Summary
עוברים עוף, כמודל התפתחותי קלאסי, משמשים במעבדה שלנו להערכת cardiotoxicic התפתחותי בעקבות חשיפה מזהמים סביבתיים שונים. שיטות חשיפה ושיטות הערכה מורפולוגיות/פונקציונליות שנקבעו מתוארות בכתב יד זה.
Abstract
עוברי עוף הם מודל קלאסי במחקרים התפתחותיים. במהלך התפתחות עוברים עוף, חלון הזמן של התפתחות הלב מוגדר היטב, וזה יחסית קל להשיג חשיפה מדויקת בזמן באמצעות שיטות מרובות. יתר על כן, תהליך התפתחות הלב בעוברי עוף דומה ליונקים, וכתוצאה מכך גם לב בעל ארבעה תאים, מה שהופך אותו למודל חלופי בעל ערך בהערכת הלב-קרדיו-קסיות ההתפתחותית. במעבדה שלנו, מודל עובר העוף משמש באופן שגרתי להערכת לב-קרדיוקסיה התפתחותית בעקבות חשיפה למזהמים סביבתיים שונים, כולל חומרים פר ופוליפלואורואלקיל (PFAS), חומר חלקיקי (PMs), פליטת דיזל (DE) וחומרי ננו. זמן החשיפה ניתן לבחור בחופשיות על פי הצורך, מתחילת ההתפתחות (יום עוברי 0, ED0) כל הדרך ליום שלפני הבקיעה. שיטות החשיפה העיקריות כוללות הזרקת תאי אוויר, מיקרו-בייג'ינג ישיר ושאיפת תאי אוויר (שפותחה במקור במעבדה שלנו), ונקודות הקצה הקיימות כיום כוללות תפקוד לב (אלקטרוקרדיוגרפיה), מורפולוגיה (הערכות היסטולוגיות) והערכות ביולוגיות מולקולריות (אימונוהיסטוכימיה, qRT-PCR, סופג מערבי וכו '). כמובן, מודל עובר העוף יש מגבלות משלו, כגון זמינות מוגבלת של נוגדנים. עם זאת, עם מעבדות נוספות מתחיל לנצל מודל זה, זה יכול לשמש כדי לתרום תרומות משמעותיות לחקר הלב-טוקוקסיות ההתפתחותיות.
Introduction
עובר העוף הוא מודל התפתחותי קלאסי, אשר שימש במשך למעלה ממאתיים שנה1. למודל עובר העוף יתרונות שונים בהשוואה לדגמים מסורתיים. קודם כל, כבר לפני למעלה מ -70 שנה, ההתפתחות הרגילה של עובר העוף הודגמה בצורה ברורה מאוד במדריך ההיערכות המבורגר-המילטון2, שבו הוגדרו בסך הכל 46 שלבים במהלך התפתחות עובר העוף עם זמן מדויק ומאפיינים מורפולוגיים, מה שמקל על זיהויים של התפתחות חריגה. בנוסף, למודל העובר העוף יש תכונות אחרות כגון היותו בעלות נמוכה יחסית ויתיר בכמות, בקרות מינון חשיפה מדויקות יחסית, מערכת עצמאית וסגורה בתוך הקליפה ומניפולציה קלה של העובר המתפתח, כל אלה מבטיחים את הפוטנציאל שלו לשמש כמודל הערכה טוקסיקולוגי רב עוצמה.
בקרדיו-קרדיוקסיה, עובר העוף כולל לב בעל ארבעה תאים, בדומה ללבבות יונקים אך עם קירות עבים יותר, המאפשר הערכות מורפולוגיות קלות יותר. בנוסף, עובר העוף מאפשר חשיפה לשאיפה התפתחותית, שאינה אפשרית במודלים של יונקים: בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות, עובר העוף יעבור מנשימה פנימית לנשימה חיצונית (קבלת חמצן דרך הריאה); האחרון דורש כי העובר חודר את קרום תא האוויר עם מקור, ומתחיל לנשום אוויר 3 , מהשהופךאת תא האוויר תא שאיפה מיני. תוך שימוש בתופעה זו, ניתן להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגיות של מזהמי גז על הלב (ואיברים אחרים) ללא צורך במכשירי תא שאיפה ייעודיים.
בכתב יד זה מתוארות מספר שיטות להערכת נקודות קצה, אשר כולן משמשות כדי להפוך את עובר העוף לכלי רב עוצמה בהערכת לב-קרדיוקסיה התפתחותית בעקבות חשיפה למזהמים סביבתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים שתוארו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת צ'ינגדאו. במעבדה שלנו, הביצים דוגרו בשני אינקובטורים. ביצים הוחזקו זקופות באינקובטור והונחו באקראי על המדפים. תנאי הדגירה של הביצים היו כדלקמן: טמפרטורת הדגירה החלה ב 37 °C (50 °F), בהדרגה ירד ל 37 °C (50 °F) כמו הדגירה המשיכה; הלחות החלה ב-50% ועלתה בהדרגה ל-70%.
1. שיטות חשיפה
הערה: חשיפה של מזהמים סביבתיים לעוברי עוף עשויה להיות מושגת במספר דרכים. בסעיף זה, שלוש שיטות הנמצאות בשימוש שגרתי מתוארות בפירוט.
- הזרקת תאי אוויר (איור 1)
הערה: זוהי שיטת החשיפה הקלאסית לעוברי עוף4,5,6, המתאימה למגוון רחב של חומרים, וניתן לבצע אותה בחלון זמן רחב מאוד, מתחילת ההתפתחות (יום עוברי אפס, ED0) כל הדרך ליום שלפני הבקיעה (ED20). שמן חמניות משמש כרכב. מחקרים קודמים הראו כי לא נצפו שינויים משמעותיים בתמותה, בבקיעה או במשקל הגוף בין עוברים לא מטופלים לעוברים שהוזרקו עם שמןחמניות 7.- הכן את ריאגנטים/כלים הדרושים הבאים: 75% אתנול, נייר טישו, בדיקה מתכתית (יכול להחליף עם כל מחט מתכת חדה / מקל / awl), פרפין מומס, מברשת, פתרון יודיד פובידון, פיפטה, טיפים פיפטה, מנורת מינון, תערובת מינון. מכינים את תערובת המנונים עם שמן חמניות (מומלץ)4. כדי להשתמש בדילול אחר, בצע שליטה ברכב (לעומת עוברים לא מטופלים).
- נקו את פני הביצים בתמיסת פובידון יודיד (פתרון יודיד פובידון זמין מסחרית 1:5 מדולל במים דה-יוניים), וייבשו את קליפת הביצה בנייר טישו ללא קרצוף. קרצוף ישבור את שכבת המגן שמכסה את החלק החיצוני של הקליפה.
- נרות את הביצים בחדר חשוך ומסמנים את תא האוויר בעיפרון. אל תכלול ביצים עם סדקים על הקליפה. אל תכלול ביצים עם תאי אוויר בצד במקום קצה קהה, כמו אלה מאוד לא סביר לבקוע בדרך כלל.
- לחטא את אזור תא האוויר עם 75% אתנול, ולאחר מכן לקדוח חור קטן במרכז אזור תא האוויר עם גשוש מתכת. אין לתקוע את הגשוש עמוק לתוך תא האוויר או הממברנה הפנימית עלולה להיפגע, במקום זאת, רק לשבור את הקליפה עם קצה הגשוש. אם החור אינו גדול מספיק כדי להתאים לקצה פיפטה עדין, לשבור את הקליפה שוב בקרבת החור הקיים, עד החור גדול מספיק כדי לאפשר החדרה של 10 μL pipette קצה.
- מערבולת את תערובת מנונים במרץ, ומיד לצייר פתרון טיפ פיפטה. נפח ההזרקה המומלץ הוא 1 μL לכל 10 גרם של ביצה (למשל, נפח הזרקת μL 5 עבור ביצה 50 גרם) כמו נפחי הזרקה גדולים יותר עלול ליצור תנאים היפוקסיים או anoxic עבור העובר המתפתח. חשב את הריכוז של פתרון מינון עבור מ"ג/ ביצה ק"ג הרצוי מינון.
- הכנס את קצה הפיפטה לתוך החור, כאשר הקצה נוגע בממברנה הפנימית. מוציאים לאט את תערובת המנונים, מחזיקים לפחות עשר שניות (אפשרו את חלוקת השמן הצמיגי במלואו), ולאחר מכן הסירו את הקצה.
- אוטמים את החור עם מברשת וסיפירה של פרפין מומס. היזהר לא לטפטף פרפין מומס על הממברנה הפנימית.
- לאחר האטום, מניחים את הביצים באינקובטור עד שהם מגיעים לשלב העוברי הרצוי. על עוברים שכבר מתפתחים, בצע את כל התהליך בהקדם האפשרי כדי למנוע אובדן עובר פוטנציאלי עקב טמפרטורות סביבתיות נמוכות.
- מיקרו-נסיגה (איור 2)
הערה: זוהי שיטת חשיפה ישירה יותר, וכתוצאה מכך חשיפה מוחלטת לחומר העניין, ומתאים במיוחד לתרכובות עם משך פעולה קצר (למשל, lentivirus), שכן הזרקת תאי האוויר הקלאסית דורשת זמן עבור התרכובות לחדור את הממברנה הפנימית. שיטה זו עשויה גם להיות ניסה אם תוצאות מספקות לא ניתן להשיג על ידי הזרקת תא אוויר. שיטה זו מתאימה בצורה הטובה ביותר לעוברים מוקדמים (עד ED2), אך ניתן לבצע גם על עוברים מבוגרים יותר (עם סיכון גבוה יותר לאובדן עוברים).- הכן את ריאגנטים / כלים הדרושים הבאים: 75% אתנול, פתרון יודיד פובידון, מזרק מיקרו (5 μL), בדיקה מתכת (יכול להחליף עם כל מחט מתכת חדה / מקל / awl צריך לעבוד), מלקחיים עדינים, קלטת. הכן את תערובת מנונים עם מלוחים סטריליים, אשר משמש גם כמו בקרת הזרקה מבלי להשפיע על הבקיעה באופן משמעותי. להבטיח את הסטריליות של מלוחים, כמו זריקה מזוהמת תגדיל באופן דרמטי את התמותה.
- נקו את הביצים כמתואר ב-1.1.2.
- נר הביצים כמתואר ב 1.1.3.
- לחטא את אזור תא האוויר עם 75% אתנול, ולאחר מכן לקדוח חור קטן במרכז אזור תא האוויר עם גשוש מתכת. אין לתקוע את הגשוש עמוק לתוך תא האוויר או הממברנה הפנימית עלולה להיפגע, במקום זאת, רק לשבור את הקליפה עם קצה הגשוש. לאחר מכן להשתמש במלקחיים עדינים כדי להגדיל בזהירות את החור עד הקוטר הוא כ 2 מ"מ, המאפשר אישור חזותי של הממברנה הפנימית.
- לטעון את הפתרון לתוך microinjector (נפח הזרקה מקסימלית: 0.5 μL / 10 גרם ביצה. (למשל, 2.5 μL עבור ביצה 50 גרם) ולהכניס בזהירות את המחט דרך החור לתוך הממברנה הפנימית עבור כ 2-3 מ"מ. מחלקים בעדינות את הפתרון ומסירים את המחט. שמור את המחט מאונך לממברנה ככל האפשר.
- לאטום את החור עם חתיכת קלטת קטנה. לכסות לחלוטין את החור כדי למנוע התייבשות עובר ומוות במהלך הדגירה הבאה. עם זאת, להימנע חתיכות של קלטת כי הם גדולים מדי כדי למנוע היפוקסיה.
- לאחר האטום, מניחים את הביצים באינקובטור עד שהם מגיעים לשלב העוברי הרצוי. על עוברים שכבר מתפתחים, בצע את כל התהליך בהקדם האפשרי כדי למנוע אובדן עובר פוטנציאלי עקב טמפרטורה סביבתית נמוכה.
- שאיפת תאי אוויר (איור 3)
הערה: זוהי שיטת שאיפה חדשנית המנצלת את תא האוויר, שממנו עובר העוף בשלב מאוחר יתחיל לנשום אוויר. הוא מתאים לחשיפות גז או תרסיס ועשוי להשיג חשיפות שאיפה מוקדמות מאוד בחיים, ולמלא את הריאות בגז/תרסיס המטרה כאשר הן נפתחות לראשונה בחיים.- הכן את ריאגנטים / כלים הדרושים הבאים: שקית דגימה (שקית PVF, לאחסון של גז / תרסיס מדגם לפני החשיפה), מחט קטטר, מזרק, בדיקה מתכת (יכול להחליף עם כל מחט מתכת חדה / מקל / awl צריך לעבוד), קלטת, מכסה המנוע אדים.
- נקו את הביצים כמתואר ב-1.1.2 והגר אותן כמתואר ב-1.1.3 (אין צורך לסמן תא אוויר לפני הדגירה), ולאחר מכן לדגור על ביצים ללא טיפול עד 17 לספירה.
- נר הביצים ב ED17 כדי לסמן את אזור תא האוויר.
- ב ED18, להוציא ביצה מן האינקובטור, לחטא את אזור תא האוויר עם 75% אתנול, ולאחר מכן בזהירות לקדוח שני חורים קטנים משני צידי תא האוויר. האחד הוא להזרקת גז / תרסיס, השני הוא לסילוק אוויר. שלוט בזהירות בגודל החורים כך שגודל חור ההזרקה מספיק רק כדי להכניס את מחט הצנתר, בעוד שקוטר חור הגירוש מעט גדול יותר (כ -1 מ"מ).
- הזריקו בעדינות 10 מ"ל של גז מטרה/תרסיס מחור ההזרקה עם מזרק המחובר למחט הצנתר. הזרק אוויר לקבוצת בקרת שאיפה, אשר לא צריך להיות הבדלים משמעותיים לקבוצת ביקורת שלילית8. החל לחץ על מחט הצנתר (עם כמות מתאימה של לחץ המחט האלסטית ניתן לדחוף נגד הקליפה) כדי למזער את הדליפה מחור הזרקה. אוטמים את שני החורים מיד עם סרט הדבקה לאחר מכן, ומחזירים את הביצה לאינקובטור.
הערה: הליך זה צריך להתבצע במכסה אדים כדי למנוע שאיפת גז / תרסיס על ידי המפעיל. - חזור על ההליך המתואר לאחר שעה אחת כדי להבטיח עוד יותר את תא האוויר כולו מלא בגז מטרה / תרסיס (אופציונלי).
- חזור שוב על ההליך המתואר ב- ED19 (אופציונלי). חזרה על החשיפה מסייעת להבטיח חשיפה עקבית עד לבקוע. רשום את זמן הצוהר להערכה משוערת של משך החשיפה.
- לאחר חשיפות הרצויות בוצעו ואטום, מניחים את הביצים באינקובטור לבקוע. מזער את הזמן שהביצה מבלה מחוץ לאינקובטור כדי למנוע מוות מטמפרטורת סביבה נמוכה.
2. שיטות הערכת נקודות קצה
הערה: בעקבות חשיפה של מזהם של עניין לעובר המתפתח, ניתן להעריך מספר פרמטרים רעילות, כולל cardiotoxicity. בסעיף זה, שתי שיטות ספציפיות הנמצאות בשימוש תכוף מתוארות בפירוט.
- אלקטרוקרדיוגרפיה (איור 4)
הערה: אי אפשר לעשות אלקטרוקרדיוגרפיה לא פולשנית בתרנגולות גוזלות בשל נוכחות של נוצות. לכן, השתלה תת עורית של אלקטרודות היא חיונית, הדורשת הרדמה. המינון המשמש במעבדה הוא 33 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל באמצעות הזרקה תוך-איפריטונית (תרנגולות מסוימות עשויות לדרוש עד 50% עלייה במינון). שיטה זו תגרום אלקטרוקרדיוגרפיה יציבה מעל 90% מבעלי החיים, המאפשר ניתוח של קצב הלב.- הכן את ריאגנטים/כלים הדרושים הבאים: 1% (10 מ"ג /מ"ל) פתרון פנטוברביטל מלוחים, מזרק, איזון חשמלי, תנור (במידת הצורך), מכשיר אלקטרוקרדיוגרפיה מחובר (למשל, BL-420E +) עם אלקטרודות מחט מתכת דו ערוצית.
- שקול את התרנגולות עם איזון ולחשב את הנפח הדרוש של פתרון pentobarbital ולהזריק את התרנגולות. עבור עוף במשקל 30 גרם, 0.1 מ"ל של פתרון pentobarbital יש צורך. ודא כי הזריקה נעשית בצד הצדדי של הבטן, כמו החלמון ממוקם באמצע הזרקה לא יכול להיות יעיל.
- חכה עד התרנגולות מוזרק הם מרדים (להחזיק את העוף ביד, אם הצוואר אין מתח ואת הראש ניתן להניף בחופשיות, את המנשים מספיק). מניחים תרנגולות על שולחן המבצעים (תנורי חימום נחוצים אם טמפרטורת החדר היא מתחת ל -20 מעלות צלזיוס).
- הכנס שתי אלקטרודות מחט משני צידי הבטן, תת עורית. ודא כי המחטים לא להיכנס לחלל הבטן על ידי הרמת העור קצת והכנסת מחט משם. לאחר החדרה, בזהירות לדחוף את המחט קדימה עד שהוא מגיע לצד של חלל החזה. ודא כי המחט לא ללכת עמוק לתוך הגוף או לבלוט מן העור.
- הפוך את המדידות עם מכשיר אלקטרוקרדיוגרפיה. ניתן להשתמש במכשירים דומים אחרים המסוגלים לאלקטרוקרדיוגרפיה.
- אם התרנגולות יוקרבו, בצע המתת חסד לאחר האלקטרוקרדיוגרפיה מכיוון שהן כבר מורדמות. אם תרנגולות רוצים לשרוד, החזירו אותן לכלובים שלהן והתחמם עד להתעוררות. החזרתם לאינקובטור היא אפשרות נוספת.
