрипционно разрешительными, и другое из компактного хроматина, который является транскрипционно репрессивным. Эти хроматиновые состояния отделяются и редко смешиваются в ядерном пространстве, образуя два отдельных отсека в ядре2. В масштабе субмегабазы границы разделяют области высокочастотных хроматиновых взаимодействий, называемые TADs, которые отмечают хромосомную организацию3,4,5. У млекопитающих границы TAD занимают когезионные и CCCTC-связывающий фактор (CTCF)6,7,8. Когезионный комплекс выдавливает хроматин и останавливается на CTCF-сайтах связывания, которые расположены в конвергентной ориентации в геномной последовательности с образованием стабильных хроматиновых петель9,10,13,14. Генетическое нарушение сайта связывания ДНК CTCF на границах или снижение CTCF и изобилия белка когезгена приводит к аномальным взаимодействиям между регуляторными элементами, потере образования TAD и дерегуляции экспрессии генов9,10,11,13,14.
У дрозофилы границы между TAD заняты несколькими ПП, включая граничный элемент-ассоциированный фактор 32 кДа (BEAF-32), связывающий белок Motif 1 (M1BP), центросомальный белок 190 (CP190), супрессор волосатого крыла (SuHW) и CTCF, и обогащены активными модификациями гистонов и полимеразой II16,17,18. Было высказано предположение, что у дрозофилы TAD появляются как следствие транскрипции13,17,19,и точная роль независимых ТОс в формировании границ и изоляционных свойствах все еще находится в стадии изучения. Таким образом, вопрос о том, являются ли домены у дрозофилы единственным следствием агрегации областей сходных транскрипционных состояний или же АП, включая CTCF, способствуют формированию границ, еще предстоит полностью охарактеризовать. Исследование геномных контактов с высоким разрешением стало возможным благодаря разработке технологий захвата конформации хромосом в сочетании с секвенированием следующего поколения. Протокол Hi-C был впервые описан с этапом лигирования, выполненным «в растворе»2 в попытке избежать ложных продуктов лигирования между фрагментами хроматина. Однако несколько исследований указали на осознание того, что полезный сигнал в данных исходил от продуктов лигирования, образуемых в частично лизированных ядрах, которые не находились в растворе20,21.
Затем протокол модифицировали для выполнения лигирования внутри ядра в рамках одноклеточного эксперимента Hi-C22. Протокол Hi-C в ядре был впоследствии включен в клеточную популяцию Hi-C, чтобы обеспечить более последовательное покрытие во всем диапазоне геномных расстояний и получить данные с меньшим техническим шумом23,24. Протокол, подробно описанный здесь, основан на популяционно-ядровом протоколеHi-C 23,24 и использовался для исследования последствий генетического удаления ДНК-связывающих мотивов для CTCF и M1BP с границы домена в локусе гена Notch в Drosophila25. Результаты показывают, что изменение ДНК-связывающих мотивов для ТОП на границе имеет радикальные последствия для формирования домена Notch, более крупных топологических дефектов в областях, окружающих локус Notch, и дерегуляции экспрессии генов. Это указывает на то, что генетические элементы на границах домена важны для поддержания топологии генома и экспрессии генов у Drosophila25.
Представленный здесь метод Hi-C в ядре позволил детально исследовать топологию генома дрозофилы с высоким разрешением, обеспечивая представление о геномных взаимодействиях в различных геномных масштабах, от хроматиновых петель между регуляторными элементами, такими как промоторы и э?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом Программы технологических инноваций и поддержки исследований UNAM (PAPIIT) IN207319 и грантом Национального совета по науке и технике (CONACyT-FORDECyT) номер 303068. А.Е.-Л. является студентом магистратуры при поддержке Национального совета по науке и технике (CONACyT) CVU No 968128.
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
Cut Smart | NEB | B72002S | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
Ligation Buffer | NEB | B020S | |
MboI enzyme | NEB | R0147M | |
NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
RNAse | Roche | 10109142001 | |
SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |