Summary
Kippenembryo's, als klassiek ontwikkelingsmodel, worden in ons lab gebruikt om ontwikkelingscarditoxiciteiten te beoordelen na blootstelling aan verschillende milieuverontreinigingen. Blootstellingsmethoden en vastgestelde morfologische/functionele beoordelingsmethoden worden in dit manuscript beschreven.
Abstract
Kippenembryo's zijn een klassiek model in ontwikkelingsstudies. Tijdens de ontwikkeling van kippenembryo's is het tijdvenster van hartontwikkeling goed gedefinieerd en is het relatief eenvoudig om nauwkeurige en tijdige blootstelling te bereiken via meerdere methoden. Bovendien is het proces van hartontwikkeling in kippenembryo's vergelijkbaar met zoogdieren, wat ook resulteert in een hart met vier kamers, waardoor het een waardevol alternatief model is bij de beoordeling van cardiotoxiciteiten in de ontwikkeling. In ons lab wordt het kippenembryomodel routinematig gebruikt bij de beoordeling van ontwikkelingscarditoxiciteiten na blootstelling aan verschillende milieuverontreinigende stoffen, waaronder per- en polyfluoroalkylstoffen (PFAS), deeltjes (PM's), dieseluitlaat (DE) en nanomaterialen. De belichtingstijd kan vrij worden geselecteerd op basis van de behoefte, vanaf het begin van de ontwikkeling (embryonale dag 0, ED0) tot de dag voorafgaand aan het uitkomen. De belangrijkste blootstellingsmethoden omvatten luchtcelinjectie, directe micro-inademing en luchtcelinhalatie (oorspronkelijk ontwikkeld in ons lab), en de momenteel beschikbare eindpunten omvatten hartfunctie (elektrocardiografie), morfologie (histologische beoordelingen) en moleculair biologische beoordelingen (immunohistochistry, qRT-PCR, western blotting, enz.). Natuurlijk heeft het kippenembryomodel zijn eigen beperkingen, zoals beperkte beschikbaarheid van antilichamen. Niettemin, met meer laboratoria die dit model beginnen te gebruiken, kan het worden gebruikt om aanzienlijke bijdragen te leveren aan de studie van ontwikkelingscarditoxiciteiten.
Introduction
Het kippenembryo is een klassiek ontwikkelingsmodel, dat al meer dan tweehonderd jaar wordt gebruikt1. Het kippenembryomodel heeft verschillende voordelen in vergelijking met traditionele modellen. Ten eerste was de normale ontwikkeling van het kippenembryo al meer dan 70 jaar geleden heel duidelijk geïllustreerd in de Hamburger-Hamilton ensceneringsgids2, waarin in totaal 46 stadia tijdens de ontwikkeling van kippenembryo's werden gedefinieerd met nauwkeurige tijd- en morfologische kenmerken, waardoor detecties van abnormale ontwikkeling werden vergemakkelijkt. Bovendien heeft het kippenembryomodel andere kenmerken, zoals relatief goedkoop en redundant in hoeveelheid, relatief nauwkeurige blootstellingsdosiscontroles, een onafhankelijk, gesloten systeem in de schaal en eenvoudige manipulatie van het zich ontwikkelende embryo, die allemaal het potentieel ervan garanderen om te worden gebruikt als een krachtig toxicologisch beoordelingsmodel.
Bij cardiotoxiciteit heeft het kippenembryo een hart met vier kamers, vergelijkbaar met zoogdierharten, maar met dikkere wanden, waardoor gemakkelijkere morfologische beoordelingen mogelijk zijn. Bovendien maakt het kippenembryo blootstelling aan ontwikkelingsinhalatie mogelijk, wat niet mogelijk is in zoogdiermodellen: tijdens het latere stadium van ontwikkeling zal het kippenembryo overgaan van interne ademhaling naar externe ademhaling (zuurstof krijgen via de long); de laatste vereist dat het embryo het luchtcelmembraan met de snavel penetreert en lucht begint in te ademen3,waardoor de luchtcel een mini-inhalatiekamer wordt. Met behulp van dit fenomeen kunnen de toxicologische effecten van gasverontreinigingen op het hart (en andere organen) worden beoordeeld zonder dat speciale inhalatiekamerinstrumenten nodig zijn.
In dit manuscript worden verschillende blootstellings-/eindpuntbeoordelingsmethoden beschreven, die allemaal dienen om van het kippenembryo een krachtig hulpmiddel te maken bij de beoordeling van cardiotoxiciteit bij de ontwikkeling na blootstelling aan milieuverontreinigingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven procedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Qingdao University. In ons lab werden de eieren geïncubeerd in twee incubators. Eieren werden rechtop in de broedmachine gehouden en willekeurig op de planken geplaatst. De incubatieomstandigheden voor de eieren waren als volgt: de incubatietemperatuur begon bij 37,9 °C en daalde geleidelijk tot 37,1 °C naarmate de incubatie vorderde; de luchtvochtigheid begon bij 50% en nam geleidelijk toe tot 70%.
1. Blootstellingsmethoden
OPMERKING: Blootstelling van milieuverontreinigingen aan kippenembryo's kan op verschillende manieren worden bereikt. In deze sectie worden drie routinematig gebruikte methoden in detail beschreven.
- Luchtcelinjectie (figuur 1)
OPMERKING: Dit is de klassieke blootstellingsmethode aan kippenembryo's4,5,6,geschikt voor een breed scala aan materialen en kan worden uitgevoerd in een zeer breed tijdvenster, vanaf het begin van de ontwikkeling (embryonale dag nul, ED0) tot de dag voorafgaand aan het uitkomen (ED20). Zonnebloemolie wordt gebruikt als voertuig. Eerdere studies hebben aangetoond dat er geen significante veranderingen in mortaliteit, uitkomstbaarheid of lichaamsgewicht zijn waargenomen tussen onbehandelde embryo's en embryo's geïnjecteerd met zonnebloemolie7.- Bereid de volgende noodzakelijke reagentia/ gereedschappen voor: 75% ethanol, tissuepapier, metalen sonde (kan vervangen door een scherpe metalen naald / stok / awl), gesmolten paraffine, borstel, povidone jodideoplossing, pipet, pipettips, candling lamp, doseermengsel. Bereid het doseermengsel met zonnebloemolie (aanbevolen)4. Om andere verdunningsmiddelen te gebruiken, voert u voertuigcontrole uit (versus onbehandelde embryo's).
- Reinig het oppervlak van de eieren met povidonejodideoplossing (in de handel verkrijg beschikbare povidonjodideoplossing 1:5 verdund met gedeïoniseerd water) en dompel de eierschaal droog met tissuepapier zonder te schrobben. Schrobben breekt de beschermlaag die de buitenkant van de schaal bedekt.
- Kaars de eieren in een donkere kamer en markeer de luchtcel met potlood. Sluit eieren met scheuren op de schaal uit. Sluit eieren met luchtcellen aan de zijkant uit in plaats van stompe punt, omdat het zeer onwaarschijnlijk is dat deze normaal uitkomen.
- Reinig het luchtcelgebied met 75% ethanol en boor vervolgens een klein gat in het midden van het luchtcelgebied met de metalen sonde. Steek de sonde niet diep in de luchtcel of het binnenste membraan kan beschadigd raken, maar breek de schaal alleen met de punt van de sonde. Als het gat niet groot genoeg is om in een fijne pipetpunt te passen, breekt u de schaal opnieuw in de buurt van het bestaande gat, totdat het gat groot genoeg is om 10 μL pipetpunt in te brengen.
- Draai het doseermengsel krachtig en trek onmiddellijk de oplossing naar pipetpunt. Het aanbevolen injectievolume is 1 μL per 10 gram ei (bv. 5 μL injectievolume voor een ei van 50 gram), omdat grotere injectievolumes hypoxische of anoxische omstandigheden kunnen veroorzaken voor het zich ontwikkelende embryo. Bereken de concentratie van de doseeroplossing voor de gewenste mg/ei kg dosis.
- Steek de pipetpunt in het gat, waarbij de punt het binnenste membraan raakt. Verwijder langzaam het doseermengsel, houd het minstens tien seconden vast (laat de viskeuze olie volledig afgeven) en verwijder vervolgens de punt.
- Sluit het gat af met een borstel en een druppel gesmolten paraffine. Pas op dat u gesmolten paraffine niet op het binnenste membraan druppelt.
- Eenmaal verzegeld, plaatst u de eieren in de incubator totdat ze het gewenste embryonale stadium bereiken. Bij reeds ontwikkelende embryo's voert u het hele proces zo snel mogelijk uit om mogelijk embryoverlies als gevolg van lage omgevingstemperaturen te voorkomen.
- Micro-injection (Figuur 2)
OPMERKING: Dit is een meer directe blootstellingsmethode, wat resulteert in definitieve blootstelling aan de stof van belang, en vooral geschikt voor verbindingen met een korte werkingsduur (bijv. lentivirus), omdat de klassieke luchtcelinjectie tijd nodig heeft om de verbindingen het binnenste membraan te laten binnendringen. Deze methode kan ook worden geprobeerd als bevredigende resultaten niet konden worden bereikt door luchtcelinjectie. Deze methode is het meest geschikt voor vroege embryo's (tot ED2), maar kan ook worden uitgevoerd op oudere embryo's (met een hoger risico op embryoverlies).- Bereid de volgende noodzakelijke reagentia/gereedschappen voor: 75% ethanol, povidonjodideoplossing, micro-injector (5 μL), metaalsonde (kan vervangen door elke scherpe metalen naald / stick / wl moet werken), fijne tang, tape. Bereid het doseermengsel met steriele zoutoplossing, dat ook dient als injectiecontrole zonder de uitkomst aanzienlijk te beïnvloeden. Zorg voor de steriliteit van de zoutoplossing, omdat een verontreinigde injectie de mortaliteit drastisch zal verhogen.
- Reinig de eieren zoals beschreven in punt 1.1.2.
- Kaars de eieren zoals beschreven in 1.1.3.
- Reinig het luchtcelgebied met 75% ethanol en boor vervolgens een klein gat in het midden van het luchtcelgebied met de metalen sonde. Steek de sonde niet diep in de luchtcel of het binnenste membraan kan beschadigd raken, maar breek de schaal alleen met de punt van de sonde. Gebruik vervolgens de fijne tang om het gat voorzichtig te vergroten tot de diameter ongeveer 2 mm is, waardoor visuele bevestiging van het binnenste membraan mogelijk is.
- Plaats de oplossing in micro-injectiemiddel (maximaal injectievolume: 0,5 μL/10 g ei. (bijv. 2,5 μL voor een ei van 50 g) en steek de naald voorzichtig gedurende ongeveer 2-3 mm door het gat in het binnenste membraan. Doseer de oplossing voorzichtig en verwijder de naald. Houd de naald zo loodrecht mogelijk op het membraan.
- Sluit het gat af met een klein stukje tape. Bedek het gat volledig om uitdroging en de dood van embryo's tijdens de daaropvolgende incubatie te voorkomen. Vermijd echter stukken tape die te groot zijn om hypoxie te voorkomen.
- Eenmaal verzegeld, plaatst u de eieren in de incubator totdat ze het gewenste embryonale stadium bereiken. Bij het al ontwikkelen van embryo's, voer het hele proces zo snel mogelijk uit om potentieel embryoverlies als gevolg van lage omgevingstemperatuur te voorkomen.
- Inademing van luchtcellen (figuur 3)
OPMERKING: Dit is een nieuwe inhalatiemethode waarbij gebruik wordt gemaakt van de luchtcel, van waaruit het kippenembryo in een laat stadium lucht begint in te ademen. Het is geschikt voor blootstelling aan gas of aerosolen en kan zeer vroege inhalatieblootstellingen bereiken en de longen vullen met het doelgas / aerosol wanneer ze voor het eerst in het leven openen.- Bereid de volgende noodzakelijke reagentia/gereedschappen voor: Bemonsteringszak (PVF-zak, voor opslag van gas/aerosolmonster vóór blootstelling), katheternaald, spuit, metalen sonde (kan vervangen door elke scherpe metalen naald/stok/priem moet werken), tape, zuurkast.
- Reinig de eieren zoals beschreven in 1.1.2 en kaars ze zoals beschreven in 1.1.3 (het is niet nodig om luchtcel te markeren vóór incubatie) en incubeer eieren vervolgens zonder behandeling tot ED17.
- Kaars de eieren op ED17 om het luchtcelgebied te markeren.
- Bij ED18 haalt u een ei uit de incubator, reinigt u het luchtcelgebied met 75% ethanol en boort u vervolgens voorzichtig twee kleine gaatjes aan twee zijden van de luchtcel. De ene is voor injectie van gas/aerosol, de andere is voor het verdrijven van lucht. Controleer zorgvuldig de grootte van de gaten, zodat de grootte van het injectiegat net genoeg is om de katheternaald in te steken, terwijl de diameter van het uitdrijvingsgat iets groter is (ongeveer 1 mm).
- Injecteer voorzichtig 10 ml doelgas/aerosol uit het injectiegat met een spuit die aan de katheternaald is bevestigd. Injecteer lucht voor een inhalatiecontrolegroep, die geen significante verschillen mag hebben met een negatieve controlegroep8. Oefen druk uit op de katheternaald (met de juiste hoeveelheid druk kan de elastische naald tegen de schaal worden geduwd) om de lekkage uit het injectiegat te minimaliseren. Sluit beide gaten daarna onmiddellijk af met tape en breng het ei terug naar de incubator.
OPMERKING: Deze procedure moet worden uitgevoerd in een zuurkast om inademing van gas/aerosol door de bediener te voorkomen. - Herhaal de beschreven procedure na een uur om er verder voor te zorgen dat de hele luchtcel is gevuld met doelgas/aerosol (optioneel).
- Herhaal de beschreven procedure bij ED19 nogmaals (optioneel). Het herhalen van de belichting helpt om een consistente blootstelling tot het uitkomen te garanderen. Noteer de broedtijd voor een geschatte schatting van de blootstellingsduur.
- Zodra de gewenste blootstellingen zijn uitgevoerd en verzegeld, plaatst u de eieren in de broedmachine om uit te broeden. Minimaliseer de tijd die het ei buiten de incubator doorbrengt om de dood door lage omgevingstemperatuur te voorkomen.
2. Methoden voor eindpuntbeoordeling
OPMERKING: Na blootstelling van verontreinigende stoffen aan het zich ontwikkelende embryo kunnen verschillende toxiciteitsparameters worden geëvalueerd, waaronder cardiotoxiciteit. In deze sectie worden twee veelgebruikte specifieke methoden in detail beschreven.
- Elektrocardiografie (figuur 4)
OPMERKING: Het is onmogelijk om niet-invasieve elektrocardiografie te doen bij broedkippen vanwege de aanwezigheid van veren. Subcutane implantatie van elektroden is dus essentieel en vereist anesthesie. De dosis die in het laboratorium wordt gebruikt, is 33 mg/kg pentobarbital via intraperitoneale injectie (sommige kippen hebben mogelijk een dosisverhoging tot 50% nodig). Deze methode zal resulteren in stabiele elektrocardiografie bij meer dan 90% van de dieren, waardoor de hartslag kan worden geanalyseerd.- Bereid de volgende noodzakelijke reagentia/gereedschappen voor: 1% (10 mg/ml) pentobarbitale oplossing in zoutoplossing, spuit, elektrische balans, verwarming (indien nodig), een elektrocardiografie-instrument bevestigd (bijv. BL-420E+) met tweekanaals metalen naaldelektroden.
- Weeg de kippen met een balans en bereken het benodigde volume pentobarbitale oplossing en injecteer de kippen. Voor een kip die 30 g weegt, is 0,1 ml pentobarbitale oplossing nodig. Zorg ervoor dat de injectie aan de zijkant van de buik wordt gedaan, omdat de dooier zich in het midden bevindt en de injectie daar mogelijk niet effectief is.
- Wacht tot de geïnjecteerde kippen verdoofd zijn (houd de kip in de hand, als de nek geen spanning heeft en het hoofd vrij kan worden gezwaaid, is de anesthesie voldoende). Plaats kippen op de operatietafel (kachels zijn nodig als de kamertemperatuur lager is dan 20 °C).
- Plaats twee naaldelektroden van twee zijden van de buik, subcutaan. Zorg ervoor dat de naalden niet in de buikholte komen door de huid een beetje op te tillen en vanaf daar naald in te brengen. Eenmaal ingebracht, duwt u de naald voorzichtig naar voren totdat deze de zijkant van de borstholte bereikt. Zorg ervoor dat de naald niet diep in het lichaam gaat of uitsteekt van de huid.
- Doe de metingen met het elektrocardiografie-instrument. Andere soortgelijke instrumenten die elektrocardiografie kunnen gebruiken.
- Als de kippen moeten worden opgeofferd, voer dan euthanasie uit na de elektrocardiografie, omdat ze al onder narcose zijn. Als kippen willen overleven, plaats ze dan terug in hun kooien en warm tot ze wakker worden. Ze terugbrengen naar de incubator is een andere optie.
- Histomorfometrie (figuur 5)
OPMERKING: Er is een specifieke methode ontwikkeld om de juiste ventriculaire wanddikte in dwarse delen van het hart te beoordelen. Morfologische beoordeling van de juiste ventrikeldimensie via echocardiografie is niet 100% nauwkeurig vanwege de onregelmatige vorm van de rechterventrikel, en deze methode kan dienen als een goed supplement in de morfologische beoordelingen voor de rechterventrikel.- Bereid de volgende noodzakelijke reagentia/gereedschappen voor: 4% fosfaatgebufferd formaldehyde, scherp mes, fosfaatgebufferde zoutoplossing, papieren handdoek, elektrische balans, kleine schaar, algemene histologische verwerkingsmiddelen (gesorteerd ethanol, xyleen, paraffine).
- Zodra dieren zijn geofferd, gebruik je water om de veren nat te maken. Dit is om de mogelijke besmetting als gevolg van vliegende veren te minimaliseren tijdens het openen van de borstkas.
- Open de borstholte voorzichtig zonder het hart te beschadigen. Gebruik een kleine schaar om de vasculatuur te snijden en verwijder voorzichtig het hart uit de borstholte. Laat een klein stukje (ongeveer 1-2 mm) vasculatuur aan het hart bevestigd, omdat dit handig kan zijn voor latere behandeling van het hart zonder het hart te beschadigen.
- Eenmaal verwijderd, spoel het hart in koude fosfaat gebufferde zoutoplossing om bloed te verwijderen en de spier te ontspannen. Dompel vervolgens het hart droog op keukenpapier voordat u weegt voor een nauwkeurige gewichtsmeting. Doe het hart 24 uur bij kamertemperatuur in 10x volumefixatief (4% fosfaat gebufferd formaldehyde). Vaste weefsels kunnen vervolgens worden verwerkt tot paraffineblokken of jarenlang bij 4 °C worden bewaard (niet aanbevolen als immunohistochie is gepland).
- Snijd voor het insluiten de weefsels op ongeveer 60% lengte van het hart, tellend vanaf de top(figuur 5A),voor een gemakkelijkere daaropvolgende verwerking. Een microtome mes wordt aanbevolen voor een snelle en verticale reiniging. Voor kippen ouder dan één dag, maak een andere snede op ongeveer 25-30% lengte van de top voor gemakkelijkere paraffinepenetratie en om het weefsel in weefselcassettes te laten passen.
- Verwerk de weefsels met de volgende omstandigheden (pas indien nodig aan): 70% ethanol gedurende 1 uur, 80% ethanol voor 1 uur, 95% ethanol voor 1 uur x2, 100% ethanol voor 30 min x2, xyleen voor 5 min x2, paraffine (smeltpunt 52-54 °C) gedurende 1,5 uur, paraffine (smeltpunt 62-64 °C) gedurende 1 uur, en sluit de weefsels vervolgens in een 3:1 mengsel van paraffine (smeltpunt 62-64 °C) in een 3:1 mengsel van paraffine (smeltpunt 62-64 °C) en vervolgens de weefsels in te bedden in een 3:1 mengsel van paraffine (smeltpunt 62-64 °C).
- Sectie het weefsel op 6 μm dikte. Houd zorgvuldig identieke relatieve posities van de doorsneden aan door de aanwezigheid en grootte van een anatomisch oriëntatiepunt (septomarginale trabecula) in de rechterventrikel te bevestigen. Bevestig een oriëntatiepunt met matige lengte op elke sectie(figuur 5B,pijl).
- Maak twee elektronische linialen met logoprogrammeur: Liniaal 1 is een rechte lijn met 7 straalmaatlijnen bevestigd aan het middelste punt, met 22,5° tussen twee aangrenzende meetlijnen. Liniaal 2 is slechts twee loodrechte lijnen in een T-vorm (figuur 5B).
- Meet met twee softwareprogramma's: Adobe Photoshop en ImageJ.
- In Photoshop wijzigt u het formaat van liniaal 1 (GEEN hervormen) om de twee uiteinden van de liniaal op de twee uiteinden van de vrije rechterventrikelwand te plaatsen, zodat de zeven maatlijnen op liniaal 1 elk de binnenste rechterventrikelwand ontmoeten. Gebruik vervolgens liniaal 2 om loodrechte metingen te verrichten van de binnen- naar de buitenluchtwand (figuur 5B).
- Gebruik ImageJ om de zeven metingen voor elk hart te maken.
- Afhankelijk van specifieke behoeften, analyseert u de zeven metingen of het gemiddelde voor één representatieve rechter ventriculaire wanddikte. Normaliseer tot het hele hartgewicht voor specifieke veranderingen in de dikte van de ventriculaire wand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blootstellingsresultaten
Luchtcelinjectie
Luchtcelinjectie kan zich ontwikkelende kippenembryo's effectief blootstellen aan verschillende agentia, die vervolgens kunnen worden gedetecteerd in de verzamelde monsters (serum, weefsel, enz.) van embryo's / broedkippen. Hier is een voorbeeld, waarin perfluoroctaanzuur (PFOA) werd geïnjecteerd in luchtcellen en serum PFOA-concentraties vervolgens werden bepaald met Ultra-performance vloeibare chromatografie-massaspectrometrie. De serumconcentraties komen overeen met de geïnjecteerde doses, wat de effectiviteit van deze procedure aangeeft (figuur 6).
Micro-injection
Micro-injection kan de zich ontwikkelende embryo's blootstellen aan agentia die mogelijk niet effectief het binnenste membraan binnendringen, of met een korte werkingsduur, zoals lentivirus. Hier is een voorbeeld, waarbij lentivirus werd geïnjecteerd op embryonale dag twee met deze methode en vervolgens significante groene fluorescentie werd waargenomen in het hart van embryonale dag 15 embryo's, wat wijst op de effectiviteit van lentivirustransfectie (Figuur 7).
Luchtcelinfusie
Luchtcelinfusie is een nieuwe methode, die zeer goed kan werken voor een kleine hoeveelheid blootstelling aan gas/aerosolinhalatie tijdens de initiatiefase van externe ademhaling. Hier is een voorbeeld, waarbij dieseluitlaat op embryonale dag 18 en 19 in de luchtcel werd toegediend, wat resulteerde in significante fibrotische veranderingen in het hart en longweefsel (figuur 8).
Resultaten eindpuntbeoordeling
Elektrocardiografie resultaten
Vanwege de beperking van twee elektroden mogen slechts 3 elektrocardiografiekanalen worden weergegeven. Maar ze zijn voldoende om r-golven te onderscheiden, dus ze kunnen worden gebruikt voor functionele beoordelingen. In een praktijkvoorbeeld gaf elektrocardiografie van kippen die aan dieseluitlaat werden blootgesteld een aanzienlijk verkort R-R-interval aan, wat wijst op functionele veranderingen (figuur 9).
Histopathologische resultaten
Onze methode van juiste ventriculaire muurdiktebeoordeling werd met succes gebruikt in verscheidene studies5,7,8,9,10,11,12. In een van onze vorige studies resulteerde blootstelling aan dieseluitlaat in verdikte rechterventrikelwand (figuur 10).
Figuur 1: Demonstratie van luchtcelinjectie. Een onontwikkeld vruchtbaar ei wordt op de foto getoond, maar embryo's in alle verschillende stadia kunnen met deze methode worden blootgesteld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Demonstratie van micro-injection. Een vroeg embryo wordt op de foto getoond, wat het voorkeurstijdpunt voor deze methode is, maar andere tijdspunten kunnen ook worden geprobeerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Demonstratie van luchtcelinfusie. Een laat stadium embryo dat interne pipping ondergaat, wordt op de foto getoond, wat het voorkeurstijdpunt voor deze methode is. Vier fasen van de operatie werden getoond. 1: Intact embryo. 2: Er zijn twee gaten gemaakt. 3: Infusie wordt uitgevoerd. De PVF-bemonsteringszak wordt ook linksonder weergegeven. 4: Infusie is voltooid, gaten verzegeld met tape. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Demonstratie van elektrocardiografie. Linksboven liet het paneel zien hoe een broedkip werd verdoofd en elektrocardiografiemeting onderging. Rechtsboven toont het elektrocardiografie-instrument met de elektroden bevestigd. Het onderste paneel toont een representatieve elektrocardiografie verkregen van de kippen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Demonstratie van histopathologische beoordeling van de rechter ventriculaire wanddikte (Hematoxyline en eosinekleuring). (A) Demonstratie van de snijpositie van kippenharten voorafgaand aan de inbedding. (B) Demonstratie van de juiste ventriculaire wanddiktemeting. Schaalbalken vertegenwoordigen 1000 μm. Blauwe cirkels tonen de zeven meetpunten op de rechter binnenwand. Rode cirkel toont een meetpunt op de buitenste rechter ventriculaire wand. Arrow demonstreert de anatomische oriëntatiepunt voor de juiste dwarsdoorsnedepositie. Dit cijfer is gewijzigd van Jiang et al. Toxicologie. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Serumconcentratie van perfluoroctaanzuur van broedkippen na injectie met luchtcellen met 0, 0,5, 1 of 2 mg/ei kg perfluoroctaanzuur vóór incubatie. De resulterende serumconcentraties komen overeen met de geïnjecteerde doses, wat wijst op de effectiviteit van luchtcelinjectie. Dit cijfer is gewijzigd van Jiang et al. Toxicologie. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Demonstratie van de werkzaamheid van lentivirustransfectie na blootstelling aan micro-injection (Directe observatie na cryo-sectioning). Linkerpanelen toonden lichtveldafbeeldingen, terwijl rechterpanelen groene fluorescentie vertoonden voor dezelfde weefselsecties. Embryonale dag twee kippenembryo's werden geïnjecteerd met lentivirus of controle, en vervolgens geïncubeerd tot embryonale dag 15. De harten werden bevroren doorsneden en direct gevisualiseerd onder fluorescerende microscoop. Controlegroep,weinig groene fluorescentie aanwezig. (B) Lentivirus blootgestelde groep, significante groene fluorescentie werd waargenomen, wat wijst op de effectiviteit van lentivirustransfectie na micro-injection. Schaalbalken vertegenwoordigen 125 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Zhao et al. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017)11. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Demonstratie van de effectiviteit van luchtcelinfusie. Kippenembryo's werden op embryonale dag 18 en 19 doordrenkt met dieseluitlaat, waarna de uitgekomen kippen 0, 1 of 2 weken werden gehouden en vervolgens werden geofferd. De hartweefsels werden beoordeeld met Masson Trichrome kleuring voor fibrotische laesies. Pijlen toonden de fibrotische laesies (blauwe vlekken). *: statistisch anders dan controle (P<0,05 van analyse van variantie- en minst significante verschiltests). Schaalbalken vertegenwoordigen 150 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Jiang et al. Milieuvervuiling. 264, 114718 (2020)8. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: Demonstratie van de effectiviteit van elektrocardiografie. Kippenembryo's werden op embryonale dag 18 en 19 doordrenkt met dieseluitlaat, waarna de uitgekomen kippen 0, 1 of 2 weken werden gehouden en vervolgens elektrocardiografie werd uitgevoerd. Significant verkorte R-R-intervallen werden waargenomen bij de kippen die via luchtcelinfusie aan dieseluitlaat werden blootgesteld, wat de effectiviteit van de methode aangeeft. *: statistisch anders dan controle (P<0,05 van analyse van variantie- en minst significante verschiltests). Dit cijfer is gewijzigd van Jiang et al. Milieuvervuiling. 264, 114718 (20208. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: Demonstratie van de effectiviteit van de rechter ventriculaire wanddiktemeting (Hematoxyline en eosinekleuring). Kippenembryo's werden op embryonale dag 18 en 19 doordrenkt met dieseluitlaat, waarna de uitgekomen kippen 1 week werden gehouden en vervolgens histologische beoordeling van de juiste ventriculaire wanddikte werd uitgevoerd. A: Representatieve foto's van de hartdoorsneden. Let op de aanwezigheid van anatomische marker in alle juiste ventrikels (bij oudere kippen is de marker meestal iets langer op de gewenste positie, wat de nauwkeurigheid van de metingen niet beïnvloedt). B: Kwantificering van de juiste ventriculaire wanddikte, die eerst werd omgezet in werkelijke lengte met standaardglijbanen, en vervolgens genormaliseerd met het hele hartgewicht, werd dus weergegeven in de vorm van umm / ug. Blauwe pijlen: twee uiteinden van de vrije rechter ventriculaire muur. Rode pijlen: de middelste punten van de rechter ventriculaire muur. Zwarte pijlen: anatomische markering. *: statistisch anders dan controle (P<0,05 van analyse van variantie- en minst significante verschiltests). Schaalbalken vertegenwoordigen 1000 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Jiang et al. Milieuvervuiling. 264, 114718 (2020)8. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het kippenembryo is al 200 jaar een klassiek model in ontwikkelingsstudies1. Onze methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, zijn gebruikt bij de beoordeling van verschillende milieuverontreinigingen, waaronder perfluoroctaanzuur, fijnstof en dieseluitlaat met succes5,7,8,9,10,11,12. Met deze methoden werd ontwikkelingscard cardiotoxiciteit kosteneffectief en duidelijk aangegeven. Bovendien is het niet moeilijk om kippenembryo's bloot te stellen aan andere verbindingen die van belang zijn en potentiële ontwikkelingscarditoxiciteit te beoordelen.