- הסטומורפומטריה (איור 5)
הערה: שיטה ספציפית מפותחת כדי להעריך את עובי דופן החדר הימני בחלקים רוחביים של הלב. הערכה מורפולוגית של ממד החדר הימני באמצעות אקוקרדיוגרפיה אינה מדויקת ב -100% בשל הצורה הלא סדירה של החדר הימני, ושיטה זו עשויה לשמש כתוספת טובה בהערכות המורפולוגיות לחדר הימני.- הכן את ריאגנטים / כלים הדרושים הבאים: 4% פורמלדהיד חוצץ פוספט, להב חד, תמיסת מלח חוצץ פוספט, מגבת נייר, איזון חשמלי, מספריים קטנים, סוכני עיבוד היסתולוגי כללי (אתנול מדורג, קסילן, פרפין).
- לאחר שבעלי חיים מוקרבים, השתמש במים כדי להרטיב את הנוצות. זאת כדי למזער את הזיהום הפוטנציאלי עקב נוצות מעופפות בעת פתיחת החזה.
- פתח את חלל החזה בזהירות מבלי לפגוע בלב. השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את כלי כלי הים ולהסיר בעדינות את הלב מחלל החזה. השאירו חתיכה קטנה (כ 1-2 מ"מ) של vasculature מחובר ללב כמו זה עשוי להיות נוח לטיפול מאוחר יותר של הלב מבלי לפגוע בלב.
- לאחר הסרת, לשטוף את הלב מלוחים פוספט קר חוצץ כדי להסיר את הדם ולהרפות את השריר. לאחר מכן לטבול יבש את הלב על מגבת נייר לפני שוקל לקריאת משקל מדויקת. שים את הלב לתוך 10x נפח קיבוע (4% פורמלדהיד חוצץ פוספט) במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. רקמות קבועות עשויות להיות מעובדות לאחר מכן בלוקים פרפין, או להיות מאוחסן ב 4 °C (4 °C (לא מומלץ אם אימונוהיסטוכימיה מתוכננת).
- לפני ההטבעה, חתכו את הרקמות בערך 60% באורך ספירת הלב מהפסגה (איור 5A), לעיבוד קל יותר לאחר מכן. להב מיקרוטום מומלץ לחיתוך נקי מהיר ואנכי. עבור תרנגולות מעל יום אחד, לעשות חתך נוסף בערך 25-30% אורך מן השיא לחדירת פרפין קלה יותר כדי לאפשר את הרקמה להתאים קלטות רקמות.
- לעבד את הרקמות עם התנאים הבאים (להתאים לפי הצורך): 70% אתנול עבור 1 שעות, 80% אתנול עבור 1 שעות, 95% אתנול עבור 1 h x2, 100% אתנול במשך 30 דקות x2, קסילן עבור 5 דקות x2, פרפין (נקודת התכה 52-54 °C) עבור 1.5 שעות, פרפין (נקודת התכה 62-64 °C) עבור 1 שעות, ולאחר מכן הטמעת הרקמות בתערובת 3:1 של פרפין (נקודת התכה 62-64 °C) ופראפין (נקודת התכה 52-54 °C (52-54 °F).
- חלק את הרקמה בעובי 6 מיקרומטר. בזהירות לשמור על עמדות יחסיות זהות של חתך על ידי אישור נוכחות וגודל של ציון דרך אנטומי (trabecula septomarginal) בחדר הימני. אשר ציון דרך עם אורך בינוני בכל מקטע(איור 5B, חץ).
- צור שני סרגלים אלקטרוניים באמצעות מתכנת Logo: Ruler 1 הוא קו ישר עם 7 קווי מידה ברדיוס המחוברים לנקודת האמצע, עם 22.5° בין שני קווי מידה סמוכים. Ruler 2 הוא רק שני קווים מאונכים בצורת T(איור 5B).
- מדד באמצעות שתי תוכנות: Adobe Photoshop ו- ImageJ.
- ב- Photoshop, שנה את גודל הסרגל 1 (ללא שינוי צורה) כדי למקם את שני קצות הסרגל בשני קצות קיר החדר הימני החופשי, כך ששבעת קווי המדידה בסרגל 1 יפגשו כל אחד את דופן החדר הימני הפנימי. לאחר מכן השתמשו בסרגל 2 כדי לבצע מדידות מאונכות מהקיר הפנימי לחיצוני(איור 5B).
- השתמש ב- ImageJ כדי לבצע את שבע המדידות עבור כל לב.
- בהתאם לצרכים ספציפיים, לנתח את שבע המדידות או הממוצע עבור עובי אחד מייצג של דופן החדר הימני. נרמל למשקל לב שלם לשינויים ספציפיים בעובי דופן החדר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות חשיפה
הזרקת תאי אוויר
הזרקת תאי אוויר יכולה לחשוף ביעילות עוברים עוף מתפתחים לסוכנים שונים, אשר עשויים להיות מזוהים לאחר מכן בדגימות שנאספו (סרום, רקמה וכו ') של עוברים / תרנגולות גוזלות. הנה דוגמה, שבה חומצה פרפלואורוקטנואית (PFOA) הוזרקה לתא אוויר, וריכוזי PFOA בסרום נקבעו אז עם ספקטרומטריה של כרומטוגרפיה-מסה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד. ריכוזי הסרום התאימו למינונים המוזרקים, מה שמעיד על האפקטיביות של הליך זה (איור 6).
מיקרו-ינון
מיקרו-שיתוף עלול לחשוף את העוברים המתפתחים לסוכנים שאינם יכולים לחדור ביעילות את הממברנה הפנימית, או עם משך פעולה קצר, כגון lentivirus. הנה דוגמה, שבה לנטיוירוס הוזרק ביום העוברי השני בשיטה זו ואז נצפתה פלואורסצנטיות ירוקה משמעותית בלב העובר יום 15 עוברים, מה שמצביע על האפקטיביות של טרנספקטציה לנטיוירוס (איור 7).
עירוי תאי אוויר
עירוי תאי אוויר היא שיטה חדשנית, אשר עשוי לעבוד טוב מאוד עבור כמות קטנה של חשיפה שאיפת גז / תרסיס במהלך שלב החניכה של נשימה חיצונית. הנה דוגמה, שבה פליטת דיזל הוחדרה לתא האוויר ביום עוברי 18 ו -19, וכתוצאה מכך שינויים פיברוטיים משמעותיים בלב, כמו גם רקמות ריאות (איור 8).
תוצאות הערכת נקודות קצה
תוצאות אלקטרוקרדיוגרפיה
בשל המגבלה של שתי אלקטרודות, רק 3 ערוצים של אלקטרוקרדיוגרפיה ניתן להציג. אבל הם מספיקים כדי להבחין בין גלי r, ולכן הם עשויים לשמש להערכות פונקציונליות. בדוגמה אמיתית, אלקטרוקרדיוגרפיה של תרנגולות שנחשפו למפלט דיזל הצביעה על מרווח R-R מקוצר משמעותית, המציין שינויים תפקודיים (איור 9).
תוצאות היסטופתולוגיה
השיטה שלנו להערכת עובי דופן החדר הימני שימשה בהצלחה במספר מחקרים5,7,8,9,10,11,12. באחד המחקרים הקודמים שלנו, חשיפה לפליטת דיזל הביאה לעובי קיר חדר ימני(איור 10).
איור 1: הדגמה של הזרקת תאי אוויר. ביצית פורייה לא מפותחת מוצגת בתמונה, אך עוברים בכל השלבים השונים עשויים להיחשף בשיטה זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדגמת מיקרו-ינון. עובר מוקדם מוצג בתמונה, שהיא נקודת זמן החשיפה המועדפת לשיטה זו, אך ניתן לנסות גם נקודות זמן אחרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדגמה של עירוי תאי אוויר. בתמונה מוצג עובר בשלב מאוחר העובר צנרת פנימית, שהיא נקודת זמן החשיפה המועדפת לשיטה זו. הוצגו ארבעה שלבים של המבצע. 1: עובר שלם. 2: שני חורים נעשו. 3: עירוי מתבצע. שקית הדגימה של PVF מוצגת גם בפינה השמאלית התחתונה. 4: עירוי הוא סיים, חורים אטומים עם סרט הדבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדגמת אלקטרוקרדיוגרפיה. הפאנל השמאלי העליון הראה כיצד תרנגולת גוזלת הייתה מרדים ועברה מדידת אלקטרוקרדיוגרפיה. החלונית הימנית העליונה מציגה את מכשיר האלקטרוקרדיוגרפיה עם האלקטרודות המחוברות. הלוח התחתון מראה אלקטרוקרדיוגרפיה מייצגת שנרכשה מהתרנגולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדגמת הערכה היסטופתולוגית של עובי דופן החדר הימני (המטוקסילין וכתמי אאוזין). (א)הדגמת תנוחת החיתוך של לבבות עוף לפני ההטבעה. (B)הדגמה של מדידת עובי דופן החדר הימני. סרגלי קנה מידה מייצגים 1000 מיקרומטר. עיגולים כחולים מדגימים את שבע נקודות המדידה על קיר החדר הימני הפנימי. עיגול אדום מדגים נקודת מדידה על קיר החדר הימני החיצוני. חץ מדגים את נקודת הציון האנטומית עבור המיקום חתך מתאים. נתון זה שונה מג'יאנג ואח ' טוקסיקולוגיה. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ריכוז סרום של חומצה פרפלואורוקטנואית מתרנגולות גוזלות בעקבות הזרקת תאי אוויר עם 0, 0.5, 1 או 2 מ"ג/ק"ג פרפלואורוקטנואית לפני הדגירה. ריכוזי הסרום שהתקבלו התאימו למינונים המוזרקים, מה שמצביע על האפקטיביות של הזרקת תאי אוויר. נתון זה שונה מג'יאנג ואח ' טוקסיקולוגיה. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הדגמת יעילות ההדבקה של נגיף lentivirus בעקבות חשיפה למיקרו-נגיף (תצפית ישירה בעקבות ניתוח קריו). לוחות שמאליים הראו תמונות שדה אור, בעוד לוחות ימניים הראו פלואורסצנטיות ירוקה עבור אותם מקטעי רקמה. ביום העוברי שני עוברי עוף הוזרקו לנטיוירוס או שליטה, ולאחר מכן דגירה עד היום העוברי 15. הלבבות היו קפואים ודמיינו אותם ישירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. (א)קבוצת ביקורת, פלואורסצנטיות ירוקה קטנה הייתה נוכחת. (B)קבוצה חשופה Lentivirus, פלואורסצנטיות ירוקה משמעותית נצפתה, המציין את האפקטיביות של transfection lentivirus בעקבות microinjection. סרגלי קנה מידה מייצגים 125 מיקרומטר. נתון זה שונה מ Zhao ואח 'טוקסיקולוגיה סביבתית ופרמקולוגיה. 56, 136-144 (2017)11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: הדגמת האפקטיביות של עירוי תאי אוויר. עוברי עוף הושרו בפליטת דיזל ביום עוברי 18 ו -19, ואז התרנגולות שבקעו הוחזקו במשך 0, 1 או 2 שבועות ולאחר מכן הוקרבו. רקמות הלב הוערכו עם כתמי מאסון טריכרום עבור נגעים פיברוטיים. החצים הראו את הנגעים הפיברוטיים (כתמים כחולים). *: שונה סטטיסטית משליטה (P<0.05 מניתוח שונות ובדיקות הבדלים פחות משמעותיות). סרגלי קנה מידה מייצגים 150 מיקרומטר. נתון זה שונה מג'יאנג ואח 'זיהום סביבתי. 264, 114718 (2020)8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: הדגמת האפקטיביות של האלקטרוקרדיוגרפיה. עוברי עוף הושרו בפליטת דיזל ביום העוברי 18 ו -19, ואז התרנגולות בקעו נשמרו במשך 0, 1 או 2 שבועות ולאחר מכן אלקטרוקרדיוגרפיה בוצעה. מרווחי R-R מקוצרים באופן משמעותי נצפו בתרנגולות שנחשפו לפליטת דיזל באמצעות עירוי תאי אוויר, מה שמצביע על יעילות השיטה. *: שונה סטטיסטית משליטה (P<0.05 מניתוח שונות ובדיקות הבדלים פחות משמעותיות). נתון זה שונה מג'יאנג ואח 'זיהום סביבתי. 264, 114718 (20208. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: הדגמת האפקטיביות של מדידת עובי דופן החדר הימני (המטוקסילין וכתמי אאוזין). עוברי עוף הושרו בפליטת דיזל ביום העוברי 18 ו -19, ואז התרנגולות שבקעו נשמרו במשך שבוע אחד, ואז בוצעה הערכה היסטולוגית של עובי דופן החדר הימני. ת: תמונות מייצגות של חתך הלב. שימו לב לנוכחות של סמן אנטומי בכל החדרים הנכונים (בתרנגולות ישנות יותר, הסמן נוטה להיות קצת יותר ארוך במיקום הרצוי, מה שלא משפיע על דיוק המדידות). B: כימות עובי דופן החדר הימני, אשר הומרו תחילה לאורכו בפועל עם שקופיות סטנדרטיות, ולאחר מכן מנורמל עם משקל לב שלם ובכך היו מיוצגים בצורה של um / UG. חצים כחולים: שני קצוות של דופן החדר הימני החופשי. חצים אדומים: נקודות האמצע של קיר החדר הימני. חצים שחורים: סמן אנטומי. *: שונה סטטיסטית משליטה (P<0.05 מניתוח שונות ובדיקות הבדלים פחות משמעותיות). סרגלי קנה מידה מייצגים 1000 מיקרומטר. נתון זה שונה מג'יאנג ואח 'זיהום סביבתי. 264, 114718 (2020)8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עובר העוף היה מודל קלאסי במחקרים התפתחותיים במשך 200 שנה1. השיטות שלנו שהוצגו בכתב יד זה שימשו להערכה של מספר מזהמים סביבתיים, כולל חומצה פרפלואורוקטנואית, חומר חלקיקי, פליטת דיזל בהצלחה5,7,8,9,10,11,12. בשיטות אלה, cardiotoxicity התפתחותית צוין חסכוני וברור. יתר על כן, זה לא קשה לחשוף עוברי עוף עם תרכובות עניין אחרות ולהעריך קרדיו-רעלה התפתחותית פוטנציאלית.
