Summary
닭 배아는 고전적인 발달 모델로서, 다양한 환경 오염 물질에 노출 된 후 발달 심장 독성을 평가하기 위해 실험실에서 사용됩니다. 확립된 노출 방법 및 형태학적/기능 적 평가 방법은 이 원고에 설명되어 있습니다.
Abstract
닭 배아는 발달 연구의 고전적인 모델입니다. 닭 배아의 발달 도중, 심장 발달의 시간 창은 잘 정의되고, 다중 방법을 통해 정확하고 적시 노출을 달성하기 위하여 상대적으로 쉽습니다. 더욱이, 닭 배아에 있는 심장 발달의 과정은 포유동물과 유사합니다, 또한 발달 심장 독성의 평가에 있는 귀중한 대안 모형을 만드는 4 개의 실내 심장귀착되는 귀착됩니다. 우리의 실험실에서, 닭 배아 모형은 일상적으로 당 및 polyfluoroalkyl 물질 (PFAS), 미립자 물질 (PMs), 디젤 배기 (DE) 및 나노 물질을 포함하여 각종 환경 오염 물질에 노출된 후에 발달 심폐제의 평가에 일상적으로 이용됩니다. 노출 시간은 개발 의 시작부터 (배아 일 0, ED0)부터 부화 전 날까지필요에 따라 자유롭게 선택할 수 있습니다. 주요 노출 방법은 공기 세포 주입, 직접 미세 주입 및 공기 세포 흡입 (원래 우리의 실험실에서 개발), 현재 사용 가능한 종점은 심장 기능 (전기 장학), 형태학 (조직학적 평가) 및 분자 생물학적 평가 (면역 조직 화학, qRT-PCR, 서쪽 블로팅 등)를 포함한다. 물론, 닭 배아 모델은 항체의 제한된 가용성과 같은 자체 제한이 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 더 많은 실험실이 모델을 활용 하기 시작, 그것은 개발 심장 독성의 연구에 중요 한 기여를 하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
닭 배아는 200 년 이상 사용 된 고전적인 발달모델입니다 1. 닭 배아 모델은 전통적인 모델에 비해 다양한 장점을 가지고 있습니다. 우선, 70여 년 전, 햄버거-해밀턴 스테이징 가이드2에서닭배아의 정상적인 발달이 매우 명확하게 설명되었으며, 닭배아 발달 시 총 46단계가 정확한 시간과 형태학적 특성으로 정의되어 비정상적인 발달의 검출을 용이하게 했습니다. 또한, 닭 배아 모델은 상대적으로 저렴한 비용과 중복수량, 비교적 정확한 노출량 조절, 쉘 내의 독립적이고 폐쇄된 시스템, 개발 배아의 간편한 조작 등 다른 특징을 가지고 있으며, 이 모든 것들은 강력한 독성 평가 모델로 사용될 수 있는 잠재력을 보장한다.
심장 독성에서 닭 배아는 포유류 심장과 비슷하지만 두꺼운 벽으로 4 개의 챔버 심장을 특징으로하여 쉽게 형태학적 평가를 할 수 있습니다. 추가적으로, 닭 배아는 포유류 모형에서 가능하지 않은 발달 흡입 노출을 허용합니다: 발달의 후반 단계에서, 닭 태아는 외부 호흡으로 내부 호흡에서 (폐를 통해 산소를 얻는); 후자는 배아가 부리를 사용하여 공기 세포막을 관통하고 공기3을호흡하기 시작하여 공기 세포를 미니 흡입 챔버로 만들어야 합니다. 이러한 현상을 이용하여, 심장(및 기타 장기)에 대한 가스 오염물질의 독성 효과는 전용 흡입 챔버 기기없이 평가될 수 있다.
이 원고에서는, 몇몇 노출/끝점 평가 방법이 기술되고, 모두는 인간 적인 발달 심폐소성 평가에 있는 강력한 공구를 환경 오염물질에 노출한 다음 개발 심폐성 의 평가에 있는 강력한 공구를 만들기 위하여 봉사합니다.
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Protocol
설명된 모든 절차는 칭다오 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 우리 실험실에서 계란은 두 개의 인큐베이터에서 배양되었습니다. 계란은 인큐베이터에서 똑바로 들고 무작위로 선반에 놓였습니다. 계란에 대한 잠복 조건은 다음과 같이: 인큐베이션 온도는 37.9°C에서 시작되고, 잠복이 진행됨에 따라 37.1°C로 점진적으로 감소; 습도는 50%에서 시작하여 점차 70%로 증가했습니다.
1. 노출 방법
참고: 닭 배아에 환경 오염 물질의 노출은 여러 가지 방법으로 달성 될 수있다. 이 섹션에서는 정기적으로 사용되는 세 가지 메서드가 자세히 설명되어 있습니다.
- 공기 세포 주입(그림 1)
참고: 이것은 닭 배아4,5,6에대한 고전적인 노출 방법이며, 광범위한 재료에 적합하며, 개발 의 시작부터 매우 넓은 시간 창에서 수행 될 수있다 (배아 일 제로, ED0) 해치 (ED20) 전날까지 모든 방법을. 해바라기 기름은 차량으로 사용됩니다. 이전 연구는 사망률에 있는 중요한 변경이, 부화성, 또는 체중에 있는 아무 중요한 변경도 해바라기 기름으로 주입된 처리되지 않은 태아와 태아 사이에서 관찰되지 않았다는 것을 보여주었습니다7.- 다음 필요한 시약 / 도구를 준비 : 75 % 에탄올, 티슈 페이퍼, 금속 프로브 (날카로운 금속 바늘 / 스틱 / awl로 대체 할 수 있음), 용융 파라핀, 브러시, 포비단 요오드 용액, 파이펫, 파이펫 팁, 캔들 램프, 투약 혼합물. 해바라기 기름 (권장)4와함께 도징 혼합물을 준비합니다. 다른 희석제를 사용하려면 차량 제어(치료되지 않은 배아 대)를 수행합니다.
- 포비단 요오드 용액(시판 가능한 포비단 요오드 용액 1:5희석)으로 계란 표면을 청소하고, 문지르지 않고 티슈 페이퍼로 달걀 껍질을 담급드하십시오. 스크러빙은 쉘의 외부코팅 보호층을 깨뜨릴 것입니다.
- 어두운 방에서 계란을 양수와 연필로 공기 세포를 표시합니다. 껍질에 균열이 있는 계란을 제외합니다. 일반적으로 부화할 가능성이 높기 때문에 무딘 팁 대신 측면에 공기 세포가 있는 계란을 제외하십시오.
- 공기 전지 영역을 75% 에탄올로 소독한 다음 금속 프로브로 공기 전지 영역의 중앙에 작은 구멍을 뚫습니다. 프로브를 공기 세포 깊숙이 붙이지 마십시오 또는 내부 멤브레인이 손상될 수 있으며, 대신 프로브의 끝으로 껍질을 부러뜨릴 수 있습니다. 구멍이 미세한 파이펫 팁에 들어갈 만큼 크지 않으면 구멍이 10 μL 파이펫 팁을 삽입할 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 기존 구멍 부근에서 쉘을 다시 부수십시오.
- 도징 혼합물을 적극적으로 소용돌이쳐 파이펫 팁에 즉시 용액을 그립니다. 권장 주사 부피는 더 큰 주입 량이 개발 배아를 위한 저산소 또는 해부학 조건을 만들 수 있기 때문에 계란 10 그램 당 1 μL (예를 들어, 50 그램 계란을 위한 5 μL 주사 부)입니다. 원하는 mg/egg kg 복용량에 대 한 투약 솔루션의 농도 계산 합니다.
- 팁이 내부 멤브레인에 닿는 구멍에 파이펫 팁을 삽입합니다. 천천히 투약 혼합물을 배출하고, 적어도 10 초 동안 유지 (점성 오일이 완전히 분배 되도록) 다음 팁을 제거합니다.
- 브러시와 녹은 파라핀 한 방울로 구멍을 밀봉합니다. 녹인 파라핀을 내부 막에 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오.
- 일단 밀봉되면, 그들이 원하는 배아 단계에 도달 할 때까지 인큐베이터에 계란을 배치합니다. 이미 개발 중인 배아에서 환경 온도가 낮기 때문에 잠재적인 배아 손실을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 전체 프로세스를 수행합니다.
- 미세 주입(그림 2)
참고: 이것은 보다 직접적인 노출 방법, 관심 물질의 확실 한 노출 결과, 그리고 특히 짧은 기간 작업 화합물에 대 한 적합 (예를 들어, 렌즈 바이러스), 고전적인 공기 세포 주입 내부 막에 침투 하는 화합물에 대 한 시간이 필요 하기 때문에. 이 방법은 또한 만족하는 결과가 공기 세포 주입에 의해 달성될 수 없는 경우에 시도될 수 있습니다. 이 방법은 초기 배아 (ED2까지)에 가장 적합하지만 더 오래된 배아 (배아 손실의 위험이 높은)에서도 수행 될 수 있습니다.- 다음 필요한 시약 / 도구를 준비 : 75 % 에탄올, povidone 요오드 용액, 마이크로 인젝터 (5 μL), 금속 프로브 (날카로운 금속 바늘 / 스틱 / Awl작동으로 대체 할 수 있음), 미세 한 집게, 테이프. 멸균 식염수로 주입 혼합물을 준비하여 부화에 크게 영향을 주지 않으면서 주입 제어 역할을합니다. 오염된 주사가 사망률을 극적으로 증가시킬 것이기 때문에 식염수의 멸균을 보장하십시오.
- 1.1.2에 설명된 대로 계란을 청소하십시오.
- 1.1.3에 설명된 대로 달걀을 양초합니다.
- 공기 전지 영역을 75% 에탄올로 소독한 다음 금속 프로브로 공기 전지 영역의 중앙에 작은 구멍을 뚫습니다. 프로브를 공기 세포 깊숙이 붙이지 마십시오 또는 내부 멤브레인이 손상될 수 있으며, 대신 프로브의 끝으로 껍질을 부러뜨릴 수 있습니다. 그런 다음 미세 한 집게를 사용하여 직경이 약 2mm가 될 때까지 구멍을 조심스럽게 확대하여 내부 멤브레인을 시각적으로 확인할 수 있습니다.
- 용액을 마이크로인젝터(최대 사출 량: 0.5 μL/10 g 계란)에 적재합니다. (예를 들어, 50 g 달걀의 경우 2.5 μL) 바늘을 구멍을 통해 내막에 조심스럽게 삽입하여 약 2-3 mm. 용액을 부드럽게 분배하고 바늘을 제거합니다. 바늘을 가능한 한 멤브레인에 수직으로 유지하십시오.
- 작은 테이프조각으로 구멍을 봉인합니다. 구멍은 구멍을 완전히 덮어 후속 배양 중에 배아 탈수와 사망을 방지합니다. 그럼에도 불구하고 저산소증을 방지하기에는 너무 큰 테이프 조각을 피하십시오.
- 일단 밀봉되면, 그들이 원하는 배아 단계에 도달 할 때까지 인큐베이터에 계란을 배치합니다. 이미 개발 중인 배아에서 환경 온도가 낮기 때문에 잠재적인 배아 손실을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 전체 프로세스를 수행합니다.
- 공기 세포 흡입(그림 3)
참고 : 이것은 후기 닭 배아가 공기를 호흡하기 시작하는 공기 세포를 활용하는 새로운 흡입 방법입니다. 가스 또는 에어로졸 노출에 적합하며 매우 초기 흡입 노출을 달성하고, 생애 처음으로 열 때 대상 가스/에어로졸로 폐를 채울 수 있습니다.- 다음과 같은 필요한 시약 / 도구를 준비 : 샘플링 가방 (PVF 가방, 노출 전에 가스 / 에어로졸 샘플의 저장), 카테터 바늘, 주사기, 금속 프로브 (어떤 날카로운 금속 바늘 / 스틱 / Awl 작동해야으로 대체 할 수 있습니다), 테이프, 연기 후드.
- 1.1.2에 설명된 바와 같이 계란을 청소하고 1.1.3(인큐베이션 전에 공기 세포를 표시할 필요는 없다)에 설명된 대로 달걀을 세척한 다음 ED17까지 치료 없이 계란을 배양한다.
- 공기 세포 영역을 표시하기 위해 ED17에서 계란을 양초.
- ED18에서는 인큐베이터에서 계란을 꺼내 75%에탄올로 공기 셀 영역을 살균한 다음 공기 셀의 양면에 두 개의 작은 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. 하나는 가스 /에어로졸의 주입을위한 것입니다, 다른 하나는 공기의 추방이다. 사출 구멍의 크기가 카테터 바늘을 삽입하기에 충분하도록 구멍의 크기를 주의 깊게 제어하고 추방 구멍의 직경은 약간 더 큽니다 (약 1mm).
- 카테터 바늘에 부착 된 주사기와 함께 주입 구멍에서 대상 가스 / 에어로졸 10 mL을 부드럽게 주입하십시오. 음의대조군(8)에큰 차이가 없어야 하는 흡입 대조군에 대해 공기를 주입한다. 카테터 바늘에 대한 압력을 가하여(적절한 양의 압력으로 탄성 바늘을 쉘에 밀어 붙일 수 있음)을 사용하여 사출 구멍으로부터누출을 최소화하십시오. 그 후 테이프로 즉시 두 구멍을 밀봉하고 계란을 인큐베이터로 돌려보십시오.
참고: 이 절차는 작업자가 가스/에어로졸을 흡입하는 것을 방지하기 위해 연기 후드에서 수행해야 합니다. - 전체 공기 셀이 대상 가스/에어로졸(선택 사항)으로 채워지도록 1시간 후에 설명된 절차를 반복합니다.
- ED19에서 설명된 절차를 다시 반복합니다(선택 사항). 노출을 반복하면 부화때까지 일관된 노출을 보장하는 데 도움이 됩니다. 노출 지속 시간의 대략적인 추정을 위해 해치 시간을 기록합니다.
- 원하는 노출이 수행되고 밀봉되면 부화를 위해 인큐베이터에 계란을 배치하십시오. 계란이 낮은 환경 온도에서 죽음을 방지하기 위해 인큐베이터 외부에서 보내는 시간을 최소화하십시오.
2. 엔드포인트 평가 방법
참고: 개발 중인 배아에 대한 관심 물질의 노출에 따라 심폐소심 독성을 포함한 여러 독성 매개 변수를 평가할 수 있습니다. 이 섹션에서는 자주 사용되는 두 가지 특정 메서드가 자세히 설명되어 있습니다.
- 전기장 검사(그림 4)
참고: 깃털의 존재로 인해 새끼 닭에서 비 침습적 일렉트로카로그래피를 하는 것은 불가능합니다. 따라서 전극의 피하 이식이 필수적이므로 마취가 필요합니다. 실험실에서 사용 하는 복용량은 33 mg/kg pentobarbital 관음 주사를 통해 (일부 닭까지 필요할 수 있습니다 50% 복용량 증가). 이 방법은 동물의 90% 이상에서 안정적인 전기 장학을 초래하여 심박수 의 분석을 가능하게합니다.- 다음과 같은 필요한 시약 /도구를 준비 : 식염수, 주사기, 전기 균형, 히터 (필요한 경우), 2 채널 금속 바늘 전극이있는 전기 장기 계측기 (예 : BL-420E +)에서 1 % (10 mg / mL) 펜토 바르비탈 용액을 준비하십시오.
- 균형을 가진 닭의 무게를 측정하고 펜토 바르비탈 솔루션의 필요한 볼륨을 계산하고 닭을 주입. 30g의 무게가 있는 닭고기의 경우 펜토바르비탈 용액 0.1mL이 필요합니다. 노른자가 중간에 위치하고 주사가 효과적이지 않을 수 있기 때문에 주사가 복부의 측면 측면에서 수행되는지 확인하십시오.
- 주입 된 닭이 마취 될 때까지 기다립니다 (손에 닭을 잡고, 목의 긴장이없고 머리가 자유롭게 휘둘렀을 경우, 마취는 충분하다). 수술 대에 닭을 놓습니다 (실온이 20 °C 미만인 경우 히터가 필요합니다).
- 복부의 양면에서 두 개의 바늘 전극을 피하로 삽입합니다. 바늘이 피부를 조금 들어 올리고 거기에서 바늘을 삽입하여 복강에 들어가지 않도록하십시오. 삽입되면 가슴 구멍의 측면에 도달 할 때까지 조심스럽게 바늘을 앞으로 밀어 넣습니다. 바늘이 몸 깊숙이 들어가거나 피부에서 튀어 나오지 않도록 하십시오.
- 전기 장기 계측기로 측정합니다. 전기 장학 능력이있는 다른 유사한 계측기는 사용될 수 있습니다.
- 닭을 희생해야하는 경우, 그들은 이미 마취하에 있기 때문에 전기 장학 후 안락사를 수행. 닭이 살아남는다면, 다시 새장에 넣고 깨어날 때까지 따뜻하게 하십시오. 인큐베이터로 반납하는 것은 또 다른 옵션입니다.
- 히스토모홈트리(그림 5)
참고: 심장의 횡방향 섹션에서 올바른 심실 벽 두께를 평가하기 위한 구체적인 방법이 개발되었습니다. 에코카르디그래피를 통한 오른쪽 심실 치수의 형태학적 평가는 오른쪽 심실의 불규칙한 형상으로 인해 100% 정확하지 않으며, 이 방법은 오른쪽 심실의 형태학적 평가에 좋은 보충제로 작용할 수 있다.- 다음과 같은 필요한 시약 / 도구를 준비 : 4 % 인산염 완충 포름알데히드, 날카로운 블레이드, 인산염 완충식 식염수, 종이 타월, 전기 균형, 작은 가위, 일반 조직학적 처리제 (등급 에탄올, 자일렌, 파라핀).
- 동물이 희생되면 물을 사용하여 깃털을 적시게 하십시오. 이것은 가슴을 열면서 날아다니는 깃털로 인한 잠재적 오염을 최소화하기 위한 것입니다.
- 심장을 손상시키지 않고 가슴 구멍을 조심스럽게 엽니다. 작은 가위를 사용하여 혈관을 자르고 가슴 구멍에서 심장을 부드럽게 제거합니다. 심장에 부착된 작은 조각(약 1-2mm)을 남겨두면 심장을 손상시키지 않고 심장을 후속 으로 처리하는 것이 편리할 수 있기 때문이다.
- 제거되면, 혈액을 제거하고 근육을 이완감기 인산염 완충식염식염에 심혼을 헹요. 그런 다음 정확한 체중 감소를 위해 계량하기 전에 종이 타월에 심장을 말리십시오. 심장을 실온에서 24시간 동안 10배 부피 고정(4% 인산염 완충 포름알데히드)에 넣습니다. 고정 된 조직은 이후 파라핀 블록으로 처리될 수 있거나 수년 동안 4 °C에서 저장 될 수 있습니다 (면역 조직 화학이 계획된 경우 권장되지 않음).
- 포함하기 전에, 쉬운 후속 처리를 위해 정점(도 5A)에서계산 심장카운트의 약 60 % 길이로 조직을 잘라. 빠르고 수직으로 깨끗한 절단을 위해 마이크로톤 블레이드를 권장합니다. 하루 보다 오래 된 닭의 경우, 쉽게 파라핀 침투를 위해 정점에서 약 25-30 % 길이로 또 다른 절단을하고 조직이 조직 카세트에 들어갈 수 있도록하십시오.
- 다음 조건 (필요에 따라 조정)으로 조직을 처리하십시오 : 1 h에 대한 70 % 에탄올, 1 h에 대한 80 % 에탄올, 1 h x2에 대한 95 % 에탄올, 100% 에탄올 30분 x2, 자일렌 5분 x2, 파라핀(융점 52-54°C) 1.5h, 파라핀(융점 62-64°C)은 1h, 파라핀(62-64°C)을 1시간 동안, 파라핀(융점 62-64°C)을 1시간 동안 한 다음, 파라핀(62-64°C)의 3:1 혼합물에 조직을 포함하였다(용융점 62-64°C) 및 54°C(파핀)의 혼합물을 포함하였다.
- 6 μm 두께로 조직을 단면. 오른쪽 심실에 해부학 적 랜드 마크 (septomarginal trabecula)의 존재와 크기를 확인하여 단면의 동일한 상대 적 위치를 신중하게 유지합니다. 각 섹션에 적당한 길이의 랜드마크를 확인합니다(그림5B,화살표).
- 로고 프로그래머가 있는 두 개의 전자 눈금자를 만드세요: 눈금자 1은 중간점에 7반경 측정 선이 부착된 직선이며, 인접한 두 측정선 사이에 22.5°가 있습니다. 눈금자 2는 T 모양(도 5B)의 두 개의 수직 선에불과합니다.
