JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

In-Nucleus Hi-C i Drosophila Cells

Published: September 15, 2021
doi:
10.3791/62106
, , ,
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular,Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

Genomet er organiseret i det nukleare rum i forskellige strukturer, der kan afsløres gennem kromosom kropsbygningsfangstteknologier. In-nucleus Hi-C-metoden giver en genomdækkende samling af chromatininteraktioner i Drosophila-cellelinjer, som genererer kontaktkort, der kan udforskes ved megabaseopløsning på begrænsningsfragmentniveau.

Abstract

Genomet er organiseret i topologisk associerende domæner (TAD’er) afgrænset af grænser, der isolerer interaktioner mellem domæner. I Drosophila undersøges de mekanismer, der ligger til grund for TAD-dannelsen og -grænserne, stadig. Anvendelsen af den in-nukleus Hi-C-metode, der er beskrevet her, bidrog til at dissekere funktionen af arkitektoniske protein (AP)-bindingssteder ved TAD-grænser, der isolerer Notch-genet. Genetisk modifikation af domænegrænser, der forårsager tab af APs, resulterer i TAD-fusion, transskriptionelle defekter og langtrækkende topologiske ændringer. Disse resultater gav dokumentation for genetiske elementers bidrag til domænegrænsedannelse og genudtrykskontrol i Drosophila. Her er in-nucleus Hi-C-metoden blevet beskrevet i detaljer, hvilket giver vigtige checkpoints til at vurdere kvaliteten af eksperimentet sammen med protokollen. Også vist er de nødvendige antal sekventeringslæsninger og gyldige Hi-C-par til at analysere genomiske interaktioner på forskellige genomiske skalaer. CRISPR/Cas9-medieret genetisk redigering af regulatoriske elementer og profilering i høj opløsning af genomiske interaktioner ved hjælp af denne in-nukleus Hi-C-protokol kan være en stærk kombination til undersøgelse af genetiske elements strukturelle funktion.

Introduction

I eukaryoter er genomet opdelt i kromosomer, der besætter specifikke områder i det nukleare rum under interfase1. Kromatin danner kromosomer kan opdeles i to hovedstater: en af tilgængelige chromatin, der er transskriptionalt eftergivende, og den anden af kompakt chromatin, der er transskriptionalt undertrykkende. Disse chromatin stater adskille og sjældent blandes i det nukleare rum, danner to forskellige rum i kernen2. På sub-megabaseskalaen adskiller grænser domæner for højfrekvente chromatininteraktioner, kaldet TAD’er, der markerer kromosomal organisation3,4,5. Hos pattedyr er TAD-grænser besat af sammenhænge og CCCTC-bindende faktor (CTCF)6,7,8. Den cohesin komplekse ekstruderer chromatin og stopper ved CTCF-bindingssteder, der bortskaffes i konvergent orientering i den genomiske sekvens for at danne stabile chromatinsløjfer9,10,13,14. Genetisk forstyrrelse af CTCF DNA-bindingsstedet ved grænserne eller reduktionen af CTCF og cohesinproteintæthed resulterer i unormale interaktioner mellem regulatoriske elementer , tab afTAD-dannelseog deregulering af genekspression 9,10,11,13,14.

I Drosophila er grænserne mellem TAD’er besat af flere APs, herunder grænseelementrelateret faktor 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bindende protein (M1BP), centrosomalprotein 190 (CP190), suppressor af hårvinge (SuHW) og CTCF og beriges med aktive histoneændringer og Polymerase II16,17,18. Det er blevet foreslået, at i Drosophila vises TAD’er som en konsekvens af transskription13,17,19, og den nøjagtige rolle for uafhængige APs i grænsedannelse og isoleringsegenskaber undersøges stadig. Om domæner i Drosophila er en eneste konsekvens af sammenlægningen af regioner med lignende transskriptionsstater, eller om APs, herunder CTCF, bidrager til grænsedannelse, er således endnu ikke fuldt ud karakteriseret. Udforskning af genomiske kontakter ved høj opløsning har været mulig gennem udvikling af kromosom kropsbygningsfangstteknologier kombineret med næste generations sekventering. Hi-C-protokollen blev først beskrevet med ligationstrinnet udført “i opløsning”2 i et forsøg på at undgå falske ligationsprodukter mellem kromatinefragmenter. Flere undersøgelser pegede imidlertid på erkendelsen af, at det nyttige signal i dataene kom fra ligationsprodukter dannet ved delvist lysede kerner, der ikke var i opløsning20,21.

Protokollen blev derefter ændret til at udføre ligationen inde i kernen som en del af encellet Hi-C eksperiment22. In-nukleus Hi-C-protokollen blev efterfølgende indarbejdet i cellepopulationen Hi-C for at give en mere ensartet dækning over hele spektret af genomiske afstande og producere data med mindre teknisk støj23,24. Protokollen, der er beskrevet i detaljer her, er baseret på befolkningen i kernen Hi-C protokol23,24 og blev brugt til at undersøge konsekvenserne af genetisk fjernelse af DNA-bindende motiver for CTCF og M1BP fra en domænegrænse ved Notch genet locus i Drosophila25. Resultaterne viser, at en ændring af DNA-bindende motiver for APs på grænsen har drastiske konsekvenser for Notch domæne dannelse, større topologiske defekter i regionerne omkring Notch locus, og genekspression deregulering. Dette indikerer, at genetiske elementer ved domænegrænser er vigtige for vedligeholdelsen af genomtopologi og genekspression i Drosophila25.

Protocol

1. Fiksering Start med 10 millioner Schneiders linje 2 plus (S2R+) celler til at forberede 17,5 mL af en celleaffjedring i Schneider-mediet, der indeholder 10% føtal kvægserum (FBS) ved stuetemperatur (RT). Der tilsættes methanolfri formaldehyd for at opnå en endelig koncentration på 2 %. Bland og inkuber i 10 minutter på RT, idet du sørger for at blande hvert minut.BEMÆRK: Formaldehyd er et farligt kemikalie. Følg de relevante sundheds- og sikkerhedsbestemmelser, og arbejd i røghætten….

Representative Results

Nedenfor beskrives resultaterne af en vellykket Hi-C-protokol (se en oversigt over Hi-C-protokolarbejdsgangen i Figur 1A). Der er flere kvalitetskontrol checkpoints under in-kernen Hi-C eksperiment. Prøve aliquots blev indsamlet før (UD) og efter (D) kromatin begrænsning trin samt efter ligation (L). Crosslinks blev vendt, og DNA blev renset og kørt på en agarose gel. En smøre på 200-1000 bp blev observeret, når begrænsning med Mbo I var en succes(Figur 1B</stro…

Discussion

Den in-nukleus Hi-C-metode, der præsenteres her, har gjort det muligt detaljeret udforskning af Drosophila-genomtopologien i høj opløsning, hvilket giver et overblik over genomiske interaktioner på forskellige genomiske skalaer, fra kromatinsløjfer mellem regulerende elementer som initiativtagere og forstærkere til TAD’er og identifikation af store rum25. Den samme teknologi er også blevet anvendt effektivt på pattedyrvæv med nogle modifikationer33. For eksempel, n…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) tilskud nummer IN207319 og Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) tilskud nummer 303068. A.E.-L. er en kandidatstuderende støttet af Science and Technology National Council (CONACyT) CVU nummer 968128.

Materials

16% (vol/vol) paraformaldehyde solution Agar Scientific R1026
Biotin-14-dATP Invitrogen CA1524-016
ClaI enzyme NEB R0197S
COVARIS Ultrasonicator Covaris LE220-M220
Cut Smart NEB B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Life Technologies 41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 Invitrogen 65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered Sigma F9665
Klenow Dna PolI large fragment NEB M0210L
Klenow exo(-) NEB M0210S
Ligation Buffer NEB B020S
MboI enzyme NEB R0147M
NP40-Igepal SIGMA CA-420 Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0 Illumina 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0 Illumina 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0 Illumina 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0 Illumina 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 SIGMA P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) Sigma 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) Sigma 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693132001
Proteinase K Roche 3115879001
Qubit ThermoFisher Q33327
RNAse Roche 10109142001
SPRI Beads Beckman B23318
T4 DNA ligase Invitrogen 15224-025
T4 DNA polymerase NEB M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)  NEB M0201L
TaqPhusion NEB M0530S DNA polymerase
Triton X-100 Non-ionic surfactant for quenching of SDS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
  36. Ong, C. -. T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

Tags

Hi-CChromatin ConformationGenome OrganizationChromosomal InteractionsDrosophila CellsNuclear ClumpsFormaldehyde CrosslinkingGlycine QuenchingCell LysisRestriction Enzyme DigestionSDS PermeabilizationTriton TreatmentQuality ControlSequencing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Esquivel-López, A., Arzate-Mejía, R., Pérez-Molina, R., Furlan-Magaril, M. In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells. J. Vis. Exp. (175), e62106, doi:10.3791/62106 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image