Summary
Tavuk embriyoları, klasik bir gelişim modeli olarak, laboratuvarımızda çeşitli çevresel kirleticilere maruz kalmanın ardından gelişimsel kardiyotoksioksiklikleri değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda maruz kalma yöntemleri ve kurulan morfolojik/fonksiyonel değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır.
Abstract
Tavuk embriyoları gelişimsel çalışmalarda klasik bir modeldir. Tavuk embriyolarının gelişimi sırasında, kalp gelişiminin zaman aralığı iyi tanımlanmıştır ve birden fazla yöntemle hassas ve zamanında maruz kalma elde etmek nispeten kolaydır. Ayrıca, tavuk embriyolarındaki kalp gelişimi süreci memelilere benzer, ayrıca dört odalı bir kalple sonuçlanır ve gelişimsel kardiyotoksikliklerin değerlendirilmesinde değerli bir alternatif model haline getirir. Laboratuvarımızda tavuk embriyo modeli, per-ve polifloroalkil maddeler (PFAS), partikül madde (PM'ler), dizel egzoz (DE) ve nano malzemeler dahil olmak üzere çeşitli çevresel kirleticilere maruz kalmanın ardından gelişimsel kardiyotoksioksikliklerin değerlendirilmesinde rutin olarak kullanılmaktadır. Maruz kalma süresi, gelişimin başlangıcından (embriyonik gün 0, ED0) yumurtadan çıkmadan önceki güne kadar ihtİyaca göre serbestçe seçilebilir. Başlıca maruz kalma yöntemleri arasında hava hücresi enjeksiyonu, doğrudan mikroenjeksiyon ve hava hücresi solunması (başlangıçta laboratuvarımızda geliştirilmiştir) ve şu anda mevcut uç noktalar arasında kardiyak fonksiyon (elektrokardiyografi), morfoloji (histolojik değerlendirmeler) ve moleküler biyolojik değerlendirmeler (immünofistokimya, qRT-PCR, batı şişkinliği vb.) sayılmalıdır. Tabii ki, tavuk embriyo modelinin antikorların sınırlı mevcudiyeti gibi kendi sınırlamaları vardır. Bununla birlikte, daha fazla laboratuvarın bu modeli kullanmaya başlamasıyla, gelişimsel kardiyotoksikliklerin çalışmasına önemli katkılar sağlamak için kullanılabilir.
Introduction
Tavuk embriyosu, iki yüz yılı aşkın bir süredir kullanılan klasik bir gelişim modelidir1. Tavuk embriyo modeli geleneksel modellere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Her şeyden önce, 70 yıldan daha erken bir zamanda, tavuk embriyosunun normal gelişimi hamburger-Hamilton evreleme kılavuzu2'de çok net bir şekilde gösterilmişti Tavuk embriyosu gelişimi sırasında toplam 46 aşamanın kesin zaman ve morfolojik özelliklerle tanımlandığı ve anormal gelişimin tespitini kolaylaştırdığı. Ek olarak, tavuk embriyo modeli, miktar olarak nispeten düşük maliyetli ve yedekli olmak, nispeten doğru maruz kalma-doz kontrolleri, kabuk içinde bağımsız, kapalı bir sistem ve gelişmekte olan embriyonun kolay manipülasyonu gibi başka özelliklere sahiptir ve bunların hepsi güçlü bir toksikolojik değerlendirme modeli olarak kullanılma potansiyelini garanti eder.
Kardiyotoksiklikte, tavuk embriyosu, memeli kalplerine benzer, ancak daha kalın duvarlara sahip dört odalı bir kalbe sahiptir ve daha kolay morfolojik değerlendirmelere izin verir. Ek olarak, tavuk embriyosu memeli modellerinde mümkün olmayan gelişimsel inhalasyona maruz kalmaya izin verir: gelişimin sonraki aşamasında, tavuk embriyosu iç solunumdan dış solunuma (akciğer yoluyla oksijen almaya) geçiş yapacaktır; ikincisi, embriyonun gaga ile hava hücresi zarını deldiğini ve hava hücresini bir mini inhalasyon odası haline getiren3. Bu fenomen kullanılarak, gaz kirleticilerin kalp (ve diğer organlar) üzerindeki toksikolojik etkileri, özel soluma odası aletlerine gerek kalmadan değerlendirilebilir.
Bu yazıda, hepsi tavuk embriyosunun çevresel kirleticilere maruz kalmanın ardından gelişim kardiyotoksikliğinin değerlendirilmesinde güçlü bir araç haline getirmeye hizmet eden çeşitli maruz kalma/uç nokta değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm prosedürler Qingdao Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Laboratuvarımızda yumurtalar iki kuvözde kuluçkaya yatırıldı. Yumurtalar inkübatörde dik tutuldu ve rastgele raflara yerleştirildi. Yumurtalar için kuluçka koşulları aşağıdaki gibidir: kuluçka sıcaklığı 37,9 ° C'den başladı ve kuluçka ilerledikçe kademeli olarak 37,1 ° C'ye düştü; nem% 50'de başladı ve yavaş yavaş% 70'e yükseldi.
1. Maruz kalma yöntemleri
NOT: Çevresel kirleticilerin tavuk embriyolarına maruz kalması çeşitli şekillerde sağlanabilir. Bu bölümde, rutin olarak kullanılan üç yöntem ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Hava hücresi enjeksiyonu (Şekil 1)
NOT: Bu, çok çeşitli malzemeler için uygun olan4,5,6tavuk embriyolarına klasik maruz kalma yöntemidir ve gelişimin başlangıcından (embriyonik gün sıfır, ED0) yumurtadan önceki güne kadar (ED20) çok geniş bir zaman aralığında gerçekleştirilebilir. Araç olarak ayçiçek yağı kullanılır. Önceki çalışmalar, tedavi edilmemiş embriyolar ve ayçiçek yağı enjekte edilen embriyolar arasında mortalite, kuluçkalanabilirlik veya vücut ağırlığında önemli bir değişiklik görülmediğini göstermiştir7.- Aşağıdaki gerekli reaktifleri / aletleri hazırlayın: % 75 etanol, kağıt mendil, metal prob (herhangi bir keskin metal iğne / çubuk / awl ile ikame edebilir), eritilmiş parafin, fırça, povidone iyot çözeltisi, pipet, pipet uçları, kandling lambası, dozaj karışımı. Dosing karışımını ayçiçek yağı ile hazırlayın (önerilen)4. Diğer seyrelticileri kullanmak için araç kontrolü (tedavi edilmemiş embriyolara karşı) gerçekleştirin.
- Yumurtaların yüzeyini povidone iyot çözeltisi (ticari olarak mevcut povidone iyot çözeltisi 1:5 deiyonize su ile seyreltilmiş) ile temizleyin ve yumurta kabuğunu ovmadan kağıt mendille kurutun. Ovma, kabuğun dışını kaplayan koruyucu tabakayı kıracaktır.
- Yumurtaları karanlık bir odada mumla ve hava hücresini kalemle işaretleyin. Kabukta çatlaklar olan yumurtaları hariç tutun. Normal olarak yumurtadan çıkma olasılığı oldukça düşük olduğundan, künt uç yerine yan tarafta hava hücreleri olan yumurtaları hariç tutun.
- Hava hücresi alanını% 75 etanol ile sterilize edin ve ardından metal prob ile hava hücresi alanının merkezinde küçük bir delik açın. Probu hava hücresinin derinliklerine sokmayın, aksi taktirde iç zar zarar görmüş olabilir, bunun yerine kabuğu sadece probun ucuyla kırın. Delik ince bir pipet ucuna sığacak kadar büyük değilse, delik 10 μL pipet ucunun yerleştirilmesine izin sağlayacak kadar büyük olana kadar kabuğu mevcut deliğin yakınında tekrar kırın.
- Dosing karışımını kuvvetli bir şekilde girdaplayın ve hemen pipet ucuna çözelti çizin. Önerilen enjeksiyon hacmi 10 gram yumurta başına 1 μL'dir (örneğin, 50 gramlık bir yumurta için 5 μL enjeksiyon hacmi) çünkü daha büyük enjeksiyon hacimleri gelişmekte olan embriyo için hipoksik veya anoksik koşullar yaratabilir. İstenilen mg / yumurta kg dozu için dozlama çözeltisinin konsantrasyonunu hesaplayın.
