Le génome est organisé dans l’espace nucléaire en différentes structures qui peuvent être révélées par les technologies de capture de conformation chromosomique. La méthode Hi-C dans le noyau fournit une collection à l’échelle du génome d’interactions de la chromatine dans les lignées cellulaires de la drosophile, qui génère des cartes de contact qui peuvent être explorées à la résolution de la mégabase au niveau du fragment de restriction.
Le génome est organisé en domaines topologiquement associants (TAD) délimités par des limites qui isolent les interactions entre les domaines. Chez la drosophile, les mécanismes sous-jacents à la formation et aux limites du TAD sont encore à l’étude. L’application de la méthode Hi-C dans le noyau décrite ici a permis de disséquer la fonction des sites architecturaux de liaison aux protéines (AP) aux limites TAD isolant le gène Notch. La modification génétique des limites de domaine qui cause la perte de points d’accès entraîne la fusion tad, des défauts transcriptionnels et des altérations topologiques à longue portée. Ces résultats ont fourni des preuves démontrant la contribution des éléments génétiques à la formation des limites du domaine et au contrôle de l’expression génique chez la drosophile. Ici, la méthode Hi-C dans le noyau a été décrite en détail, ce qui fournit des points de contrôle importants pour évaluer la qualité de l’expérience avec le protocole. Sont également indiqués le nombre requis de lectures de séquençage et de paires Hi-C valides pour analyser les interactions génomiques à différentes échelles génomiques. L’édition génétique des éléments régulateurs médiée par CRISPR/Cas9 et le profilage à haute résolution des interactions génomiques à l’aide de ce protocole Hi-C dans le noyau pourraient être une combinaison puissante pour l’étude de la fonction structurelle des éléments génétiques.
Chez les eucaryotes, le génome est divisé en chromosomes qui occupent des territoires spécifiques dans l’espace nucléaire pendant l’interphase1. La chromatine formant les chromosomes peut être divisée en deux états principaux: l’un de chromatine accessible qui est transcriptionnellement permissive, et l’autre de chromatine compacte qui est transcriptionnellement répressive. Ces états de chromatine se séparent et se mélangent rarement dans l’espace nucléaire, formant deux compartiments distincts dans le noyau2. À l’échelle des sous-mégabases, les limites séparent les domaines des interactions de la chromatine à haute fréquence, appelés TAM, qui marquent l’organisation chromosomique3,4,5. Chez les mammifères, les limites TAD sont occupées par la cohésine et le facteur de liaison CCCTC (CTCF)6,7,8. Le complexe de cohésine extrude la chromatine et s’arrête aux sites de liaison CTCF qui sont disposés dans une orientation convergente dans la séquence génomique pour former des boucles de chromatine stables9,10,13,14. La perturbation génétique du site de liaison à l’ADN CTCF aux limites ou la réduction de l’abondance des protéines CTCF et cohésine entraîne des interactions anormales entre les éléments régulateurs, une perte de formation de TAD et une dérégulation de l’expressiongénique 9,10,11,13,14.
Chez la drosophile, les limites entre les TAD sont occupées par plusieurs AP, y compris le facteur 32 kDa associé aux éléments limites (BEAF-32), la protéine de liaison motif 1 (M1BP), la protéine centrosomale 190 (CP190), le suppresseur d’aile velue (SuHW) et le CTCF, et sont enrichis en modifications actives des histones et en polymérase II16,17,18. Il a été suggéré que chez la drosophile, les TAD apparaissent à la suite de la transcription13 , 17,19, et le rôle exact des PO indépendants dans la formation des limites et les propriétés d’isolation est encore à l’étude. Ainsi, il reste à déterminer si les domaines de la drosophile sont la seule conséquence de l’agrégation de régions d’états transcriptionnels similaires ou si les AP, y compris le CTCF, contribuent à la formation des limites. L’exploration des contacts génomiques à haute résolution a été possible grâce au développement de technologies de capture de conformation chromosomique couplées à un séquençage de nouvelle génération. Le protocole Hi-C a été décrit pour la première fois avec l’étape de ligature effectuée « en solution »2 dans le but d’éviter les produits de ligature fallacieux entre les fragments de chromatine. Cependant, plusieurs études ont montré que le signal utile dans les données provenait de produits de ligature formés à des noyaux partiellement lysés qui n’étaient pas en solution20,21.
Le protocole a ensuite été modifié pour effectuer la ligature à l’intérieur du noyau dans le cadre de l’expérience Hi-C unicellulaire22. Le protocole Hi-C dans le noyau a ensuite été incorporé dans la population cellulaire Hi-C pour produire une couverture plus cohérente sur toute la gamme des distances génomiques et produire des données avec moins de bruit technique23,24. Le protocole, décrit en détail ici, est basé sur le protocole Hi-C de population dans le noyau23,24 et a été utilisé pour étudier les conséquences de l’élimination génétique des motifs de liaison à l’ADN pour CTCF et M1BP d’une limite de domaine au locus du gène Notch chez Drosophila25. Les résultats montrent que la modification des motifs de liaison à l’ADN pour les AP à la limite a des conséquences drastiques sur la formation du domaine Notch, des défauts topologiques plus importants dans les régions entourant le locus Notch et une dérégulation de l’expression génique. Cela indique que les éléments génétiques aux limites du domaine sont importants pour le maintien de la topologie du génome et de l’expression des gènes chez Drosophila25.
La méthode Hi-C dans le noyau présentée ici a permis une exploration détaillée de la topologie du génome de la drosophile à haute résolution, fournissant une vue des interactions génomiques à différentes échelles génomiques, des boucles de chromatine entre les éléments régulateurs tels que les promoteurs et les amplificateurs aux TAM et à l’identification des grands compartiments25. La même technologie a également été appliquée efficacement aux tissus de mammifères avec qu…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le programme d’appui à l’innovation technologique et à la recherche de l’UNAM (PAPIIT) numéro de subvention IN207319 et le numéro de subvention du Conseil national de la science et de la technologie (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. est un étudiant à la maîtrise soutenu par le Conseil national des sciences et de la technologie (CONACyT) CVU numéro 968128.
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
Cut Smart | NEB | B72002S | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
Ligation Buffer | NEB | B020S | |
MboI enzyme | NEB | R0147M | |
NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
RNAse | Roche | 10109142001 | |
SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |