Summary
Куриные эмбрионы, как классическая модель развития, используются в нашей лаборатории для оценки кардиотоксицности развития после воздействия различных загрязнителей окружающей среды. В данной рукописи описаны методы воздействия и установленные методы морфологической/функциональной оценки.
Abstract
Куриные эмбрионы являются классической моделью в исследованиях развития. Во время развития куриных эмбрионов временное окно развития сердца четко определено, и относительно легко достичь точного и своевременного воздействия с помощью нескольких методов. Кроме того, процесс развития сердца у куриных эмбрионов аналогичен млекопитающим, что также приводит к четырехкамерному сердцу, что делает его ценной альтернативной моделью в оценке кардиотоксицитов развития. В нашей лаборатории модель куриного эмбриона обычно используется для оценки кардиотоксичности развития после воздействия различных загрязнителей окружающей среды, включая пер- и полифторалкильные вещества (PFAS), твердые частицы (PMs), дизельные выхлопные газы (DE) и наноматериалы. Время воздействия может быть свободно выбрано в зависимости от необходимости, от начала развития (эмбриональный день 0, ЭД0) до дня, предшествуя вылуплению. Основные методы воздействия включают инъекцию воздушных клеток, прямую микроинъекцию и вдыхание воздушных клеток (первоначально разработанные в нашей лаборатории), а доступные в настоящее время конечные точки включают сердечную функцию (электрокардиография), морфологию (гистологические оценки) и молекулярно-биологические оценки (иммуногистохимия, qRT-ПЦР, вестерн-блоттинг и т. Д.). Конечно, модель куриного эмбриона имеет свои ограничения, такие как ограниченная доступность антител. Тем не менее, поскольку все больше лабораторий начинают использовать эту модель, она может быть использована для внесения значительного вклада в изучение кардиотоксицитов развития.
Introduction
Куриный эмбрион является классической моделью развития, которая используется уже более двухсот лет1. Модель куриного эмбриона имеет различные преимущества по сравнению с традиционными моделями. Прежде всего, еще более 70 лет назад нормальное развитие куриного эмбриона было очень четко проиллюстрировано в руководстве по постановке Гамбургера-Гамильтона2,в котором в общей сложности 46 стадий развития куриного эмбриона были определены с точным временем и морфологическими характеристиками, облегчающими обнаружение аномального развития. Кроме того, модель куриного эмбриона имеет и другие особенности, такие как относительно низкая стоимость и избыточность по количеству, относительно точный контроль дозы воздействия, независимая, закрытая система внутри оболочки и легкое манипулирование развивающимся эмбрионом, что гарантирует его потенциал для использования в качестве мощной токсикологической модели оценки.
При кардиотоксичности куриный эмбрион имеет четырехкамерное сердце, похожее на сердца млекопитающих, но с более толстыми стенками, что позволяет легче проводить морфологические оценки. Кроме того, куриный эмбрион допускает ингаляционное воздействие на развитие, что невозможно в моделях млекопитающих: на более поздней стадии развития куриный эмбрион перейдет от внутреннего дыхания к внешнему дыханию (получение кислорода через легкие); последний требует, чтобы эмбрион проник через воздушную клеточную мембрану клювом, и начал дышать воздухом3,делая воздушную клетку мини-ингаляционной камерой. Используя это явление, токсикологическое воздействие газовых загрязнителей на сердце (и другие органы) может быть оценено без необходимости использования специальных инструментов ингаляционной камеры.
В этой рукописи описано несколько методов оценки экспозиции/конечных точек, все из которых служат для того, чтобы сделать куриный эмбрион мощным инструментом в оценке кардиотоксичности развития после воздействия загрязнителей окружающей среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Циндао. В нашей лаборатории яйца инкубировали в двух инкубаторах. Яйца держали вертикально в инкубаторе и случайным образом размещали на полках. Условия инкубации яиц были следующими: температура инкубации начиналась с 37,9 °C и постепенно снижалась до 37,1 °C по мере инкубации; влажность началась с 50% и постепенно увеличивалась до 70%.
1. Методы воздействия
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие загрязнителей окружающей среды на куриные эмбрионы может быть достигнуто несколькими способами. В этом разделе подробно описаны три обычно используемых метода.
- Впрыск воздушных клеток (Рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это классический метод воздействия на куриные эмбрионы4,5,6,подходящий для широкого спектра материалов, и может быть выполнен в очень широком временном окне, от начала развития (эмбриональный нулевой день, ED0) до дня, предшествующих вылуплению (ED20). В качестве транспортного средства используется подсолнечное масло. Предыдущие исследования показали, что между необработанными эмбрионами и эмбрионами, введенными подсолнечным маслом7,не наблюдалось существенных изменений в смертности, выводимости или массе тела.- Подготовьте следующие необходимые реагенты/инструменты: 75% этанол, папиросная бумага, металлический зонд (может заменить любой острой металлической иглой/палочкой/шилом), расплавленный парафин, щетка, раствор йодида повидона, пипетка, наконечники пипеток, лампа для консервирования, дозирование смеси. Приготовить дозировку смеси с подсолнечным маслом (рекомендуется)4. Чтобы использовать другие разлучительные вещества, выполните контроль транспортного средства (по сравнению с необработанными эмбрионами).
- Очистите поверхность яиц раствором повидона йодида (коммерчески доступный раствор йодида повидона 1:5, разбавленный деионизированной водой) и окуните яичную скорлупу папиросной бумагой без очистки. Скрабирование разрушит защитный слой покрытия внешней стороны оболочки.
- Засвейте яйца в темной комнате и пометьте воздушную ячейку карандашом. Исключите яйца с трещинами на скорлупе. Исключите яйца с воздушными клетками сбоку вместо тупого кончика, так как они вряд ли вылупятся нормально.
- Продезинфицируйте область воздушной ячейки 75% этанолом, а затем просверлите небольшое отверстие в центре области воздушной ячейки металлическим зондом. Не втыкайте зонд глубоко в воздушную ячейку, иначе внутренняя мембрана может быть повреждена, вместо этого только разбейте оболочку кончиком зонда. Если отверстие недостаточно велико, чтобы поместиться в тонком наконечнике пипетки, снова разбейте оболочку в непосредственной близости от существующего отверстия, пока отверстие не будет достаточно большим, чтобы позволить вставить наконечник пипетки 10 мкл.
- Энергично вращаем дозировку смеси и сразу же вытягиваем раствор до кончика пипетки. Рекомендуемый объем инъекции составляет 1 мкл на 10 грамм яйцеклетки (например, 5 мкл для инъекционного объема для 50-граммового яйца), поскольку большие объемы инъекций могут создавать гипоксические или неоксические условия для развивающегося эмбриона. Рассчитайте концентрацию дозированного раствора для желаемой дозы мг/яйцо кг.
- Вставьте наконечник пипетки в отверстие, при этом наконечник касается внутренней мембраны. Медленно выталкивайте дозирующую смесь, подерживайте не менее десяти секунд (дайте вязкому маслу полностью дозироваться), а затем извлеките наконечник.
- Запечатайте отверстие щеткой и каплей расплавленного парафина. Будьте осторожны, чтобы не капать расплавленным парафином на внутреннюю мембрану.
- После запечатывания поместите яйца в инкубатор до тех пор, пока они не достигнут желаемой эмбриональной стадии. На уже развивающихся эмбрионах выполните весь процесс как можно скорее, чтобы предотвратить потенциальную потерю эмбрионов из-за низких температур окружающей среды.
- Микроинъекция (Рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это более прямой метод воздействия, приводящий к окончательному воздействию интересующего вещества, и особенно подходящий для соединений с короткой продолжительностью действия (например, лентивируса), поскольку классическая инъекция воздушных клеток требует времени для проникновения соединений во внутреннюю мембрану. Этот метод также может быть опробован, если удовлетворительные результаты не могут быть достигнуты путем инъекции воздушных клеток. Этот метод лучше всего подходит для ранних эмбрионов (до ED2), но также может быть выполнен на более старых эмбрионах (с более высоким риском потери эмбрионов).- Подготовьте следующие необходимые реагенты/инструменты: 75% этанол, раствор йодида повидона, микроинжектор (5 мкл), металлический зонд (может заменить любой острой металлической иглой/палочкой/шилом), тонкие щипцы, лента. Приготовьте дозировку смеси со стерильным физиологическим раствором, который также служит в качестве контроля впрыска, не влияя существенно на выводимость. Обеспечьте стерильность физиологического раствора, так как зараженная инъекция резко увеличит смертность.
- Очистите яйца, как описано в 1.1.2.
- Подсвейте яйца, как описано в 1.1.3.
- Продезинфицируйте область воздушной ячейки 75% этанолом, а затем просверлите небольшое отверстие в центре области воздушной ячейки металлическим зондом. Не втыкайте зонд глубоко в воздушную ячейку, иначе внутренняя мембрана может быть повреждена, вместо этого только разбейте оболочку кончиком зонда. Затем используйте тонкие щипцы, чтобы осторожно увеличить отверстие до тех пор, пока диаметр не будет примерно 2 мм, что позволит визуально подтвердить внутреннюю мембрану.
- Загрузите раствор в микроинжектор (максимальный объем инъекции: 0,5 мкл/10 г яйца. (например, 2,5 мкл на яйцо 50 г) и осторожно ввести иглу через отверстие во внутреннюю мембрану примерно на 2-3 мм. Аккуратно дозируйте раствор и удалите иглу. Держите иглу как можно более перпендикулярной мембране.
- Запечатайте отверстие небольшим кусочком ленты. Полностью закройте отверстие, чтобы предотвратить обезвоживание эмбриона и гибель во время последующей инкубации. Тем не менее, избегайте кусочков ленты, которые слишком велики, чтобы предотвратить гипоксию.
- После запечатывания поместите яйца в инкубатор до тех пор, пока они не достигнут желаемой эмбриональной стадии. На уже развивающихся эмбрионах выполните весь процесс как можно скорее, чтобы предотвратить потенциальную потерю эмбриона из-за низкой температуры окружающей среды.
- Вдыхание воздушных клеток(Рисунок 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это новый метод вдыхания, используя преимущества воздушной клетки, из которой эмбрион курицы поздней стадии начнет дышать воздухом. Он подходит для воздействия газов или аэрозолей и может достигать очень ранних в жизни ингаляционных воздействий и заполнять легкие целевым газом / аэрозолем, когда они открываются впервые в жизни.- Подготовьте следующие необходимые реагенты/инструменты: Мешок для отбора проб (мешок PVF, для хранения образца газа/аэрозоля перед воздействием), игла катетера, шприц, металлический зонд (может заменить любой острой металлической иглой/шилом должен работать), лента, вытяжной капюшон.
- Очистите яйца, как описано в 1.1.2, и подсвейте их, как описано в 1.1.3 (не обязательно маркировать воздушную клетку перед инкубацией), а затем инкубируйте яйца без обработки до ED17.
- Подсвейте яйца при ED17, чтобы отметить область воздушной ячейки.
- При ED18 выньте яйцо из инкубатора, продезинфицируйте область воздушной ячейки 75% этанолом, а затем тщательно просверлите два небольших отверстия с двух сторон воздушной ячейки. Один предназначен для впрыска газа/аэрозоля, другой - для выталкивания воздуха. Тщательно контролируйте размер отверстий, чтобы размера инъекционного отверстия было достаточно для введения иглы катетера, при этом диаметр выталкивного отверстия немного больше (примерно 1 мм).
- Осторожно вводят 10 мл целевого газа/аэрозоля из инъекционного отверстия шприцем, прикрепленным к игле катетера. Впрыскивайте воздух для ингаляционной контрольной группы, которая не должна иметь существенных отличий от отрицательной контрольной группы8. Приложите давление к игле катетера (при соответствующем давлении эластичная игла может быть прижата к оболочке), чтобы свести к минимуму утечку из инъекционного отверстия. После этого оба отверстия сразу же запечатайте скотчем и верните яйцо в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна выполняться в вытяжном капюшоне для предотвращения вдыхания газа/аэрозоля оператором. - Повторите описанную процедуру через один час, чтобы в дальнейшем убедиться, что вся воздушная ячейка заполнена целевым газом / аэрозолем (необязательно).
- Повторите описанную процедуру при ED19 еще раз (необязательно). Повторение экспозиции помогает обеспечить постоянное воздействие до вылупления. Запишите время вывода для приблизительной оценки продолжительности воздействия.
- После того, как желаемые экспозиции были выполнены и запечатаны, поместите яйца в инкубатор для вылупления. Минимизируйте время, которое яйцо проводит вне инкубатора, чтобы предотвратить смерть от низкой температуры окружающей среды.
2. Методы оценки конечных точек
ПРИМЕЧАНИЕ: После воздействия загрязняющих веществ, представляющих интерес для развивающегося эмбриона, можно оценить несколько параметров токсичности, включая кардиотоксичность. В этом разделе подробно описаны два часто используемых специфических метода.
- Электрокардиография (Рисунок 4)
ПРИМЕЧАНИЕ: Нельзя делать неинвазивную электрокардиографию у птенцов из-за наличия перьев. Таким образом, подкожная имплантация электродов необходима, требующая анестезии. Доза, используемая в лаборатории, составляет 33 мг / кг пентобарбитала через внутрибрюшинную инъекцию (некоторым курам может потребоваться увеличение дозы до 50%). Этот метод приведет к стабильной электрокардиографии у более чем 90% животных, что позволит анализировать частоту сердечных сокращений.- Приготовьте следующие необходимые реагенты/инструменты: 1% (10 мг/мл) раствор пентобарбитала в физиологическом растворе, шприце, электрическом балансе, нагревателе (при необходимости), электрокардиографическом приборе, прикрепленном (например, BL-420E+) с двухканальными металлическими игольчатыми электродами.
- Взвесьте цыплят с весами и рассчитайте необходимый объем раствора пентобарбитала и вводят цыплятам. Для курицы, которая весит 30 г, необходимо 0,1 мл раствора пентобарбитала. Убедитесь, что инъекция сделана с боковой стороны живота, так как желток расположен посередине и инъекция там может быть неэффективной.
- Подождите, пока введенные цыплята обезболиваются (держите курицу в руке, если шея не имеет напряжения и голову можно свободно размахивать, достаточно обезболивания). Поместите кур на операционный стол (обогреватели необходимы, если температура в помещении ниже 20 °C).
- Вводят два игольчатых электрода с двух сторон живота, подкожно. Убедитесь, что иглы не попадают в брюшную полость, немного приподняв кожу и вставив оттуда иглу. После введения осторожно толкайте иглу вперед, пока она не достигнет боковой стороны грудной полости. Следите за тем, чтобы игла не уходила глубоко в тело и не торчала из кожи.
- Сделайте измерения с помощью электрокардиографического прибора. Могут использоваться и другие подобные инструменты, способные к электрокардиографии.
- Если цыплят должны быть принесены в жертву, выполните эвтаназию после электрокардиографии, так как они уже находятся под наркозом. Если куры хотят выжить, поместите их обратно в клетки и согрейтесь до пробуждения. Возвращение их в инкубатор — еще один вариант.
- Гистоморфометрия (Рисунок 5)
ПРИМЕЧАНИЕ: Разработан специальный метод оценки толщины стенки правого желудочка в поперечных отделах сердца. Морфологическая оценка размеров правого желудочка с помощью эхокардиографии не является на 100% точной из-за неправильной формы правого желудочка, и этот метод может служить хорошим дополнением к морфологическим оценкам для правого желудочка.- Подготовьте следующие необходимые реагенты/инструменты: 4% фосфатный буферизованный формальдегид, острое лезвие, фосфатно-буферный физиологический раствор, бумажное полотенце, электрический баланс, небольшие ножницы, общие гистологические технологические агенты (градуированный этанол, ксилол, парафин).
- После того, как животные приносятся в жертву, используйте воду, чтобы намочить перья. Это необходимо для того, чтобы свести к минимуму потенциальное загрязнение из-за летящих перьев при открытии груди.
- Осторожно откройте грудную полость, не повредив сердце. Используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать сосудистую клетку и аккуратно удалить сердце из грудной полости. Оставьте небольшой кусочек (примерно 1-2 мм) сосудистой области, прикрепленный к сердцу, так как это может быть удобно для последующего обращения с сердцем без повреждения сердца.
- После удаления промыть сердце холодным фосфатным буферным физиологическим раствором, чтобы удалить кровь и расслабить мышцы. Затем окуните высушите сердце на бумажное полотенце перед взвешиванием для точного считывания веса. Поместите сердце в фиксатор 10x объема (4% фосфатного буферизованный формальдегид) на 24 часа при комнатной температуре. Фиксированные ткани могут быть впоследствии обработаны в парафиновые блоки или храниться при 4 °C в течение многих лет (не рекомендуется, если планируется иммуногистохимия).
- Перед встраиванием разрезают ткани примерно на 60% длины сердца, отсчитывающего от вершины(рисунок 5А),для облегчения последующей обработки. Микротомное лезвие рекомендуется для быстрого и вертикального чистого среза. Для цыплят старше одного дня сделайте еще один разрез длиной примерно 25-30% от вершины для более легкого проникновения парафина и чтобы ткань поместились в тканевые кассеты.
- Обрабатывают ткани следующими условиями (корректируют по мере необходимости): 70% этанол в течение 1 ч, 80% этанол в течение 1 ч, 95% этанол в течение 1 ч х2, 100% этанол в течение 30 мин х2, ксилол в течение 5 мин х2, парафин (температура плавления 52-54 °С) в течение 1,5 ч, парафин (температура плавления 62-64 °С) в течение 1 ч, а затем встраивают ткани в смесь парафина 3:1 (температура плавления 62-64 °С) и парафина (температура плавления 52-54 °С).
- Срез ткани толщиной 6 мкм. Тщательно поддерживайте идентичные относительные положения поперечных сечений, подтверждая наличие и размер анатомического ориентира (септомаргинальной трабекулы) в правом желудочке. Подтвердите ориентир с умеренной длиной на каждом участке(рисунок 5B,стрелка).
- Сделайте две электронные линейки с помощью Logo programmer: Линейка 1 представляет собой прямую линию с 7 радиусными линиями измерения, прикрепленными к средней точке, с 22,5 ° между двумя соседними линиями измерения. Линейка 2 представляет собой всего две перпендикулярные линии в форме Т(рисунок 5B).
- Измерение с помощью двух программ: Adobe Photoshop и ImageJ.
- В Photoshop измените размер линейки 1 (БЕЗ изменения формы), чтобы поместить два конца линейки на два конца свободной правой желудочковой стенки, чтобы семь линий измерения на линейке 1 встречались с внутренней правой стенкой желудочка. Затем используйте линейку 2, чтобы сделать перпендикулярные измерения от внутренней до наружной стенки желудочка(рисунок 5B).
- Используйте ImageJ, чтобы сделать семь измерений для каждого сердца.
- В зависимости от конкретных потребностей, проанализируйте семь измерений или среднее значение для одной репрезентативной толщины стенки правого желудочка. Нормализуйте вес всего сердца при изменении удельной толщины стенки желудочков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты экспозиции
Инъекция воздушных клеток
Инъекция воздушных клеток может эффективно подвергать развивающиеся куриные эмбрионы воздействию различных агентов, которые впоследствии могут быть обнаружены в собранных образцах (сыворотка, ткань и т. д.) эмбрионов / птенцов цыплят. Вот пример, в котором перфтороктановая кислота (PFOA) вводилась в воздушную клетку, а концентрации PFOA в сыворотке крови затем определяли с помощью ультраэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Сывороточные концентрации соответствовали введенным дозам, что указывало на эффективность данной процедуры(рисунок 6).
Микроинъекция
Микроинъекция может подвергать развивающиеся эмбрионы воздействию агентов, которые могут не эффективно проникать во внутреннюю мембрану или с короткой продолжительностью действия, таких как лентивирус. Вот пример, в котором лентивирус вводили на второй день эмбриона этим методом, а затем наблюдалась значительная зеленая флуоресценция в сердце эмбриональных эмбрионов 15-го дня, что указывает на эффективность трансфекции лентивируса(рисунок 7).
Инфузия воздушных ячеек
Инфузия воздушных клеток является новым методом, который может очень хорошо работать при небольшом количестве ингаляционного воздействия газа / аэрозоля во время стадии инициации внешнего дыхания. Вот пример, в котором дизельные выхлопные газы вливали в воздушную клетку на эмбриональных день 18 и 19, что приводило к значительным фиброзным изменениям в сердечной, а также легочной тканях(Рисунок 8).
Результаты оценки конечных точек
Результаты электрокардиографии
Из-за ограничения двух электродов может быть показано только 3 канала электрокардиографии. Но их достаточно, чтобы различать волны r, поэтому их можно использовать для функциональных оценок. В реальном примере электрокардиография цыплят, подвергшихся воздействию дизельных выхлопных газов, показала значительно сокращенный интервал R-R, что указывает на функциональные изменения(рисунок 9).
Результаты гистопатологии
Наш метод оценки толщины стенки правого желудочка был успешно использован в нескольких исследованиях5,7,8,9,10,11,12. В одном из наших предыдущих исследований воздействие дизельных выхлопных газов привело к утолщению стенки правого желудочка(рисунок 10).
