Summary
تستخدم أجنة الدجاج، كنموذج نمو كلاسيكي، في مختبرنا لتقييم السموم القلبية التنموية بعد التعرض لمختلف الملوثات البيئية. ويرد في هذه المخطوطة وصف لأساليب التعرض وأساليب التقييم المورفولوجية/الوظيفية المقررة.
Abstract
أجنة الدجاج هي نموذج كلاسيكي في الدراسات التنموية. خلال تطور أجنة الدجاج ، يتم تحديد النافذة الزمنية لتطور القلب بشكل جيد ، ومن السهل نسبيا تحقيق التعرض الدقيق وفي الوقت المناسب عبر طرق متعددة. وعلاوة على ذلك، فإن عملية نمو القلب في أجنة الدجاج مماثلة للثدييات، مما يؤدي أيضا إلى قلب من أربع غرف، مما يجعله نموذجا بديلا قيما في تقييم السموم القلبية التنموية. في مختبرنا، يتم استخدام نموذج جنين الدجاج بشكل روتيني في تقييم السموم القلبية التنموية بعد التعرض لمختلف الملوثات البيئية، بما في ذلك المواد لكل وبوليفلوروالكيل (PFAS)، والجسيمات (PMs)، وعوادم الديزل (DE) ومواد النانو. يمكن اختيار وقت التعرض بحرية بناء على الحاجة ، من بداية التطور (اليوم الجنيني 0 ، ED0) على طول الطريق إلى اليوم السابق للفقس. وتشمل طرق التعرض الرئيسية حقن خلايا الهواء، والتحنيم الدقيق المباشر، واستنشاق خلايا الهواء (التي تم تطويرها في الأصل في مختبرنا)، وتشمل نقاط النهاية المتاحة حاليا وظيفة القلب (تخطيط القلب)، والمورفولوجيا (التقييمات النسيجية) والتقييمات البيولوجية الجزيئية (الكيمياء المناعية، qRT-PCR، النشاف الغربي، وما إلى ذلك). وبطبيعة الحال، فإن نموذج جنين الدجاج له حدوده الخاصة، مثل محدودية توافر الأجسام المضادة. ومع ذلك، مع المزيد من المختبرات التي بدأت في استخدام هذا النموذج، يمكن استخدامه لتقديم مساهمات كبيرة في دراسة السموم القلبية التنموية.
Introduction
جنين الدجاج هو نموذج النمو الكلاسيكي، والذي تم استخدامه لأكثر من مائتي سنة1. نموذج جنين الدجاج له مزايا مختلفة بالمقارنة مع النماذج التقليدية. بادئ ذي بدء ، في وقت مبكر منذ أكثر من 70 عاما ، تم توضيح التطور الطبيعي لجنين الدجاج بوضوح شديد في دليل هامبورغر هاملتونالتدريج 2، حيث تم تعريف ما مجموعه 46 مرحلة خلال نمو جنين الدجاج مع الوقت الدقيق والخصائص المورفولوجية ، مما يسهل الكشف عن التطور غير الطبيعي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نموذج جنين الدجاج له ميزات أخرى مثل كونه منخفض التكلفة نسبيا وزائدا عن الحاجة من حيث الكمية ، وضوابط دقيقة نسبيا لجرعة التعرض ، ونظام مستقل مغلق داخل القشرة والتلاعب السهل بالجنين النامي ، وكلها تضمن إمكانية استخدامه كنموذج قوي للتقييم السمية.
في السمية القلبية ، يتميز جنين الدجاج بقلب أربع غرف ، على غرار قلوب الثدييات ولكن بجدران أكثر سمكا ، مما يسمح بتقييمات مورفولوجية أسهل. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح جنين الدجاج بالتعرض للاستنشاق التنموي ، وهو أمر غير ممكن في نماذج الثدييات: خلال المرحلة اللاحقة من التطور ، سينتقل جنين الدجاج من التنفس الداخلي إلى التنفس الخارجي (الحصول على الأكسجين عبر الرئة) ؛ هذا الأخير يتطلب أن الجنين يخترق غشاء الخلية الهوائية مع المنقار ، ويبدأ في تنفس الهواء3، مما يجعل الخلية الهوائية غرفة استنشاق مصغرة. باستخدام هذه الظاهرة ، يمكن تقييم الآثار السمية لملوثات الغاز على القلب (والأعضاء الأخرى) دون الحاجة إلى أدوات غرفة استنشاق مخصصة.
في هذه المخطوطة، يتم وصف العديد من طرق تقييم التعرض/نقطة النهاية، وكلها تعمل على جعل جنين الدجاج أداة قوية في تقييم سمية القلب التنموية بعد التعرض للملوثات البيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة لجامعة تشينغداو على جميع الإجراءات الموصوفة. في مختبرنا، تم احتضان البيض في حاضنتين. تم وضع البيض منتصبا في الحاضنة ووضع بشكل عشوائي على الرفوف. وكانت ظروف حضانة البيض على النحو التالي: بدأت درجة حرارة الحضانة عند 37.9 درجة مئوية، وانخفضت تدريجيا إلى 37.1 درجة مئوية مع استمرار الحضانة؛ بدأت الرطوبة في 50٪ وزادت تدريجيا إلى 70٪.
1. طرق التعرض
ملاحظة: يمكن أن يتحقق التعرض للملوثات البيئية لأجنة الدجاج بعدة طرق. في هذا القسم، يتم وصف ثلاث طرق مستخدمة بشكل روتيني بالتفصيل.
- حقن خلايا الهواء (الشكل 1)
ملاحظة: هذه هي طريقة التعرض الكلاسيكي لأجنة الدجاج4،5،6، مناسبة لمجموعة واسعة من المواد ، ويمكن تنفيذها في نافذة زمنية واسعة جدا ، من بداية التطور (اليوم الجنيني صفر ، ED0) على طول الطريق إلى اليوم السابق للفقس (ED20). ويستخدم زيت عباد الشمس كما السيارة. وقد أظهرت الدراسات السابقة أنه لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة في معدل الوفيات، والفقس، أو وزن الجسم بين الأجنة غير المعالجة والأجنة حقنها بزيت عباد الشمس7.- إعداد الكواشف اللازمة التالية / الأدوات: 75٪ الإيثانول، ورقة الأنسجة، مسبار معدني (يمكن أن تحل محل مع أي إبرة معدنية حادة / عصا / awl)، البارافين الذائب، فرشاة، محلول يوديد بوفيدوني، ماصة، نصائح ماصة، مصباح التعشيش، خليط الغسل. إعداد خليط ال دوسينج مع زيت عباد الشمس (مستحسن)4. لاستخدام المعادن الأخرى، قم بإجراء التحكم في السيارة (مقابل الأجنة غير المعالجة).
- تنظيف سطح البيض مع محلول يوديد بوفيدوني (المتاحة تجاريا povidone iodide الحل 1:5 المخفف مع الماء deionized)، وتراجع الجافة قشرة البيض مع ورقة الأنسجة دون تنقية. سوف تنقية كسر طبقة واقية طلاء خارج قذيفة.
- شمعة البيض في غرفة مظلمة ووضع علامة على خلية الهواء مع قلم رصاص. استبعاد البيض مع الشقوق على قذيفة. استبعاد البيض مع خلايا الهواء على الجانب بدلا من طرف حاد، وتلك هي من غير المرجح جدا أن يفقس عادة.
- تعقيم منطقة الخلية الهوائية مع الإيثانول 75٪، ومن ثم حفر حفرة صغيرة في وسط منطقة الخلية الهوائية مع التحقيق المعدني. لا عصا التحقيق في عمق الخلية الهوائية أو قد تتلف الغشاء الداخلي، بدلا من ذلك، كسر قذيفة فقط مع غيض من التحقيق. إذا لم يكن الثقب كبيرا بما يكفي ليتناسب مع طرف ماصة ناعم ، فاكسر القشرة مرة أخرى بالقرب من الثقب الحالي ، حتى يكون الثقب كبيرا بما يكفي للسماح بإدخال طرف ماصة 10 ميكرولتر.
- دوامة خليط الدوي بقوة، ورسم الحل على الفور إلى طرف ماصة. حجم الحقن الموصى به هو 1 ميكرولتر لكل 10 غرام من البيض (على سبيل المثال، 5 ميكرولتر حجم الحقن لبويضة 50 غرام) كما أحجام الحقن أكبر قد تخلق ظروف نقص الأكاسيد أو الأنوكسيك للجنين النامي. حساب تركيز محلول الجرعات لجرعة ملغم / كغ البيض المطلوب.
- أدخل طرف ماصة في الحفرة، مع طرف لمس الغشاء الداخلي. إخراج ببطء خليط ال دوسينج، عقد لمدة عشر ثوان على الأقل (السماح للنفط لزجة أن يكون الاستغناء عنها بالكامل)، ومن ثم إزالة الطرف.
- ختم الحفرة مع فرشاة وقطة من البارافين الذائب. يجب الحرص على عدم بالتنقيط البارافين الذائب على الغشاء الداخلي.
- بمجرد ختمها، ضع البيض في الحاضنة حتى تصل إلى المرحلة الجنينية المطلوبة. على الأجنة النامية بالفعل، وإجراء العملية برمتها في أقرب وقت ممكن لمنع فقدان الجنين المحتملة بسبب انخفاض درجات الحرارة البيئية.
- الميكروبيكشن (الشكل 2)
ملاحظة: هذه طريقة تعرض أكثر مباشرة ، مما يؤدي إلى التعرض النهائي لمادة الفائدة ، ومناسبة بشكل خاص للمركبات ذات المدة القصيرة للعمل (على سبيل المثال ، الفيروس العدسي) ، لأن حقن خلايا الهواء الكلاسيكية يتطلب وقتا للمركبات لاختراق الغشاء الداخلي. ويمكن أيضا أن يحاكم هذا الأسلوب إذا كان لا يمكن تحقيق نتائج مرضية عن طريق حقن خلايا الهواء. هذه الطريقة هي الأنسب للأجنة المبكرة (حتى ED2)، ولكن يمكن أيضا إجراؤها على الأجنة الأكبر سنا (مع ارتفاع خطر فقدان الجنين).- إعداد الكواشف اللازمة التالية / الأدوات: 75٪ الإيثانول، محلول يوديد بوفيدوين، حاقن الصغرى (5 ميكرولتر)، مسبار معدني (يمكن أن تحل محل مع أي إبرة معدنية حادة / عصا / awl ينبغي أن تعمل)، ملقط غرامة، الشريط. إعداد خليط الزحوض مع المالحة المعقمة، والتي هي أيضا بمثابة التحكم في الحقن دون التأثير على الفقس بشكل كبير. ضمان عقم المالحة، والحقن الملوثة سوف تزيد بشكل كبير من معدل الوفيات.
- تنظيف البيض كما هو موضح في 1.1.2.
- شمعة البيض كما هو موضح في 1.1.3.
- تعقيم منطقة الخلية الهوائية مع الإيثانول 75٪، ومن ثم حفر حفرة صغيرة في وسط منطقة الخلية الهوائية مع التحقيق المعدني. لا عصا التحقيق في عمق الخلية الهوائية أو قد تتلف الغشاء الداخلي، بدلا من ذلك، كسر قذيفة فقط مع غيض من التحقيق. ثم استخدم ملقط ناعم لتكبير الثقب بعناية حتى يبلغ قطره حوالي 2 مم ، مما يسمح بتأكيد مرئي للغشاء الداخلي.
- قم بتحميل المحلول في حقنة دقيقة (الحد الأقصى لحجم الحقن: 0.5 ميكرولتر/10 جم بيضة. (على سبيل المثال، 2.5 ميكرولتر لبيضة 50 غرام) وأدخل الإبرة بعناية من خلال الثقب في الغشاء الداخلي لمدة 2-3 ملم تقريبا. الاستغناء بلطف الحل وإزالة الإبرة. الحفاظ على الإبرة عمودي على الغشاء ممكن.
- أغلق الحفرة بقطعة صغيرة من الشريط. تغطية الثقب بالكامل لمنع جفاف الجنين والموت أثناء الحضانة اللاحقة. ومع ذلك، تجنب قطعة من الشريط التي هي كبيرة جدا لمنع نقص الأكسيجة.
- بمجرد ختمها، ضع البيض في الحاضنة حتى تصل إلى المرحلة الجنينية المطلوبة. على الأجنة النامية بالفعل، إجراء العملية برمتها في أقرب وقت ممكن لمنع فقدان الجنين المحتملة بسبب انخفاض درجة الحرارة البيئية.
- استنشاق الخلايا الهوائية (الشكل 3)
ملاحظة: هذه طريقة استنشاق جديدة تستفيد من خلية الهواء ، والتي سيبدأ منها جنين الدجاج في المرحلة المتأخرة في تنفس الهواء. وهي مناسبة للتعرض للغاز أو الهباء الجوي وقد تحقق التعرض للاستنشاق المبكر جدا في الحياة ، وتملأ الرئتين بالغاز المستهدف / الهباء الجوي عند فتحها لأول مرة في الحياة.- إعداد الكواشف اللازمة التالية / الأدوات: كيس أخذ العينات (كيس PVF، لتخزين عينة الغاز / الهباء الجوي قبل التعرض)، إبرة القسطرة، حقنة، مسبار معدني (يمكن أن تحل محل مع أي إبرة معدنية حادة / عصا / awl ينبغي أن تعمل)، الشريط، غطاء الدخان.
- تنظيف البيض كما هو موضح في 1.1.2 وشمعة لهم كما هو موضح في 1.1.3 (ليس من الضروري وضع علامة على الخلية الهوائية قبل الحضانة)، ومن ثم احتضان البيض دون علاج حتى ED17.
- شمعة البيض في ED17 للاحتفال منطقة الخلية الهوائية.
- في ED18، أخرج بيضة من الحاضنة، وطهر منطقة الخلية الهوائية بالإيثانول بنسبة 75٪، ثم حفر حفرتين صغيرتين بعناية على جانبي الخلية الهوائية. واحد هو لحقن الغاز / الهباء الجوي ، والآخر هو لطرد الهواء. تحكم بعناية في حجم الثقوب بحيث يكون حجم ثقب الحقن كافيا فقط لإدراج إبرة القسطرة ، في حين أن قطر الثقب الطارد أكبر قليلا (حوالي 1 مم).
- حقن بلطف 10 مل من الغاز المستهدف / الهباء الجوي من حفرة الحقن مع حقنة تعلق على إبرة القسطرة. حقن الهواء لمجموعة مراقبة استنشاق، والتي ينبغي أن يكون لها أي اختلافات كبيرة لمجموعة مراقبة سلبية8. ممارسة الضغط ضد إبرة القسطرة (مع كمية مناسبة من الضغط يمكن دفع الإبرة المرنة ضد قذيفة) للحد من التسرب من ثقب الحقن. ختم كل من الثقوب على الفور مع الشريط بعد ذلك، والعودة البيض إلى الحاضنة.
ملاحظة: يجب إجراء هذا الإجراء في غطاء الدخان لمنع استنشاق الغاز / الهباء الجوي من قبل المشغل. - كرر الإجراء الموصوف بعد ساعة واحدة لضمان ملء الخلية الهوائية بأكملها بالغاز المستهدف / الهباء الجوي (اختياري).
- كرر الإجراء الموصوف في ED19 مرة أخرى (اختياري). تكرار التعرض يساعد على ضمان التعرض المستمر حتى يفقس. سجل وقت الفتحة لتقدير تقريبي لمدة التعرض.
- بمجرد إجراء عمليات التعرض المرغوبة وختمها ، ضع البيض في الحاضنة للفقس. تقليل الوقت الذي تقضيه البيضة خارج الحاضنة لمنع الموت من انخفاض درجة الحرارة البيئية.
2. طرق تقييم نقطة النهاية
ملاحظة: بعد التعرض للملوثات ذات الأهمية للجنين النامي، يمكن تقييم العديد من معلمات السمية، بما في ذلك السمية القلبية. في هذا القسم، يتم وصف طريقتين محددتين متكررتي الاستخدام بالتفصيل.
- تخطيط القلب الكهربائي (الشكل 4)
ملاحظة: من المستحيل القيام تخطيط القلب غير الغازية في الدجاج الفقس بسبب وجود الريش. وبالتالي ، فإن زرع الأقطاب الكهربائية تحت الجلد أمر ضروري ، مما يتطلب تخديرا. الجرعة المستخدمة في المختبر هي 33 ملغم / كغ بنتوباربيتال عن طريق الحقن داخل الصفاق (قد تتطلب بعض الدجاج زيادة الجرعة تصل إلى 50٪). هذه الطريقة سوف تؤدي إلى تخطيط القلب مستقرة في أكثر من 90٪ من الحيوانات، مما يسمح لتحليل معدل ضربات القلب.- إعداد الكواشف/الأدوات الضرورية التالية: محلول بنتوباربيتال 1٪ (10 ملغم/مل) في محلول ملحي ومحقنة وتوازن كهربائي وسخان (إذا لزم الأمر)، وأداة تخطيط كهربية القلب (على سبيل المثال، BL-420E+) مع أقطاب إبرة معدنية بقناتين.
- وزن الدجاج مع التوازن وحساب الحجم اللازم من محلول pentobarbital وحقن الدجاج. للدجاج الذي يزن 30 غرام، هناك حاجة إلى 0.1 مل من محلول بنتوباربيتال. تأكد من أن يتم الحقن على الجانب الجانبي من البطن، كما يقع صفار في الوسط والحقن هناك قد لا تكون فعالة.
- انتظر حتى يتم تخدير الدجاج المحقون (أمسك الدجاج في يده ، إذا لم يكن للرقبة أي توتر ويمكن تأرجح الرأس بحرية ، فإن التخدير كاف). وضع الدجاج على طاولة العمليات (سخانات ضرورية إذا كانت درجة حرارة الغرفة أقل من 20 درجة مئوية).
- أدخل قطبين كهربائيين من جانبين من البطن، تحت الجلد. تأكد من أن الإبر لا تدخل تجويف البطن عن طريق رفع الجلد قليلا وإدخال إبرة من هناك. بمجرد إدخالها، ادفع الإبرة بعناية إلى الأمام حتى تصل إلى جانب تجويف الصدر. تأكد من أن الإبرة لا تذهب عميقا في الجسم أو التمسك بها من الجلد.
- إجراء القياسات باستخدام أداة تخطيط القلب. ويمكن استخدام أدوات أخرى مماثلة قادرة على تخطيط القلب.
- إذا كان الدجاج التضحية، إجراء القتل الرحيم بعد تخطيط القلب لأنها بالفعل تحت التخدير. إذا كان الدجاج البقاء على قيد الحياة، ووضعها مرة أخرى في أقفاصها ودافئة حتى الاستيقاظ. وإعادتهم إلى الحاضنة هو خيار آخر.
- علم الهستوموروميتري (الشكل 5)
ملاحظة: يتم تطوير طريقة محددة لتقييم سمك جدار البطين الأيمن في أقسام عرضية من القلب. التقييم المورفولوجي لبعد البطين الأيمن عبر تخطيط صدى القلب ليس دقيقا بنسبة 100٪ نظرا للشكل غير المنتظم للبطين الأيمن ، وقد تكون هذه الطريقة بمثابة مكمل جيد في التقييمات المورفولوجية للبطين الأيمن.- إعداد الكواشف / الأدوات الضرورية التالية: 4٪ من الفورمالديهايد العازلة بالفوسفات، والشفرة الحادة، والمحلول الملحي العازل للفوسفات، والمنشفة الورقية، والتوازن الكهربائي، والمقص الصغير، وعوامل المعالجة النسيجية العامة (الإيثانول المتدرج، الزيلين، البارافين).
- بمجرد التضحية بالحيوانات، استخدم الماء لتبلل الريش. هذا هو للحد من التلوث المحتمل بسبب الريش الطائر في حين فتح الصدر.
- افتح تجويف الصدر بعناية دون الإضرار بالقلب. استخدام مقص صغير لقطع الأوعية الدموية وإزالة القلب بلطف من تجويف الصدر. ترك قطعة صغيرة (حوالي 1-2 ملم) من الأوعية الدموية تعلق على القلب لأن هذا قد يكون مناسبا للتعامل اللاحقة للقلب دون الإضرار القلب.
- مرة واحدة إزالتها، وشطف القلب في الفوسفات البارد العازلة المالحة لإزالة الدم واسترخاء العضلات. ثم تراجع الجافة القلب على منشفة ورقية قبل وزنها لقراءة الوزن دقيقة. وضع القلب في 10x حجم مثبت (4٪ الفورمالديهايد الفوسفات المخزنة مؤقتا) لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قد تتم معالجة الأنسجة الثابتة في وقت لاحق إلى كتل البارافين، أو يتم تخزينها عند 4 درجة مئوية لسنوات (لا ينصح إذا تم التخطيط للكيمياء المناعية).
- قبل تضمين، وقطع الأنسجة في طول ما يقرب من 60٪ من القلب العد من قمة (الشكل 5A)، لتسهيل المعالجة اللاحقة. يوصى بشفرة ميكروتوم لقطع نظيف سريع ورأسي. للدجاج أقدم من يوم واحد، وجعل قطع آخر في ما يقرب من 25-30٪ طول من قمة لاختراق البارافين أسهل والسماح للأنسجة لتناسب في أشرطة الأنسجة.
- معالجة الأنسجة مع الشروط التالية (ضبط حسب الحاجة): 70٪ الإيثانول لمدة 1 ساعة، 80٪ الإيثانول لمدة 1 ساعة، 95٪ الإيثانول ل1 ساعة x2، 100٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة x2، xylene لمدة 5 دقائق x2، البارافين (نقطة انصهار 52-54 درجة مئوية) لمدة 1.5 ساعة، البارافين (نقطة انصهار 62-64 درجة مئوية) لمدة ساعة واحدة، ومن ثم تضمين الأنسجة في خليط 3:1 من البارافين (نقطة انصهار 62-64 درجة مئوية) والبارافين (نقطة انصهار 52-54 درجة مئوية).
- قسم الأنسجة في سمك 6 ميكرومتر. الحفاظ بعناية على مواقع نسبية متطابقة من المقاطع العرضية من خلال تأكيد وجود وحجم معلم تشريحي (ترابكولا الحاجز) في البطين الأيمن. تأكيد معلم ذو طول معتدل في كل قسم (الشكل 5B، السهم).
- جعل اثنين من الحكام الإلكترونية مع مبرمج الشعار: المسطرة 1 هو خط مستقيم مع 7 خطوط قياس نصف قطرها تعلق على نقطة الوسط، مع 22.5 درجة بين خطين قياس المجاورة. المسطرة 2 هي خطين عموديين فقط في شكل T (الشكل 5B).
- قياس مع اثنين من البرامج : أدوبي فوتوشوب و ImageJ.
- في Photoshop، تغيير حجم المسطرة 1 (NO إعادة تشكيل) لوضع طرفي المسطرة على طرفي جدار البطين الأيمن الحر، بحيث ستلتقي خطوط القياس السبعة على المسطرة 1 بالجدار البطيني الأيمن الداخلي. ثم استخدم المسطرة 2 لإجراء قياسات عمودية من الجدار البطيني الداخلي إلى الخارجي(الشكل 5B).
- استخدم ImageJ لإجراء القياسات السبعة لكل قلب.
- اعتمادا على احتياجات محددة، وتحليل القياسات السبعة أو المتوسط لسمك واحد ممثل جدار البطين الأيمن. تطبيع لوزن القلب كله لتغيرات محددة سمك جدار البطين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائج التعرض
حقن خلايا الهواء
يمكن لحقن خلايا الهواء أن يعرض بشكل فعال الأجنة الدجاج النامية لمختلف العوامل، والتي يمكن الكشف عنها في وقت لاحق في العينات التي تم جمعها (المصل والأنسجة، وما إلى ذلك) من الأجنة / الدجاج الفقس. وفيما يلي مثال على ذلك، حيث تم حقن حمض البيرفلوروكتانويك (PFOA) بالخلايا الهوائية، ثم تم تحديد تركيزات PFOA المصلية باستخدام قياس الطيف الكروماتوغرافي الكتلي السائل فائق الأداء. وكانت تركيزات المصل تتوافق مع الجرعات المحقونة، مما يدل على فعالية هذا الإجراء(الشكل 6).
الميكرويكشن
قد يعرض الميكرويكشن الأجنة النامية لعوامل قد لا تخترق الغشاء الداخلي بشكل فعال، أو مع فترة عمل قصيرة، مثل فيروس العدسة. هنا مثال، الذي تم حقن الفيروس العدسي في اليوم الجنيني الثاني مع هذه الطريقة ومن ثم لوحظ تفلور الخضراء كبيرة في قلب الأجنة اليوم الجنينية 15، مما يدل على فعالية العدوى الفيروس العدسي(الشكل 7).
ضخ الخلايا الهوائية
ضخ الخلايا الهوائية هو طريقة جديدة ، والتي قد تعمل بشكل جيد للغاية لكمية صغيرة من التعرض لاستنشاق الغاز / الهباء الجوي خلال مرحلة بدء التنفس الخارجي. وفيما يلي مثال على ذلك، حيث تم غرس عوادم الديزل في خلايا الهواء في اليومين الجنينيين 18 و 19، مما أدى إلى تغييرات ليفية كبيرة في القلب وكذلك الأنسجة الرئوية (الشكل 8).
نتائج تقييم نقطة النهاية
نتائج تخطيط القلب الكهربائي
نظرا للقيود المفروضة على اثنين من الأقطاب الكهربائية، يمكن عرض 3 قنوات فقط من تخطيط القلب. ولكنها كافية للتمييز بين موجات r، وبالتالي يمكن استخدامها للتقييمات الوظيفية. في مثال من واقع الحياة، تشير تخطيط القلب الكهربائي للدجاج المعرض لعوادم الديزل إلى تقصير كبير في الفاصل الزمني R-R، مما يشير إلى تغييرات وظيفية(الشكل 9).
نتائج علم الأنسجة
وقد استخدمت بنجاح طريقتنا في تقييم سمك الجدار البطيني الأيمن في العديد من الدراسات5،7،8،9،10،11،12. في واحدة من دراساتنا السابقة، أدى التعرض لعوادم الديزل إلى جدار البطين الأيمن السميك(الشكل 10).
الشكل 1: عرض توضيحي لحقن خلايا الهواء. تظهر البويضة الخصبة غير المطورة في الصورة، ولكن قد تتعرض الأجنة في جميع المراحل المختلفة لهذه الطريقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عرض توضيحي للميكروبيكشن. يظهر الجنين المبكر في الصورة، وهي نقطة وقت التعرض المفضلة لهذه الطريقة، ولكن قد يتم أيضا محاولة نقاط زمنية أخرى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مظاهرة ضخ خلايا الهواء. يظهر جنين في مرحلة متأخرة يخضع للأنابيب الداخلية في الصورة، وهي النقطة الزمنية المفضلة للتعرض لهذه الطريقة. وعرضت أربع مراحل من العملية. 1: جنين سليم. 2: تم إجراء ثقبين. 3: يتم تنفيذ التسريب. تظهر حقيبة أخذ العينات PVF أيضا في أسفل اليسار. 4: تم الانتهاء من ضخ، والثقوب مختومة مع الشريط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عرض تخطيط القلب. وأظهرت أعلى لوحة اليسار كيف تم تخدير الدجاج الفقس ويخضع لقياس تخطيط القلب. تظهر اللوحة العلوية اليمنى أداة تخطيط القلب مع الأقطاب الكهربائية المرفقة. لوحة أسفل يظهر تخطيط القلب التمثيلي المكتسبة من الدجاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مظاهرة من التقييم الهستوباثولوجي لسمك جدار البطين الأيمن (Hematoxylin و تلطيخ إيوسين). (ب)عرض توضيحي لقياس سمك الجدار البطيني الأيمن. تمثل أشرطة المقياس 1000 ميكرومتر. تظهر الدوائر الزرقاء نقاط القياس السبعة على الجدار البطيني الأيمن الداخلي. دائرة حمراء يوضح نقطة قياس على الجدار البطيني الأيمن الخارجي. السهم يوضح المعلم التشريحي لموقف المقطع العرضي المناسب. وقد تم تعديل هذا الرقم من جيانغ وآخرون علم السموم. 