- 두 가지 소프트웨어 프로그램으로 측정: 어도비 포토샵과 ImageJ.
- 포토샵에서는 눈금자 1(재구성 없음)을 조정하여 눈금자 1의 양단에 눈자의 양끝을 배치하여 눈금자 1의 7개의 측정선이 각각 오른쪽 심실 벽을 충족하도록 한다. 그런 다음 눈금자 2를 사용하여 내부에서 외부 심실 벽(도 5B)까지수직 측정을 합니다.
- ImageJ를 사용하여 각 심장에 대해 7가지 측정을 할 수 있습니다.
- 특정 요구에 따라 하나의 대표적인 오른쪽 심실 벽 두께에 대한 7가지 측정 또는 평균을 분석합니다. 특정 심실 벽 두께 변화에 대 한 전체 심장 무게로 정규화.
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Representative Results
노출 결과
공기 세포 주입
공기 세포 주입은 효과적으로 다양한 에이전트에 개발 닭 배아를 노출 할 수 있습니다, 이는 이후 배아 / 부화 닭의 수집 샘플 (혈청, 조직 등)에서 검출 될 수있다. 다음은 퍼플루오로옥타노산(PFOA)이 공기세포를 주입하고 혈청 PFOA 농도가 그 후 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석법으로 결정된 예입니다. 혈청 농도는 주입된 투여량에 대응하여 이 절차의 효과를나타낸다(도 6).
미세 주입
미세 주입은 내부 막을 효과적으로 관통하지 않을 수 있는 제제또는 렌티바이러스와 같은 짧은 작용 기간으로 개발 중인 배아를 노출시킬 수 있다. 여기에 렌티바이러스가 배아일 2일째에 주입된 다음 배아일 15배의 심장부에서 상당한 녹색 형광이 관찰된 예로, 렌티바이러스 트랜스페션의 효과를나타낸다(도 7).
공기 세포 주입
공기 세포 주입은 외부 호흡의 개시 단계에서 소량의 가스 /에어로졸 흡입 노출에 대해 매우 잘 작동 할 수있는 새로운 방법입니다. 다음은 18일과 19일 배아일에서 디젤 배기가스가 공기세포로 주입되어 폐 조직뿐만 아니라 심장에 상당한 섬유증변화를 초래하는 예이다(도8).
엔드포인트 평가 결과
전기 장학 결과
2개의 전극의 제한으로 인해, 전극의 단지 3개의 채널이 표시될 수 있습니다. 그러나 그들은 r 파를 구별하기에 충분하므로 기능 성 평가에 사용될 수 있습니다. 실제 예에서, 디젤 배기에 노출된 닭의 전기장술은 기능적 변화를 나타내는 R-R 간격을 현저히 단축시켰다(도9).
조직 병리학 결과
당사의 우심실 벽 두께 평가방법은5,7,8,9,10,11,12에서성공적으로 사용되었다. 우리의 이전 연구 중 하나에서, 디젤 배기 노출은 두꺼운 오른쪽 심실 벽(그림 10)의결과.