שיטת הזרקת תאי האוויר היא שיטה קלאסית ששימשה בעבר במחקרים רבים13,14,15, שהיא נוחה ויעילה. בהשוואה לשיטות חשיפה התפתחותיות אחרות, כגון דגמי מכרסמים16,17,18, הוא כולל חשיפה ישירה למערכת סגורה, אשר מפחיתה מאוד את השונות עקב השפעות אימהיות והפרה מגוונת. Microinjection הוא שיפור של שיטת הזרקת תאי אוויר, הבטחת חשיפה מוחלטת על או בקרבת פיתוח עובר מוקדם, אשר עשוי להשיג השפעות דומות כמו בזריקות הרחם במודלים מכרסמים19,20. בהשוואה בזריקות הרחם, השיטה שלנו מאפשרת אישור חזותי של הזריקה עם צעדי מניפולציה קלים יחסית, והזרקה מדויקת מושגת בקלות על ידי שליטה על משקל הביצה, אשר אינו אפשרי בהזרקת הרחם, שם הכמות והמשקל בפועל של עוברים אינם נרכשים בקלות. שיטת העירוי היא בעיקר להערכת סוכנים בשאיפה על מערכת הריאות, אבל cardiotoxicity ורעילות ריאתית לעתים קרובות להתרחש במשותף. שיטה זו מנצלת את תא האוויר, שלתוכו מושרים כמות קטנה של גז או תרסיס, ומאפשרת שאיפה מתמשכת של גז / תרסיס ללא צורך בתאי שאיפה ספציפיים. דגמי מכרסמים מקבילים צריכים להשתמש בכמויות גדולות יחסית של גז / תרסיס ומכשירי שאיפה גדולים ויקרים21,22.
שתי נקודות הקצה שנבדקו באופן שגרתי במעבדה שלנו, אלקטרוקרדיוגרפיה והערכה היסטומורפומטרית של עובי דופן החדר הימני, מייצגות שינויים תפקודיים ומורפולוגיים בעקבות חשיפה לרעילות, בהתאמה. להערכת עובי דופן החדר הימני יש יתרונות ספציפיים בקבלת הבנה מקיפה של דופן החדר הימני, שכן ההערכה המסורתית המבוססת על אקוקרדיוגרפיה על החדר הימני היא בדרך כלל מאתגרת ולא מדויקת במיוחד, בשל צורת הסהר האסימטרי והמורכב של החדר הימני23. השיטה שלנו עשויה לעזור להתגבר על אי דיוק זה על ידי שכשהם עם מידע נוסף על עובי דופן החדר הימני בעמדה מייצגת. נכון לעכשיו הכל ידני, בעתיד, המדידות עשויות להתבצע באופן אוטומטי ומספר נקודות המדידה עשוי להיות מוגבר במידה ניכרת, שיפור נוסף של הדיוק של שיטה זו.
למודלים התפתחותיים מבוססי עובר עוף יש מספר יתרונות במחקרים טוקסיקולוגיים, כגון היכולת לספק מינון חשיפה מדויק יחסית, מערכת חשיפה עצמאית בתוך הקליפה ומניפולציה קלה של העובר המתפתח. ביחס לקרדיו-טוקסיקה, לתרנגולות יש לבבות גדולים יחסית וקירות חדריים עבים, מה שמאפשר הערכות היסטומוורפומטריות קלות. ישנם כמה חסרונות, כגון זמינות של נוגדנים / פריימרים ודרישות שטח כלוב נוספות בהשוואה מכרסמים אם גידול תרנגולות לאחר הצוהר. עם זאת, עובר העוף הוא עדיין מודל טוקסיקולוגי חלופי טוב שישמש להערכות קרדיו-טוקסיקיות התפתחותיות פוטנציאליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