De luchtcelinjectiemethode is een klassieke methode die eerder in vele studies13,14,15werd gebruikt, die geschikt en efficiënt is. In vergelijking met andere ontwikkelingsblootstellingsmethoden, zoals knaagdiermodellen16,17,18, heeft het directe blootstelling in een gesloten systeem, wat de variabiliteit als gevolg van maternale effecten en gevarieerde excretie aanzienlijk vermindert. Micro-injectie is een verbetering van de luchtcelinjectiemethode, die zorgt voor definitieve blootstelling op of in de nabijheid van het ontwikkelen van vroege embryo 's, die vergelijkbare effecten kunnen bereiken als bij utero-injecties in knaagdiermodellen19,20. In vergelijking met in utero-injecties maakt onze methode visuele bevestiging van de injectie mogelijk met relatief eenvoudige manipulatiestappen, en nauwkeurige injectie wordt gemakkelijk bereikt door het eigewicht te regelen, wat niet mogelijk is in de in utero-injectie, waar de werkelijke hoeveelheid en het gewicht van embryo's niet gemakkelijk worden verkregen. De infusiemethode is voornamelijk voor de beoordeling van ingeademde middelen op het longsysteem, maar cardiotoxiciteit en pulmonale toxiciteit komen vaak samen voor. Deze methode maakt gebruik van de luchtcel, waarin een kleine hoeveelheid gas of aerosol is geïnfundeerd, waardoor continue inademing van gas / aerosol mogelijk is zonder dat specifieke inhalatiekamers nodig zijn. Tegenhanger knaagdiermodellen moeten relatief grote hoeveelheden gas/aerosol en grote, dure inhalatie-instrumenten gebruiken21,22.
De twee routinematig geteste eindpunten in ons lab, elektrocardiografie en histomorfometrische beoordeling van de rechter ventriculaire wanddikte, vertegenwoordigen respectievelijk functionele en morfologische veranderingen na blootstelling aan giftige stoffen. De beoordeling van de dikte van de rechterventrikelwand heeft specifieke voordelen bij het verkrijgen van een uitgebreid begrip van de rechter ventriculaire wand, omdat de traditionele echocardiografie-gebaseerde beoordeling op rechterventrikel meestal uitdagend en niet erg nauwkeurig is, vanwege de asymmetrische en complexe halvemaanvorm van de rechterventrikel23. Onze methode kan helpen om deze onnauwkeurigheid te overwinnen door aan te vullen met aanvullende informatie over de juiste ventriculaire wanddikte op een representatieve positie. Momenteel is het allemaal handmatig, in de toekomst kunnen de metingen automatisch worden uitgevoerd en kan het aantal meetpunten aanzienlijk worden verhoogd, waardoor de nauwkeurigheid van deze methode verder wordt verbeterd.
Op kippenembryo gebaseerde ontwikkelingsmodellen hebben verschillende voordelen in toxicologische studies, zoals het vermogen om een relatief nauwkeurige blootstellingsdosis te leveren, een onafhankelijk blootstellingssysteem in de schaal en eenvoudige manipulatie van het zich ontwikkelende embryo. Met betrekking tot cardiotoxiciteit hebben kippen relatief grote harten en dikke ventriculaire wanden, waardoor eenvoudige histomorfometrische beoordelingen mogelijk zijn. Er zijn enkele tekortkomingen, zoals de beschikbaarheid van antilichamen / primers en extra kooiruimtevereisten in vergelijking met knaagdieren bij het fokken van kippen na het uitkomen. Niettemin is het kippenembryo nog steeds een goed alternatief toxicologisch model dat moet worden gebruikt voor potentiële ontwikkelingscarditoxiciteitsbeoordelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