293 (1-3)، 97-106 (2012)7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6:تركيز المصل من حمض البيرفلوروكتانويك من الدجاج الفقس بعد حقن خلايا الهواء مع 0, 0.5, 1 أو 2 ملغ / بيضة كجم حمض البيرفلوروكتانويك قبل الحضانة. وكانت تركيزات المصل الناتجة تتوافق مع الجرعات المحقونة، مما يشير إلى فعالية حقن خلايا الهواء. وقد تم تعديل هذا الرقم من جيانغ وآخرون علم السموم. 293 (1-3)، 97-106 (2012)7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7:إظهار فعالية العدوى بفيروس العدسة بعد التعرض للتنفيث المجهري (الملاحظة المباشرة بعد المقطع المبرد). وأظهرت الألواح اليسرى صورا ميدانية خفيفة، في حين أظهرت الألواح اليمنى مضان أخضر لنفس أقسام الأنسجة. تم حقن جنيني اليوم اثنين من أجنة الدجاج مع الفيروس العدسي أو السيطرة، ومن ثم احتضانها حتى اليوم الجنيني 15. كانت القلوب مقطعة ومقسمة بشكل مباشر تحت المجهر الفلوري. (أ)مجموعة التحكم، كان هناك القليل من الفلورسينس الأخضر. (ب)مجموعة تعرض فيروس لينتي، لوحظ تفلور أخضر كبير، مما يدل على فعالية العدوى الفيروسات العدسية بعد microinjection. تمثل أشرطة المقياس 125 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشاو وآخرون علم السموم البيئية وعلم الصيدلة. 56، 136-144 (2017)11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: إظهار فعالية ضخ خلايا الهواء. تم غرس أجنة الدجاج بعوادم الديزل في اليومين الجنيني 18 و 19 ، ثم تم الاحتفاظ بالدجاج المفقس لمدة 0 أو 1 أو 2 أسابيع ثم تم التضحية به. تم تقييم أنسجة القلب مع تلطيخ ماسون تريكروم للآفات الليفية. وأظهرت الأسهم الآفات الليفية (تلطيخ الأزرق). *: يختلف إحصائيا عن التحكم (P<0.05 من تحليل التباين واختبارات الفرق الأقل أهمية). تمثل أشرطة المقياس 150 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من جيانغ وآخرون التلوث البيئي. 264، 114718 (2020)8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: إظهار فعالية تخطيط القلب. تم غرس أجنة الدجاج بعوادم الديزل في اليومين الجنيني 18 و 19 ، ثم تم الاحتفاظ بالدجاج المفقس لمدة 0 أو 1 أو 2 أسابيع ثم تم إجراء تخطيط القلب الكهربائي. ولوحظ تقصير كبير في فترات R-R في الدجاج المعرض لعوادم الديزل عن طريق ضخ خلايا الهواء، مما يشير إلى فعالية هذه الطريقة. *: يختلف إحصائيا عن التحكم (P<0.05 من تحليل التباين واختبارات الفرق الأقل أهمية). وقد تم تعديل هذا الرقم من جيانغ وآخرون التلوث البيئي. 264, 114718 (20208. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: إظهار فعالية قياس سمك الجدار البطيني الأيمن (Hematoxylin و تلطيخ إيوزين). تم غرس أجنة الدجاج بعوادم الديزل في اليومين الجنيني 18 و 19 ، ثم تم الاحتفاظ بالدجاج المفقس لمدة أسبوع واحد ، ثم تم إجراء تقييم النسيجي لسمك جدار البطين الأيمن. A: صور تمثيلية للأقسام العرضية القلب. لاحظ وجود علامة تشريحية في جميع البطينين الأيمنين (في الدجاج القديم ، تميل العلامة إلى أن تكون أطول قليلا في الموضع المطلوب ، مما لا يؤثر على دقة القياسات). B: تم تمثيل القياس الكمي لسمك الجدار البطيني الأيمن ، والتي تم تحويلها أولا إلى الطول الفعلي مع الشرائح القياسية ، ثم تطبيعها بوزن القلب كله في شكل أم / ميكروغرام. الأسهم الزرقاء: طرفي جدار البطين الأيمن الحر. الأسهم الحمراء: النقاط الوسطى من الجدار البطيني الأيمن. الأسهم السوداء: علامة تشريحية. *: يختلف إحصائيا عن التحكم (P<0.05 من تحليل التباين واختبارات الفرق الأقل أهمية). تمثل أشرطة المقياس 1000 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من جيانغ وآخرون التلوث البيئي. 264، 114718 (2020)8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم جنين الدجاج نموذجا كلاسيكيا في الدراسات التنموية لمدة 200 سنة1. وقد استخدمت أساليبنا المعروضة في هذه المخطوطة في تقييم العديد من الملوثات البيئية، بما في ذلك حمض البيرفلوروكتانويك، والجسيمات، وعوادم الديزل مع نجاح5و7و8و9و10و11و12. مع هذه الأساليب، وأشار السمية القلبية التنموية فعالة من حيث التكلفة وبوضوح. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس من الصعب الكشف عن أجنة الدجاج مع مركبات أخرى من الفائدة وتقييم السمية القلبية التنموية المحتملة.