그림 1: 공기 세포 주입의 데모. 개발되지 않은 비옥한 계란은 그림에 나타나지만 모든 다른 단계에서 배아는이 방법으로 노출 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미세 주입의 데모. 초기 배아는 이 방법에 대해 선호하는 노출 시점인 그림에 나타내지만, 다른 시간 지점도 시도될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 공기 세포 주입의 데모. 내부 배관을 겪고 있는 후기 단계 배아는 이 방법에 대해 선호하는 노출 시점인 그림에 나타난다. 작업의 네 단계가 표시되었다. 1: 그대로 배아. 2: 두 개의 구멍이 만들어졌습니다. 3: 주입이 수행되고 있습니다. PVF 샘플링 백은 왼쪽 하단에도 표시됩니다. 4 : 주입이 완료되고, 구멍은 테이프로 밀봉됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 전기 장학 의 데모. 왼쪽 상단 패널은 부화 닭이 마취되고 전기 장학 측정을 받는 방법을 보여 주였습니다. 오른쪽 상단 패널은 전극이 부착된 전극 계측기를 보여줍니다. 하단 패널은 닭에서 획득 한 대표적인 전기 장전법을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 오른쪽 심실 벽 두께(헤마톡클린 및 에오신 염색)의 조직병리학적 평가를 시연합니다. (A)포함되기 전에 닭의 심장 절단 위치의 시연. (B)오른쪽 심실 벽 두께 측정의 데모. 스케일 바는 1000 μm을 나타냅니다. 블루 서클은 오른쪽 심실 벽의 7가지 측정 점을 보여줍니다. 빨간색 원은 외부 오른쪽 심실 벽의 측정 지점을 보여줍니다. 화살표는 적절한 단면 위치에 대한 해부학 적 랜드 마크를 보여줍니다. 이 수치는 장 외 독성학에서수정되었습니다. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 인큐베이션 전에 0, 0.5, 1 또는 2 mg/egg kg 퍼플루오로옥타노산으로 공기 세포 주입 후 부화 닭으로부터 퍼플루오로옥타노산의 혈청 농도. 결과 혈청 농도 주입 된 복용량에 대응, 공기 세포 주입의 효과 나타내는. 이 수치는 장 외 독성학에서수정되었습니다. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 미세 주입 노출 에 따른 렌즈바이러스 형질 전환 효능의 데모(극저온 절제 에 따른 직접 관찰). 왼쪽 패널은 가벼운 필드 이미지를 보였고, 오른쪽 패널은 동일한 조직 섹션에 대한 녹색 형광을 보였습니다. 배아 의 날 두 닭 배아는 렌티 바이러스 또는 제어로 주입된 다음 배아 일 15 일까지 배양되었습니다. 심장은 형광 현미경으로 고정되어 직접 시각화되었습니다. (A)대조군, 작은 녹색 형광이 존재하였다. (B)렌티바이러스 노출군, 유의한 녹색 형광이 관찰되어, 마이크로주입 후 렌티바이러스 형질의 효과를 나타낸다. 스케일 바는 125 μm을 나타냅니다. 이 수치는 Zhao 외. 환경 독성학 및 약리학에서수정되었습니다. 56,136-144 (2017)11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 공기 세포 주입의 효과의 데모. 닭 배아는 배아 일 18 과 19에서 디젤 배기와 주입된 다음 부화 닭은 0, 1 또는 2 주 동안 보관한 다음 희생되었습니다. 심장 조직은 섬유성 병변을 위한 Masson Trichrome 염색으로 평가되었습니다. 화살표는 섬유성 병변 (파란 염색)을 보여주었습니다. *: 제어와 통계적으로 다릅니다(분산 분석및 가장 유의한 차이 테스트에서 P<0.05). 스케일 바는 150 μm을 나타냅니다. 이 수치는 장 외 환경 오염에서수정되었습니다. 264, 114718 (2020)8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 전기 장학의 효과의 데모. 닭 배아는 배아 일 18 및 19에서 디젤 배기와 주입된 다음 부화 닭은 0, 1 또는 2 주 동안 보관된 다음 전기 장술을 수행했습니다. 공기 세포 주입을 통해 디젤 배기가스에 노출된 닭에서 R-R 간격이 현저히 단축되어 방법의 효과를 나타낸다. *: 제어와 통계적으로 다릅니다(분산 분석및 가장 유의한 차이 테스트에서 P<0.05). 이 수치는 장 외 환경 오염에서수정되었습니다. 264, 114718 (20208. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 오른쪽 심실 벽 두께 측정 (헤마톡클린 및 에신 염색)의 효과의 데모. 닭 배아는 배아 일 18 및 19에서 디젤 배기로 주입된 다음 부화 닭을 1 주일 동안 보관한 다음 오른쪽 심실 벽 두께에 대한 조직학적 평가를 수행했습니다. A: 하트 단면의 대표적인 사진. 모든 오른쪽 심실에 해부학 마커의 존재를 주의하십시오 (오래된 닭의 경우 마커는 측정의 정확성에 영향을 미치지 않는 원하는 위치에서 조금 더 긴 경향이 있습니다). B: 먼저 표준 슬라이드로 실제 길이로 변환된 다음 전체 심장 무게로 정규화된 오른쪽 심실 벽 두께의 정량화는 um/ug의 형태로 표현되었다. 파란색 화살표: 무료 오른쪽 심실 벽의 두 끝. 빨간색 화살표: 오른쪽 심실 벽의 중간 점입니다. 검은 화살표 : 해부학 마커. *: 제어와 통계적으로 다릅니다(분산 분석및 가장 유의한 차이 테스트에서 P<0.05). 스케일 바는 1000 μm을 나타냅니다. 이 수치는 장 외 환경 오염에서수정되었습니다. 264, 114718 (2020)8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
닭 배아는 200 년 동안 발달 연구에서 고전적인 모델이었다1. 본 원고에 제시된 당사의 방법은 퍼플루오로옥타노산, 미립자 물질 및 디젤 배기기간을포함한 여러 환경 오염 물질의 평가에 사용되어5,7,8,9,10,11,12. 이러한 방법으로, 발달 심장 독성비용 효과적이고 명확하게 표시되었다. 게다가, 다른 화합물로 닭 배아를 노출하고 잠재적인 발달 심폐소독을 평가하는 것은 어렵지 않습니다.
