Summary
Les embryons de poulet, en tant que modèle de développement classique, sont utilisés dans notre laboratoire pour évaluer les cardiotoxicités développementales après une exposition à divers contaminants environnementaux. Les méthodes d’exposition et les méthodes d’évaluation morphologique/fonctionnelle établies sont décrites dans ce manuscrit.
Abstract
Les embryons de poulet sont un modèle classique dans les études sur le développement. Au cours du développement des embryons de poulet, la fenêtre temporelle du développement cardiaque est bien définie et il est relativement facile d’obtenir une exposition précise et opportune via de multiples méthodes. De plus, le processus de développement cardiaque chez les embryons de poulet est similaire à celui des mammifères, ce qui donne également un cœur à quatre chambres, ce qui en fait un modèle alternatif précieux dans l’évaluation des cardiotoxicités développementales. Dans notre laboratoire, le modèle d’embryon de poulet est couramment utilisé dans l’évaluation des cardiotoxicités du développement après exposition à divers polluants environnementaux, y compris les substances perfluoroalkyles et polyfluoroalkyles (PFAS), les particules (PM), les gaz d’échappement diesel (DE) et les nanomatériaux. Le temps d’exposition peut être librement choisi en fonction des besoins, depuis le début du développement (jour embryonnaire 0, ED0) jusqu’à la veille de l’éclosion. Les principales méthodes d’exposition comprennent l’injection de cellules d’air, la micro-injection directe et l’inhalation de cellules d’air (développées à l’origine dans notre laboratoire), et les critères d’évaluation actuellement disponibles comprennent la fonction cardiaque (électrocardiographie), la morphologie (évaluations histologiques) et les évaluations biologiques moléculaires (immunohistochimie, qRT-PCR, transfert de Western, etc.). Bien sûr, le modèle d’embryon de poulet a ses propres limites, telles que la disponibilité limitée des anticorps. Néanmoins, avec plus de laboratoires commençant à utiliser ce modèle, il peut être utilisé pour apporter des contributions significatives à l’étude des cardiotoxicités développementales.
Introduction
L’embryon de poulet est un modèle de développement classique, qui est utilisé depuis plus de deux cents ans1. Le modèle d’embryon de poulet présente divers avantages par rapport aux modèles traditionnels. Tout d’abord, dès plus de 70 ans, le développement normal de l’embryon de poulet avait été illustré très clairement dans le guide destadification Hamburger-Hamilton 2, dans lequel un total de 46 étapes au cours du développement de l’embryon de poulet ont été définies avec des caractéristiques temporelles et morphologiques précises, facilitant la détection d’un développement anormal. En outre, le modèle d’embryon de poulet présente d’autres caractéristiques telles qu’un coût relativement faible et redondant en quantité, des contrôles exposition-dose relativement précis, un système indépendant et fermé dans la coquille et une manipulation facile de l’embryon en développement, ce qui garantit son potentiel d’utilisation comme un puissant modèle d’évaluation toxicologique.
En cardiotoxicité, l’embryon de poulet présente un cœur à quatre chambres, semblable aux cœurs de mammifères mais avec des parois plus épaisses, ce qui permet des évaluations morphologiques plus faciles. De plus, l’embryon de poulet permet une exposition par inhalation développementale, ce qui n’est pas possible dans les modèles de mammifères: au stade ultérieur de développement, l’embryon de poulet passera de la respiration interne à la respiration externe (obtenir de l’oxygène par les poumons); ce dernier nécessite que l’embryon pénètre dans la membrane cellulaire de l’air avec le bec et commence à respirer de l’air3, faisantde la cellule d’air une mini-chambre d’inhalation. En utilisant ce phénomène, les effets toxicologiques des contaminants gazeux sur le cœur (et d’autres organes) peuvent être évalués sans avoir besoin d’instruments de chambre d’inhalation dédiés.
Dans ce manuscrit, plusieurs méthodes d’évaluation de l’exposition et des paramètres sont décrites, qui servent toutes à faire de l’embryon de poulet un outil puissant dans l’évaluation de la cardiotoxicité du développement après une exposition à des contaminants environnementaux.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Qingdao. Dans notre laboratoire, les œufs ont été incubés dans deux incubateurs. Les œufs étaient maintenus debout dans l’incubateur et placés au hasard sur les étagères. Les conditions d’incubation des œufs étaient les suivantes : la température d’incubation commençait à 37,9 °C et diminuait progressivement jusqu’à 37,1 °C au fur et à mesure de l’incubation; l’humidité a commencé à 50% et a progressivement augmenté à 70%.
1. Méthodes d’exposition
REMARQUE: L’exposition de contaminants environnementaux aux embryons de poulet peut être réalisée de plusieurs façons. Dans cette section, trois méthodes couramment utilisées sont décrites en détail.
- Injection de cellules d’air (Figure 1)
REMARQUE: Il s’agit de la méthode classique d’exposition aux embryons de poulet4,5,6, adaptée à un large éventail de matériaux, et peut être effectuée à une fenêtre de temps très large, du début du développement (jour embryonnaire zéro, ED0) jusqu’à la veille de l’éclosion (ED20). L’huile de tournesol est utilisée comme véhicule. Des études antérieures ont montré qu’aucun changement significatif dans la mortalité, l’éclosion ou le poids corporel n’a été observé entre les embryons non traités et les embryons injectés avec de l’huile de tournesol7.- Préparez les réactifs/outils nécessaires suivants : éthanol à 75 %, papier de soie, sonde métallique (peut remplacer par n’importe quelle aiguille/bâton/bainçon métallique tranchant), paraffine fondue, brosse, solution d’iodure de povidone, pipette, embouts de pipette, lampe de mise en conserve, mélange de dosage. Préparer le mélange doseux avec de l’huile de tournesol (recommandé)4. Pour utiliser d’autres diluants, effectuer un contrôle du véhicule (par rapport aux embryons non traités).
- Nettoyez la surface des œufs avec une solution d’iodure de povidone (solution d’iodure de povidone disponible dans le commerce 1:5 diluée avec de l’eau désionisée) et séchez la coquille de l’œuf avec du papier de soie sans frotter. Le lavage brisera la couche protectrice recouvrant l’extérieur de la coque.
- Allumez les œufs dans une pièce sombre et marquez la cellule d’air avec un crayon. Exclure les œufs présentant des fissures sur la coquille. Excluez les œufs avec des cellules d’air sur le côté au lieu de la pointe émoussée, car il est très peu probable qu’ils éclosent normalement.
- Désinfectez la zone de la cellule d’air avec de l’éthanol à 75%, puis percez un petit trou au centre de la zone de la cellule d’air avec la sonde métallique. Ne collez pas la sonde profondément dans la cellule d’air ou la membrane interne peut être endommagée, au lieu de cela, ne cassez la coque qu’avec la pointe de la sonde. Si le trou n’est pas assez grand pour tenir dans une pointe de pipette fine, cassez à nouveau la coque à proximité du trou existant, jusqu’à ce que le trou soit assez grand pour permettre l’insertion d’une pointe de pipette de 10 μL.
- Vortex le mélange de dosage vigoureusement, et immédiatement tirer la solution à l’extrémité de la pipette. Le volume d’injection recommandé est de 1 μL par 10 grammes d’œuf (p. ex., 5 μL de volume d’injection pour un ovule de 50 grammes), car des volumes d’injection plus importants peuvent créer des conditions hypoxiques ou anoxiques pour l’embryon en développement. Calculer la concentration de la solution posologique pour la dose souhaitée en mg/kg d’œuf.
- Insérez la pointe de la pipette dans le trou, la pointe touchant la membrane interne. Éjectez lentement le mélange de dosage, maintenez pendant au moins dix secondes (laissez l’huile visqueuse être complètement distribuée), puis retirez la pointe.
- Scellez le trou avec une brosse et une goutte de paraffine fondue. Veillez à ne pas égoutter de paraffine fondue sur la membrane interne.
- Une fois scellés, placez les œufs dans l’incubateur jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade embryonnaire souhaité. Sur les embryons déjà en développement, effectuez l’ensemble du processus dès que possible pour éviter une perte potentielle d’embryon due aux basses températures ambiantes.
- Microinjection (Figure 2)
REMARQUE: Il s’agit d’une méthode d’exposition plus directe, entraînant une exposition définitive à la substance d’intérêt, et particulièrement adaptée aux composés ayant une courte durée d’action (par exemple, le lentivirus), car l’injection classique de cellules d’air nécessite du temps pour que les composés pénètrent dans la membrane interne. Cette méthode peut également être essayée si des résultats satisfaisants n’ont pas pu être obtenus par injection de cellules d’air. Cette méthode convient mieux aux embryons précoces (jusqu’à ED2), mais peut également être réalisée sur des embryons plus âgés (avec un risque plus élevé de perte d’embryons).- Préparez les réactifs/outils nécessaires suivants : éthanol à 75 %, solution d’iodure de povidone, micro-injecteur (5 μL), sonde métallique (peut remplacer par n’importe quelle aiguille/bâton/poinçon métallique tranchant qui devrait fonctionner), pinces fines, ruban adhésif. Préparez le mélange de dosage avec une solution saline stérile, qui sert également de contrôle d’injection sans affecter de manière significative l’éclosion. Assurez-vous de la stérilité de la solution saline, car une injection contaminée augmentera considérablement la mortalité.
- Nettoyez les œufs comme décrit au 1.1.2.
- Bougie les œufs comme décrit au 1.1.3.
- Désinfectez la zone de la cellule d’air avec de l’éthanol à 75%, puis percez un petit trou au centre de la zone de la cellule d’air avec la sonde métallique. Ne collez pas la sonde profondément dans la cellule d’air ou la membrane interne peut être endommagée, au lieu de cela, ne cassez la coque qu’avec la pointe de la sonde. Utilisez ensuite les pinces fines pour agrandir soigneusement le trou jusqu’à ce que le diamètre soit d’environ 2 mm, ce qui permet une confirmation visuelle de la membrane interne.
- Charger la solution dans un micro-injecteur (volume d’injection maximal : 0,5 μL/10 g d’œuf. (p. ex., 2,5 μL pour un œuf de 50 g) et insérez soigneusement l’aiguille à travers le trou dans la membrane interne pendant environ 2 à 3 mm. Distribuer doucement la solution et retirer l’aiguille. Gardez l’aiguille aussi perpendiculaire que possible à la membrane.
- Scellez le trou avec un petit morceau de ruban adhésif. Couvrez complètement le trou pour éviter la déshydratation et la mort de l’embryon pendant l’incubation ultérieure. Néanmoins, évitez les morceaux de ruban adhésif trop gros pour prévenir l’hypoxie.
- Une fois scellés, placez les œufs dans l’incubateur jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade embryonnaire souhaité. Sur les embryons déjà en développement, effectuez l’ensemble du processus dès que possible pour éviter une perte potentielle d’embryon due à une température ambiante basse.
- Inhalation de cellules d’air (Figure 3)
REMARQUE: Il s’agit d’une nouvelle méthode d’inhalation tirant parti de la cellule d’air, à partir de laquelle l’embryon de poulet à un stade avancé commencera à respirer de l’air. Il convient aux expositions aux gaz ou aux aérosols et peut entraîner des expositions par inhalation très précoces et remplir les poumons du gaz / aérosol cible lorsqu’ils s’ouvrent pour la première fois dans la vie.- Préparez les réactifs/outils nécessaires suivants : Sac d’échantillonnage (sac pvF, pour le stockage de l’échantillon de gaz/aérosol avant exposition), aiguille de cathéter, seringue, sonde métallique (peut remplacer par n’importe quelle aiguille/bâton/bainçon métallique tranchant devrait fonctionner), ruban adhésif, hotte aspirante.
- Nettoyez les œufs comme décrit au point 1.1.2 et élibéz-les comme décrit au point 1.1.3 (il n’est pas nécessaire de marquer la cellule d’air avant l’incubation), puis incubez les œufs sans traitement jusqu’à l’ED17.
- Allumez les œufs à ED17 pour marquer la zone de la cellule d’air.
- À l’ED18, sortez un œuf de l’incubateur, désinfectez la zone de la cellule d’air avec 75% d’éthanol, puis percez soigneusement deux petits trous sur les deux côtés de la cellule d’air. L’un est destiné à l’injection de gaz / aérosol, l’autre est destiné à l’expulsion de l’air. Contrôlez soigneusement la taille des trous afin que la taille du trou d’injection soit juste suffisante pour que l’aiguille du cathéter soit insérée, tandis que le diamètre du trou d’expulsion est un peu plus grand (environ 1 mm).
- Injecter doucement 10 mL de gaz cible/aérosol du trou d’injection avec une seringue attachée à l’aiguille du cathéter. Injecter de l’air pour un groupe témoin par inhalation, qui ne devrait pas présenter de différences significatives par rapport à un groupe témoin négatif8. Appliquez une pression contre l’aiguille du cathéter (avec une pression appropriée, l’aiguille élastique peut être poussée contre la coque) pour minimiser les fuites du trou d’injection. Scellez immédiatement les deux trous avec du ruban adhésif et ressécez l’œuf à l’incubateur.
REMARQUE: Cette procédure doit être effectuée dans une hotte pour empêcher l’inhalation de gaz / aérosol par l’opérateur. - Répétez la procédure décrite après une heure pour vous assurer que toute la cellule d’air est remplie de gaz / aérosol cible (facultatif).
- Répétez à nouveau la procédure décrite à l’ED19 (facultatif). Répéter l’exposition permet d’assurer une exposition constante jusqu’à l’éclosion. Enregistrez le temps d’éclosion pour une estimation approximative de la durée d’exposition.
- Une fois que les expositions souhaitées ont été effectuées et scellées, placez les œufs dans l’incubateur pour l’éclosion. Minimisez le temps que l’œuf passe à l’extérieur de l’incubateur pour éviter la mort par basse température ambiante.
2. Méthodes d’évaluation des points de terminaison
REMARQUE: Après l’exposition d’un contaminant d’intérêt pour l’embryon en développement, plusieurs paramètres de toxicité peuvent être évalués, y compris la cardiotoxicité. Dans cette section, deux méthodes spécifiques fréquemment utilisées sont décrites en détail.
- Électrocardiographie (Figure 4)
REMARQUE: Il est impossible de faire une électrocardiographie non invasive chez les poulets nouveau-nés en raison de la présence de plumes. Ainsi, l’implantation sous-cutanée d’électrodes est essentielle, nécessitant une anesthésie. La dose utilisée en laboratoire est de 33 mg / kg de pentobarbital par injection intrapéritonéale (certains poulets peuvent nécessiter jusqu’à 50% d’augmentation de la dose). Cette méthode permettra d’obtenir une électrocardiographie stable chez plus de 90% des animaux, permettant l’analyse de la fréquence cardiaque.- Préparer les réactifs/outils nécessaires suivants : solution de pentobarbital à 1 % (10 mg/mL) dans une solution saline, seringue, balance électrique, appareil de chauffage (si nécessaire), un instrument d’électrocardiographie attaché (p. ex. BL-420E+) avec des électrodes à aiguilles métalliques à deux canaux.
- Peser les poulets avec une balance et calculer le volume nécessaire de solution de pentobarbital et injecter les poulets. Pour un poulet qui pèse 30 g, 0,1 mL de solution de pentobarbital est nécessaire. Assurez-vous que l’injection est faite sur le côté latéral de l’abdomen, car le jaune est situé au milieu et l’injection peut ne pas être efficace.
- Attendez que les poulets injectés soient anesthésiés (tenez le poulet à la main, si le cou n’a pas de tension et que la tête peut être balancée librement, l’anesthésie est suffisante). Placez les poulets sur la table d’opération (des radiateurs sont nécessaires si la température ambiante est inférieure à 20 ° C).
- Insérez deux électrodes à aiguille des deux côtés de l’abdomen, par voie sous-cutanée. Assurez-vous que les aiguilles ne pénètrent pas dans la cavité abdominale en soulevant un peu la peau et en insérant une aiguille à partir de là. Une fois insérée, poussez soigneusement l’aiguille vers l’avant jusqu’à ce qu’elle atteigne le côté de la cavité thoracique. Assurez-vous que l’aiguille ne pénètre pas profondément dans le corps ou ne dépasse pas de la peau.
- Effectuez les mesures avec l’instrument d’électrocardiographie. D’autres instruments similaires capables d’électrocardiographie peuvent être utilisés.
- Si les poulets doivent être sacrifiés, effectuez l’euthanasie après l’électrocardiographie car ils sont déjà sous anesthésie. Si les poulets doivent survivre, replacez-les dans leurs cages et réchauffez-les jusqu’au réveil. Les renvoyer à l’incubateur est une autre option.
- Histomorphométrie (Figure 5)
REMARQUE: Une méthode spécifique est développée pour évaluer l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite dans les sections transversales du cœur. L’évaluation morphologique de la dimension du ventricule droit par échocardiographie n’est pas précise à 100% en raison de la forme irrégulière du ventricule droit, et cette méthode peut servir de bon complément dans les évaluations morphologiques du ventricule droit.- Préparez les réactifs/outils nécessaires suivants : formaldéhyde tamponné au phosphate à 4 %, lame tranchante, solution saline tamponnée au phosphate, essuie-tout, balance électrique, petits ciseaux, agents de traitement histologiques généraux (éthanol gradué, xylène, paraffine).
- Une fois les animaux sacrifiés, utilisez de l’eau pour mouiller les plumes. Il s’agit de minimiser la contamination potentielle due aux plumes volantes tout en ouvrant la poitrine.
- Ouvrez soigneusement la cavité thoracique sans endommager le cœur. Utilisez de petits ciseaux pour couper le système vasculaire et retirez doucement le cœur de la cavité thoracique. Laissez un petit morceau (environ 1-2 mm) de vascularisation attaché au cœur car cela peut être pratique pour une manipulation ultérieure du cœur sans endommager le cœur.
- Une fois retiré, rincez le cœur dans une solution saline tamponnée au phosphate froid pour éliminer le sang et détendre le muscle. Ensuite, séchez le cœur sur une serviette en papier avant de peser pour une lecture précise du poids. Mettez le cœur dans un fixateur de volume 10x (formaldéhyde tamponné à 4% de phosphate) pendant 24 heures à température ambiante. Les tissus fixes peuvent ensuite être transformés en blocs de paraffine ou être conservés à 4 °C pendant des années (non recommandé si l’immunohistochimie est prévue).
- Avant l’encastrement, coupez les tissus à environ 60 % de la longueur du cœur en comptant à partir de l’apex (Figure 5A), pour faciliter le traitement ultérieur. Une lame de microtome est recommandée pour une coupe nette rapide et verticale. Pour les poulets âgés de plus d’un jour, faites une autre coupe à environ 25-30% de longueur de l’apex pour faciliter la pénétration de la paraffine et pour permettre au tissu de tenir dans des cassettes de tissu.
- Traiter les tissus dans les conditions suivantes (ajuster au besoin) : 70 % d’éthanol pendant 1 h, 80 % d’éthanol pendant 1 h, 95 % d’éthanol pendant 1 h x2, 100 % d’éthanol pendant 30 min x2, xylène pendant 5 min x2, paraffine (point de fusion 52-54 °C) pendant 1,5 h, paraffine (point de fusion 62-64 °C) pendant 1 h, puis incorporer les tissus dans un mélange 3:1 de paraffine (point de fusion 62-64 °C) et de paraffine (point de fusion 52-54 °C).
- Coupe le tissu à 6 μm d’épaisseur. Maintenez soigneusement des positions relatives identiques des coupes transversales en confirmant la présence et la taille d’un repère anatomique (trabécule septomarginale) dans le ventricule droit. Confirmez un point de repère de longueur modérée sur chaque section(Figure 5B, flèche).
- Fabriquez deux règles électroniques avec le programmateur logo : la règle 1 est une ligne droite avec 7 lignes de mesure de rayon attachées au point central, avec 22,5° entre deux lignes de mesure adjacentes. La règle 2 ne correspond qu’à deux lignes perpendiculaires en forme de T(Figure 5B).
- Mesurez avec deux logiciels : Adobe Photoshop et ImageJ.
- Dans Photoshop, redimensionnez la règle 1 (PAS de remodelage) pour placer les deux extrémités de la règle sur les deux extrémités de la paroi ventriculaire droite libre, de sorte que les sept lignes de mesure de la règle 1 rencontrent chacune la paroi ventriculaire droite interne. Utilisez ensuite la règle 2 pour effectuer des mesures perpendiculaires de la paroi ventriculaire interne à la paroi ventriculaire externe(Figure 5B).
- Utilisez ImageJ pour effectuer les sept mesures pour chaque cœur.
- Selon les besoins spécifiques, analysez les sept mesures ou la moyenne pour une épaisseur de paroi ventriculaire droite représentative. Normaliser au poids total du cœur pour des changements spécifiques d’épaisseur de paroi ventriculaire.
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Representative Results
Résultats de l’exposition
Injection de cellules d’air
L’injection de cellules d’air peut exposer efficacement les embryons de poulet en développement à divers agents, qui peuvent ensuite être détectés dans les échantillons prélevés (sérum, tissu, etc.) d’embryons / poulets nouveau-nés. Voici un exemple, dans lequel de l’acide perfluorooctanoïque (APFO) a été injecté dans des cellules d’air, et les concentrations sériques d’APFO ont ensuite été déterminées par chromatographie liquide ultra-performance-spectrométrie de masse. Les concentrations sériques correspondaient aux doses injectées, indiquant l’efficacité de cette procédure (Figure 6).
Microinjection
La microinjection peut exposer les embryons en développement à des agents qui peuvent ne pas pénétrer efficacement dans la membrane interne, ou avec une courte durée d’action, comme le lentivirus. Voici un exemple, dans lequel le lentivirus a été injecté au deuxième jour embryonnaire avec cette méthode, puis une fluorescence verte significative a été observée au cœur des embryons embryonnaires du jour 15, indiquant l’efficacité de la transfection par lentivirus (Figure 7).
Infusion de cellules d’air
L’infusion de cellules d’air est une nouvelle méthode, qui peut très bien fonctionner pour une petite quantité d’exposition par inhalation de gaz / aérosol pendant la phase initiale de la respiration externe. Voici un exemple, dans lequel les gaz d’échappement diesel ont été infusés dans les cellules d’air aux jours embryonnaires 18 et 19, entraînant des changements fibrotiques importants dans les tissus cardiaques et pulmonaires (Figure 8).
Résultats de l’évaluation des points de terminaison
Résultats de l’électrocardiographie
En raison de la limitation de deux électrodes, seuls 3 canaux d’électrocardiographie peuvent être montrés. Mais ils sont suffisants pour distinguer les ondes r, ils peuvent donc être utilisés pour des évaluations fonctionnelles. Dans un exemple réel, l’électrocardiographie des poulets exposés aux gaz d’échappement diesel a indiqué un intervalle R-R significativement raccourci, indiquant des changements fonctionnels (Figure 9).
Résultats de l’histopathologie
Notre méthode d’évaluation de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite a été utilisée avec succès dans plusieurs études5,7,8,9,10,11,12. Dans l’une de nos études précédentes, l’exposition aux gaz d’échappement des moteurs diesel a entraîné un épaississement de la paroi ventriculaire droite(figure 10).
Figure 1: Démonstration de l’injection de cellules d’air. Un œuf fertile non développé est montré sur l’image, mais des embryons à tous les stades différents peuvent être exposés avec cette méthode. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Démonstration de la microinjection. Un embryon précoce est montré sur l’image, qui est le point de temps d’exposition préféré pour cette méthode, mais d’autres points temporels peuvent également être essayés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Démonstration de l’infusion de cellules d’air. Un embryon à un stade avancé subissant un piégeage interne est montré sur l’image, qui est le point de temps d’exposition préféré pour cette méthode. Quatre étapes de l’opération ont été montrées. 1 : Embryon intact. 2: Deux trous ont été faits. 3: La perfusion est en cours. Le sac d’échantillonnage PVF est également montré en bas à gauche. 4: L’infusion est terminée, les trous scellés avec du ruban adhésif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Démonstration de l’électrocardiographie. Le panneau supérieur gauche a montré comment un poulet nouveau-né a été anesthésié et soumis à une mesure d’électrocardiographie. Le panneau en haut à droite montre l’instrument d’électrocardiographie avec les électrodes attachées. Le panneau inférieur montre une électrocardiographie représentative acquise auprès des poulets. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Démonstration de l’évaluation histopathologique de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine). (A) Démonstration de la position de coupe des cœurs de poulet avant l’encastrement. (B) Démonstration de la mesure de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite. Les barres d’échelle représentent 1000 μm. Des cercles bleus montrent les sept points de mesure sur la paroi ventriculaire intérieure droite. Le cercle rouge montre un point de mesure sur la paroi ventriculaire extérieure droite. La flèche indique le repère anatomique pour la position de section appropriée. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiang et al. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Concentration sérique d’acide perfluorooctanoïque provenant de poulets nouveau-nés après injection de cellules d’air avec 0, 0,5, 1 ou 2 mg/kg d’œuf d’acide perfluorooctanoïque avant l’incubation. Les concentrations sériques résultantes correspondaient aux doses injectées, indiquant l’efficacité de l’injection de cellules d’air. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiang et al. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Démonstration de l’efficacité de la transfection du lentivirus après exposition à la microinjection (observation directe après cryo-sectionnement). Les panneaux de gauche montraient des images de champ lumineux, tandis que les panneaux de droite montraient une fluorescence verte pour les mêmes sections de tissus. Le deuxième jour embryonnaire, les embryons de poulet ont été injectés avec le lentivirus ou le témoin, puis incubés jusqu’au jour embryonnaire 15. Les cœurs ont été sectionnés et directement visualisés au microscope fluorescent. (A) Groupe témoin, peu de fluorescence verte était présente. (B) Groupe exposé au lentivirus, une fluorescence verte significative a été observée, indiquant l’efficacité de la transfection du lentivirus après microinjection. Les barres d’échelle représentent 125 μm. Cette figure a été modifiée à partir de Zhao et al. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017)11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8: Démonstration de l’efficacité de l’infusion de cellules d’air. Les embryons de poulet ont été infusés avec des gaz d’échappement diesel aux jours embryonnaires 18 et 19, puis les poulets éclos ont été conservés pendant 0, 1 ou 2 semaines, puis sacrifiés. Les tissus cardiaques ont été évalués avec la coloration Masson Trichrome pour les lésions fibrotiques. Des flèches montraient les lésions fibrotiques (coloration bleue). *: statistiquement différent du contrôle (P<0,05 d’après l’analyse de la variance et les tests de différence la moins significative). Les barres d’échelle représentent 150 μm. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiang et al. Pollution de l’environnement. 264, 114718 (2020)8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9: Démonstration de l’efficacité de l’électrocardiographie. Les embryons de poulet ont été infusés avec des gaz d’échappement diesel aux jours embryonnaires 18 et 19, puis les poulets éclos ont été conservés pendant 0, 1 ou 2 semaines, puis une électrocardiographie a été effectuée. Des intervalles R-R significativement raccourcis ont été observés chez les poulets exposés aux gaz d’échappement diesel par perfusion de cellules d’air, indiquant l’efficacité de la méthode. *: statistiquement différent du contrôle (P<0,05 d’après l’analyse de la variance et les tests de différence la moins significative). Ce chiffre a été modifié à partir de Jiang et al. Pollution de l’environnement. 264, 114718 (20208. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10: Démonstration de l’efficacité de la mesure de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine). Les embryons de poulet ont été infusés avec des gaz d’échappement diesel aux jours embryonnaires 18 et 19, puis les poulets éclos ont été conservés pendant 1 semaine, puis une évaluation histologique de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite a été effectuée. R : Images représentatives des coupes transversales du cœur. Notez la présence d’un marqueur anatomique dans tous les ventricules droits (chez les poulets plus âgés, le marqueur a tendance à être un peu plus long à la position souhaitée, ce qui n’affecte pas la précision des mesures). B: La quantification de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite, qui a d’abord été convertie en longueur réelle avec des lames standard, puis normalisée avec le poids du cœur entier, a donc été représentée sous la forme de um / ug. Flèches bleues: deux extrémités de la paroi ventriculaire droite libre. Flèches rouges : les points du milieu de la paroi ventriculaire droite. Flèches noires: marqueur anatomique. *: statistiquement différent du contrôle (P<0,05 d’après l’analyse de la variance et les tests de différence la moins significative). Les barres d’échelle représentent 1000 μm. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiang et al. Pollution de l’environnement. 264, 114718 (2020)8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’embryon de poulet est un modèle classique dans les études développementales depuis 200 ans1. Nos méthodes présentées dans ce manuscrit ont été utilisées dans l’évaluation de plusieurs contaminants environnementaux, y compris l’acide perfluorooctanoïque, les particules et les gaz d’échappement diesel avec succès5,7,8,9,10,11,12. Avec ces méthodes, la cardiotoxicité développementale a été indiquée de manière rentable et claire. De plus, il n’est pas difficile d’exposer des embryons de poulet avec d’autres composés d’intérêt et d’évaluer la cardiotoxicité potentielle du développement.
La méthode d’injection air-cellule est une méthode classique utilisée précédemment dans de nombreuses études13,14,15, qui est pratique et efficace. Comparé à d’autres méthodes d’exposition développementale, telles que les modèlesde rongeurs 16,17,18, il présente une exposition directe dans un système fermé, ce qui réduit considérablement les variabilités dues aux effets maternels et à l’excrétion variée. La microinjection est une amélioration de la méthode d’injection de cellules d’air, assurant une exposition définitive sur ou à proximité du développement d’embryons précoces, qui peut obtenir des effets similaires à ceux des injections in utero dans des modèles de rongeurs19,20. Par rapport aux injections in utero, notre méthode permet une confirmation visuelle de l’injection avec des étapes de manipulation relativement faciles, et une injection précise est facilement obtenue en contrôlant le poids de l’ovule, ce qui n’est pas possible dans l’injection in utero, où la quantité et le poids réels des embryons ne sont pas facilement acquis. La méthode de perfusion est principalement destinée à l’évaluation des agents inhalés sur le système pulmonaire, mais la cardiotoxicité et la toxicité pulmonaire coexistent souvent. Cette méthode tire parti de la cellule d’air, dans laquelle une petite quantité de gaz ou d’aérosol est infusée, permettant une inhalation continue de gaz / aérosol sans avoir besoin de chambres d’inhalation spécifiques. Les modèles de rongeurs homologues doivent utiliser des quantités relativement importantes de gaz/aérosol et de grands instruments d’inhalation coûteux21,22.
Les deux critères d’évaluation testés régulièrement dans notre laboratoire, l’électrocardiographie et l’évaluation histomorphométrique de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite, représentent respectivement des changements fonctionnels et morphologiques après une exposition toxique. L’évaluation de l’épaisseur de la paroi ventriculaire droite présente des avantages spécifiques pour obtenir une compréhension complète de la paroi ventriculaire droite, car l’évaluation traditionnelle basée sur l’échocardiographie sur le ventricule droit est généralement difficile et peu précise, en raison de la forme asymétrique et complexe du croissant du ventricule droit23. Notre méthode peut aider à surmonter cette inexactitude en complétant avec des informations supplémentaires sur la bonne épaisseur de paroi ventriculaire à une position représentative. Actuellement, tout est manuel, à l’avenir, les mesures peuvent être effectuées automatiquement et le nombre de points de mesure peut être considérablement augmenté, améliorant encore la précision de cette méthode.
Les modèles de développement basés sur l’embryon de poulet présentent plusieurs avantages dans les études toxicologiques, tels que la capacité de délivrer une dose d’exposition relativement précise, un système d’exposition indépendant dans la coquille et une manipulation facile de l’embryon en développement. En ce qui concerne la cardiotoxicité, les poulets ont un cœur relativement gros et des parois ventriculaires épaisses, ce qui permet des évaluations histomorphométriques faciles. Il y a quelques lacunes, telles que la disponibilité d’anticorps / amorces et les exigences supplémentaires en matière d’espace de cage par rapport aux rongeurs si vous élevez des poulets après l’éclosion. Néanmoins, l’embryon de poulet reste un bon modèle toxicologique alternatif à utiliser pour les évaluations potentielles de la cardiotoxicité développementale.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
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