طريقة حقن خلايا الهواء هي طريقة كلاسيكية استخدمت سابقا في العديد من الدراسات13،14،15، وهو مناسب وفعال. بالمقارنة مع طرق التعرض التنموية الأخرى ، مثل نماذج القوارض16،17،18، فإنه يتميز بالتعرض المباشر لنظام مغلق ، مما يقلل بشكل كبير من التقلبات بسبب آثار الأمهات وإفرازات متنوعة. Microinjection هو تعزيز لطريقة حقن خلايا الهواء ، وضمان التعرض النهائي على أو بالقرب من تطوير الجنين المبكر ، والتي قد تحقق تأثيرات مماثلة كما هو الحال في حقن الرحم في نماذج القوارض19،20. بالمقارنة مع حقن الرحم ، تسمح طريقتنا بتأكيد بصري للحقن مع خطوات تلاعب سهلة نسبيا ، ويتم تحقيق الحقن الدقيق بسهولة عن طريق التحكم في وزن البيض ، وهو أمر غير ممكن في حقن الرحم ، حيث لا يتم الحصول على الكمية الفعلية والوزن الفعلي للأجنة بسهولة. طريقة التسريب هي أساسا لتقييم العوامل المستنشقة على الجهاز الرئوي، ولكن السمية القلبية والرئية غالبا ما تشارك في الحدوث. تستفيد هذه الطريقة من الخلية الهوائية ، التي يتم فيها غرس كمية صغيرة من الغاز أو الهباء الجوي ، مما يسمح بالاستنشاق المستمر للغاز / الهباء الجوي دون الحاجة إلى غرف استنشاق محددة. نماذج القوارض النظيرة تحتاج إلى استخدام كميات كبيرة نسبيا من الغاز / الهباء الجوي وأجهزة استنشاق كبيرة ومكلفة21،22.
تمثل نقطتا النهاية اللذين تم اختبارهما بشكل روتيني في مختبرنا ، تخطيط القلب والتقييم الهيستومورمومتري لسمك جدار البطين الأيمن ، تغييرات وظيفية ومورفولوجية بعد التعرض السام ، على التوالي. تقييم سمك جدار البطين الأيمن له مزايا محددة في الحصول على فهم شامل للجدار البطيني الأيمن ، حيث أن التقييم التقليدي القائم على تخطيط صدى القلب على البطين الأيمن عادة ما يكون صعبا وغير دقيق جدا ، نظرا لشكل الهلال غير المتماثل والمعقد للبطين الأيمن23. قد تساعد طريقتنا في التغلب على عدم الدقة هذا عن طريق استكمال معلومات إضافية حول سمك جدار البطين الأيمن في موقف تمثيلي. حاليا هو كل دليل، في المستقبل، يمكن إجراء القياسات تلقائيا، ويمكن زيادة عدد نقاط القياس بشكل كبير، وزيادة تحسين دقة هذه الطريقة.
نماذج النمو القائمة على جنين الدجاج لها العديد من المزايا في الدراسات السمية، مثل القدرة على تقديم جرعة التعرض دقيقة نسبيا، ونظام التعرض مستقلة داخل قذيفة، وسهولة التلاعب الجنين النامية. وفيما يتعلق بالسمية القلبية، الدجاج لديها قلوب كبيرة نسبيا وجدران البطين سميكة، مما يسمح بتقييمات histomorphometrical سهلة. هناك بعض أوجه القصور، مثل توافر الأجسام المضادة / التمهيديات ومتطلبات مساحة القفص إضافية مقارنة القوارض إذا تربية الدجاج بعد فتحة. ومع ذلك، لا يزال جنين الدجاج نموذجا سميا بديلا جيدا لاستخدامه في تقييمات السمية القلبية التنموية المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 91643203، 91543208، 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