Рисунок 1:Демонстрация инъекции воздушных клеток. На рисунке показана неразвитая плодородная яйцеклетка, но эмбрионы на всех разных стадиях могут подвергаться воздействию с помощью этого метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Демонстрация микроинъекции. На рисунке показан ранний эмбрион, который является предпочтительной точкой времени экспозиции для этого метода, но также могут быть опробованы и другие временные точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Демонстрация инфузии воздушных ячеек. На рисунке показан эмбрион поздней стадии, подвергающийся внутреннему пиппингу, который является предпочтительной точкой времени экспозиции для этого метода. Были показаны четыре этапа операции. 1: Интактный эмбрион. 2: Сделано два отверстия. 3: Проводится инфузия. Мешок для отбора проб PVF также показан в левом нижнем углу. 4: Настой закончен, отверстия заклеена скотчем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Демонстрация электрокардиографии. Верхняя левая панель показала, как детеныш курицы был обезболен и прошел электрокардиографическое измерение. На верхней правой панели показан электрокардиографический прибор с прикрепленными электродами. Нижняя панель показывает репрезентативную электрокардиографию, полученную от цыплят. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Демонстрация гистопатологической оценки толщины стенки правого желудочка (окрашивание гематоксилином и эозином). (А) Демонстрация режущего положения куриных сердец перед встраиванием. (B)Демонстрация измерения толщины стенки правого желудочка. Шкала брусков составляет 1000 мкм. Синие круги демонстрируют семь точек измерения на внутренней стенке правого желудочка. Красный круг демонстрирует точку измерения на наружной стенке правого желудочка. Стрелка демонстрирует анатомический ориентир для соответствующего положения поперечного сечения. Эта цифра была изменена из Jiang et al. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Сывороточная концентрация перфтороктановой кислоты у птенцов после инъекции в воздушные клетки с 0, 0,5, 1 или 2 мг/яйцо кг перфтороктановой кислоты перед инкубацией. Полученные сывороточные концентрации соответствовали введенным дозам, что указывало на эффективность инъекции воздушных клеток. Эта цифра была изменена из Jiang et al. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Демонстрация эффективности трансфекции лентивируса после воздействия микроинъекции (Прямое наблюдение после криосекционирования). Левые панели показывали изображения светового поля, в то время как правые панели показывали зеленую флуоресценцию для тех же участков ткани. Эмбриональным эмбрионам второго дня куриный эмбрион вводили лентивирус или контрольный, а затем инкубировали до эмбрионального дня 15. Сердца были заморожены и непосредственно визуализированы под флуоресцентным микроскопом. (A) Контрольная группа, присутствовала небольшая зеленая флуоресценция. (B)В группе, подвергающейся воздействию лентивируса, наблюдалась значительная зеленая флуоресценция, что указывает на эффективность трансфекции лентивируса после микроинъекции. Шкала брусков составляет 125 мкм. Эта цифра была изменена из Zhao et al. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017)11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:Демонстрация эффективности инфузии воздушных клеток. Куриные эмбрионы настояли дизельным выхлопом на 18 и 19-й эмбриональные дни, а затем вылупившихся цыплят держали в течение 0, 1 или 2 недель, а затем приносили в жертву. Ткани сердца оценивали с помощью окрашивания Трихрома Массона для фиброзных поражений. Стрелки показывали фиброзные поражения (синее окрашивание). *: статистически отличается от контрольного (P<0,05 от анализа дисперсии и наименее значимых разностных тестов). Шкала брусков составляет 150 мкм. Эта цифра была изменена из Jiang et al. Загрязнение окружающей среды. 264, 114718 (2020)8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9:Демонстрация эффективности электрокардиографии. Куриные эмбрионы наливали дизельным выхлопом на 18 и 19-й эмбриональный день, а затем вылупившихся цыплят держали в течение 0, 1 или 2 недель, а затем проводили электрокардиографию. Значительно сокращенные интервалы R-R наблюдались у цыплят, подвергшихся воздействию дизельных выхлопных газов посредством инфузии воздушных ячеек, что свидетельствует об эффективности метода. *: статистически отличается от контрольного (P<0,05 от анализа дисперсии и наименее значимых разностных тестов). Эта цифра была изменена из Jiang et al. Загрязнение окружающей среды. 264, 114718 (20208. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10:Демонстрация эффективности измерения толщины стенки правого желудочка (окрашивание гематоксилином и эозином). Куриные эмбрионы настояли дизельным выхлопом на 18 и 19-й эмбриональные сутки, а затем вылупившихся цыплят держали в течение 1 недели, а затем проводили гистологическую оценку толщины стенки правого желудочка. О: Репрезентативные снимки поперечных сечений сердца. Обратите внимание на наличие анатомического маркера во всех правильных желудочках (у пожилых цыплят маркер имеет тенденцию быть немного длиннее в нужном положении, что не влияет на точность измерений). B: Количественная оценка толщины стенки правого желудочка, которая сначала была преобразована в фактическую длину с помощью стандартных слайдов, а затем нормализована с весом всего сердца, таким образом, была представлена в виде um/ug. Синие стрелки: два конца свободной стенки правого желудочка. Красные стрелки: средние точки стенки правого желудочка. Черные стрелки: анатомический маркер. *: статистически отличается от контрольного (P<0,05 от анализа дисперсии и наименее значимых разностных тестов). Шкала брусков составляет 1000 мкм. Эта цифра была изменена из Jiang et al. Загрязнение окружающей среды. 264, 114718 (2020)8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Куриный эмбрион был классической моделью в исследованиях развития в течение 200 лет1. Наши методы, представленные в этой рукописи, были использованы при оценке нескольких загрязнителей окружающей среды, включая перфтороктановую кислоту, твердые частицы и дизельные выхлопные газы с успехом5,7,8,9,10,11,12. С помощью этих методов кардиотоксичность развития была показана экономически эффективно и четко. Кроме того, нетрудно подвергнуть куриные эмбрионы воздействию других интересующих соединений и оценить потенциальную кардиотоксичность развития.
Метод инъекции воздушно-клеточных клеток является классическим методом, используемым ранее во многих исследованиях13,14,15,который является удобным и эффективным. По сравнению с другими методами воздействия на развитие, такими как модели грызунов16,17,18,он отличается прямым воздействием в замкнутую систему, что значительно снижает вариабельность из-за материнских эффектов и различной экскреции. Микроинъекция представляет собой усовершенствование метода инъекции воздушно-клеточных клеток, обеспечивающее окончательное воздействие на или в непосредственной близости от развивающегося раннего эмбриона, которое может достигать аналогичных эффектов, как и при внутриутробных инъекциях в моделях грызунов19,20. По сравнению с внутриутробными инъекциями, наш метод позволяет визуально подтвердить инъекцию относительно легкими этапами манипуляции, а точная инъекция легко достигается путем контроля веса яйцеклетки, что невозможно в внутриутробной инъекции, где фактическое количество и вес эмбрионов нелегко приобрести. Инфузионный метод в основном предназначен для оценки ингаляционных агентов на легочной системе, но часто возникает сердечно-токсичность и легочная токсичность. Этот метод использует преимущества воздушной ячейки, в которую вливают небольшое количество газа или аэрозоля, что позволяет непрерывно вдыхать газ / аэрозоль без необходимости специальных ингаляционных камер. Аналоги моделей грызунов должны использовать относительно большое количество газа/аэрозоля и большие, дорогие ингаляционные инструменты21,22.
Две регулярно тестируемые конечные точки в нашей лаборатории, электрокардиография и гистоморфометрическая оценка толщины стенки правого желудочка, представляют собой функциональные и морфологические изменения после воздействия токсиканта, соответственно. Оценка толщины стенки правого желудочка имеет определенные преимущества в получении всестороннего понимания стенки правого желудочка, так как традиционная оценка на основе эхокардиографии на правом желудочке обычно является сложной и не очень точной из-за асимметричной и сложной формы полумесяца правого желудочка23. Наш метод может помочь преодолеть эту неточность, дополнив дополнительную информацию о толщине стенки правого желудочка в репрезентативном положении. В настоящее время все это ручное, в будущем измерения могут быть сделаны автоматически и количество точек измерения может быть значительно увеличено, что еще больше повышает точность этого метода.
Модели развития на основе куриного эмбриона имеют ряд преимуществ в токсикологических исследованиях, таких как способность доставлять относительно точную дозу воздействия, независимая система воздействия в оболочке и легкое манипулирование развивающимся эмбрионом. Что касается кардиотоксичности, куры имеют относительно большие сердца и толстые стенки желудочков, что позволяет легко проводить гистоморфометрические оценки. Есть некоторые недостатки, такие как наличие антител / праймеров и дополнительные требования к пространству в клетке по сравнению с грызунами, если они выращивают цыплят после вылупления. Тем не менее, куриный эмбрион по-прежнему является хорошей альтернативной токсикологической моделью, которая будет использоваться для оценки потенциальной кардиотоксичности развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