상기 공기세포주입 방법은 이전에 많이 연구된13,14,15에서이전에 사용되는 고전적인 방법이며, 이는 편리하고 효과적이다. 설치류모델(16,17,18)과같은 다른 발달 노출 방법에 비해, 모성 효과및 다양한 배설로 인한 변동성을 크게 감소시키는 폐쇄시스템에 직접 노출되는 것을 특징으로 한다. 미세 주입은 초기 배아 개발 부근에 확실한 노출을 보장하여 설치류모델(19,20)에서자궁 주사와 유사한 효과를 얻을 수 있는 공기 세포 주입 방법의 향상이다. 자궁 주사와 비교하여, 우리의 방법은 비교적 쉽게 조작 단계를 가진 주사의 시각적 확인을 허용하고, 정확한 주사는 태아의 실제 양과 무게를 쉽게 취득하지 않는 자궁 주사에서 불가능계란 무게를 제어하여 쉽게 달성된다. 주입 방법은 주로 폐 계에 흡입된 제제의 평가를 위한 것이지만, 심폐 독성및 폐 독성은 종종 공존한다. 이 방법은 소량의 가스 또는 에어로졸이 주입되어 특정 흡입 챔버없이 가스 / 에어로졸을 연속 흡입 할 수있는 공기 셀을 활용합니다. 대응 설치류 모델은 상대적으로 많은 양의 가스/에어로졸과 크고 값비싼 흡입기기(21,22)를사용해야 합니다.
우리의 실험실에서 두 개의 일상적으로 테스트 된 끝점은, 전자 장학 및 오른쪽 심실 벽 두께의 조직 학적 평가, 각각 독성 노출 다음 기능적 및 형태학적 변화를 나타냅니다. 오른쪽 심실 벽 두께의 평가는 오른쪽 심실에 대한 기존의 심초음파 기반 평가가 일반적으로 도전적이고 매우 정확하지 않기 때문에 오른쪽 심실 벽 의 비대칭 및 복잡한 초승자모양(23)에대한 포괄적인 이해를 얻는 데 특별한 장점이 있다. 우리의 방법은 대표 위치에서 오른쪽 심실 벽 두께에 대한 추가 정보를 보충하여이 부정확성을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 모든 매뉴얼이며, 미래에는 측정이 자동으로 이루어질 수 있으며 측정 점수가 상당히 증가하여 이 방법의 정확도를 더욱 향상시킬 수 있습니다.
닭 배아 기반 발달 모델은 비교적 정확한 노출 용량을 제공하는 능력, 쉘 내의 독립적 인 노출 시스템 및 개발 배아의 쉬운 조작과 같은 독성 연구에서 몇 가지 장점이 있습니다. 심장 독성과 관련하여 닭은 상대적으로 큰 심장과 두꺼운 심실 벽을 가지고 있어 조직학적 평가를 쉽게 할 수 있습니다. 부화 후 닭을 사육하는 경우 설치류에 비해 항체 / 프라이머의 가용성 및 여분의 케이지 공간 요구 사항과 같은 몇 가지 단점이 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 닭 배아는 여전히 잠재적인 발달 심장 독성 평가에 사용 하는 좋은 대체 독성 모델.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 번호 91643203, 91543208, 81502835)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
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