Summary
Genomet er organisert i atomrommet i forskjellige strukturer som kan avsløres gjennom kromosomkonformasjonsfangstteknologier. Hi-C-metoden i kjernen gir en genomomfattende samling av kromatininteraksjoner i Drosophila-cellelinjer, som genererer kontaktkart som kan utforskes med megabaseoppløsning på begrensningsfragmentnivå.
Abstract
Genomet er organisert i topologisk assosierende domener (TADs) avgrenset av grenser som isolerer interaksjoner mellom domener. I Drosophila er mekanismene som ligger til grunn for TAD-dannelsen og grensene fortsatt under etterforskning. Anvendelsen av hi-c-metoden som er beskrevet her, bidro til å dissekere funksjonen til arkitektoniske proteiner (AP)-bindende steder ved TAD-grenser som isolerer Notch-genet. Genetisk modifikasjon av domenegrenser som forårsaker tap av APs resulterer i TAD-fusjon, transkripsjonsfeil og langtrekkende topologiske endringer. Disse resultatene ga bevis som viste bidraget av genetiske elementer til domenegrensedannelse og genuttrykkskontroll i Drosophila. Her er hi-C-metoden beskrevet i detalj, noe som gir viktige sjekkpunkter for å vurdere kvaliteten på eksperimentet sammen med protokollen. Også vist er det nødvendige antall sekvenseringslesninger og gyldige Hi-C-par for å analysere genomiske interaksjoner på forskjellige genomiske skalaer. CRISPR/Cas9-mediert genetisk redigering av regulatoriske elementer og høyoppløselig profilering av genomiske interaksjoner ved hjelp av denne hi-C-protokollen i kjernen kan være en kraftig kombinasjon for undersøkelse av genetiske elementers strukturelle funksjon.
Introduction
I eukaryoter er genomet delt inn i kromosomer som okkuperer spesifikke territorier i atomrommet under interfase1. Kromatinet som danner kromosomene kan deles inn i to hovedtilstander: en av tilgjengelige kromatin som er transkripsjonelt tillatt, og den andre av kompakt kromatin som er transkripsjonelt undertrykkende. Disse kromatinstatene segregate og blander sjelden i atomrommet, danner to forskjellige rom i kjernen2. I skalaen sub-megabase skiller grenser domener med høyfrekvente kromatininteraksjoner, kalt TADer, som markerer kromosomal organisasjon3,4,5. Hos pattedyr er TAD-grenser okkupert av cohesin og CCCTC-bindende faktor (CTCF)6,7,8. Cohesin-komplekset ekstruderer kromatin og stopper på CTCF-bindende steder som avhendes i en konvergent orientering i den genomiske sekvensen for å danne stabile kromatinløkker9,10,13,14. Genetisk forstyrrelse av CTCF DNA-bindende sted ved grensene eller reduksjon i CTCF og cohesin protein overflod resulterer i unormale interaksjoner mellom regulatoriske elementer, tap av TAD-dannelse, og genuttrykk deregulering9,10,11,13,14.
I Drosophila, Grensene mellom TADs er okkupert av flere APer, inkludert grenseelement-assosiert faktor 32 kDa (BEAF-32), Motiv 1 bindende protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), undertrykker av hårete vinge (SuHW) og CTCF, og er beriket i aktive histone modifikasjoner og Polymerase II16,17,18 ,18. Det har blitt antydet at i Drosophila vises TADs som følge av transkripsjon13,17,19, og den nøyaktige rollen til uavhengige APer i grensedannelse og isolasjonsegenskaper er fortsatt under etterforskning. Hvorvidt domener i Drosophila er en eneste konsekvens av aggregering av regioner med lignende transkripsjonstilstander eller om APs, inkludert CTCF, bidrar til grensedannelse, gjenstår å være fullt karakterisert. Utforskning av genomiske kontakter med høy oppløsning har vært mulig gjennom utvikling av kromosomkonformasjonsfangstteknologier kombinert med neste generasjons sekvensering. Hi-C-protokollen ble først beskrevet med ligation trinn utført “i løsning”2 i et forsøk på å unngå falske ligation produkter mellom kromatin fragmenter. Flere studier pekte imidlertid på erkjennelsen av at det nyttige signalet i dataene kom fra ligasjonsprodukter dannet ved delvis lysede kjerner som ikke var i løsning20,21.
Protokollen ble deretter endret for å utføre ligasjonen inne i kjernen som en del av hi-C-eksperimentet22med én celle. Hi-C-protokollen i kjernen ble senere innlemmet i cellepopulasjonen Hi-C for å gi en mer konsistent dekning over hele spekteret av genomiske avstander og produsere data med mindre teknisk støy23,24. Protokollen, beskrevet i detalj her, er basert på populasjonen i kjernen Hi-C-protokoll23,24 og ble brukt til å undersøke konsekvensene av genetisk fjerning av DNA-bindende motiver for CTCF og M1BP fra en domenegrense ved Notch-genlocus i Drosophila25. Resultatene viser at endring av DNA-bindende motiver for APs ved grensen har drastiske konsekvenser for Notch-domenedannelse, større topologiske defekter i regionene rundt Notch-locus og genuttrykksderegulering. Dette indikerer at genetiske elementer ved domenegrenser er viktige for vedlikehold av genomtopologi og genuttrykk i Drosophila25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den in-nukleus Hi-C-metoden som presenteres her, har tillatt detaljert utforskning av Drosophila genomtopologi ved høy oppløsning, og gir utsikt over genomiske interaksjoner på forskjellige genomiske skalaer, fra kromatinløkker mellom regulatoriske elementer som promotorer og forsterkere til TADs og stor romidentifikasjon25. Den samme teknologien har også blitt effektivt brukt på pattedyrvev med noen modifikasjoner33. For eksempel, når du behandler et vev i stedet fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) tilskuddsnummer IN207319 og Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) tilskuddsnummer 303068. A.E.-L. er en masterstudent støttet av Science and Technology National Council (CONACyT) CVU nummer 968128.
Materials
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -. T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