- Pipet ucunu deliğe yerleştirin, ucu iç zara değsin. Dosing karışımını yavaşça çıkarın, en az on saniye tutun (viskoz yağın tamamen dağıtılmasına izin verin) ve ardından ucu çıkarın.
- Deliği bir fırça ve bir damla erimiş parafin ile kapatın. Erimiş parafinleri iç zara damlatmamaya dikkat edin.
- Mühürlendikten sonra, yumurtaları istenen embriyonik aşamaya ulaşana kadar inkübatöre yerleştirin. Zaten gelişmekte olan embriyolarda, düşük çevresel sıcaklıklar nedeniyle potansiyel embriyo kaybını önlemek için tüm işlemi mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirin.
- Mikroenjeksiyon (Şekil 2)
NOT: Bu, ilgi çekici maddeye kesin olarak maruz kalma ile sonuçlanan ve özellikle kısa süreli etki süresine sahip bileşikler için uygun olan daha doğrudan bir maruz kalma yöntemidir (örneğin, lentivirüs), çünkü klasik hava hücresi enjeksiyonu bileşiklerin iç zara nüfuz etmesi için zaman gerektirir. Hava hücresi enjeksiyonu ile tatmin edici sonuçlar elde edilemezse bu yöntem de denenebilir. Bu yöntem erken embriyolar için en uygun yöntemdir (ED2'ye kadar), ancak daha yaşlı embriyolara da yapılabilir (embriyo kaybı riski daha yüksektir).- Aşağıdaki gerekli reaktifleri / aletleri hazırlayın: % 75 etanol, povidone iyot çözeltisi, mikro enjektör (5 μL), metal prob (herhangi bir keskin metal iğne / çubuk / awl ile ikame edebilir), ince forseps, bant. Kuluçkalanabilirliği önemli ölçüde etkilemeden enjeksiyon kontrolü görevi de gören steril salin ile dosing karışımını hazırlayın. Kontamine bir enjeksiyon mortaliteyi önemli ölçüde artıracağından, tuzlu suyun sterilitesini sağlayın.
- Yumurtaları 1.1.2'de açıklandığı gibi temizleyin.
- Yumurtaları 1.1.3'te açıklandığı gibi mumla.
- Hava hücresi alanını% 75 etanol ile sterilize edin ve ardından metal prob ile hava hücresi alanının merkezinde küçük bir delik açın. Probu hava hücresinin derinliklerine sokmayın, aksi taktirde iç zar zarar görmüş olabilir, bunun yerine kabuğu sadece probun ucuyla kırın. Daha sonra ince forsepsleri kullanarak çapı yaklaşık 2 mm olana kadar deliği dikkatlice büyüterek iç zarın görsel olarak onaylanmasını sağlar.
- Çözeltiyi mikroenjektöre yükleyin (maksimum enjeksiyon hacmi: 0,5 μL/10 g yumurta). (örneğin, 50 g'lık bir yumurta için 2,5 μL) ve iğneyi delikten iç zara yaklaşık 2-3 mm boyunca dikkatlice yerleştirin. Çözeltiyi yavaşça dağıtın ve iğneyi çıkarın. İğneyi mümkün olduğunca zara dik tutun.
- Deliği küçük bir bant parçasıyla kapatın. Sonraki inkübasyon sırasında embriyo dehidrasyonunu ve ölümünü önlemek için deliği tamamen kapatın. Bununla birlikte, hipoksiyi önlemek için çok büyük bant parçalarından kaçının.
- Mühürlendikten sonra, yumurtaları istenen embriyonik aşamaya ulaşana kadar inkübatöre yerleştirin. Zaten gelişmekte olan embriyolarda, düşük çevresel sıcaklık nedeniyle potansiyel embriyo kaybını önlemek için tüm işlemi mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirin.
- Hava hücresi soluma (Şekil 3)
NOT: Bu, geç evre tavuk embriyosunun hava solumaya başlayacağı hava hücresinden yararlanan yeni bir inhalasyon yöntemidir. Gaz veya aerosol maruziyetleri için uygundur ve yaşamın çok erken dönemlerinde soluma maruziyetleri elde edebilir ve akciğerleri hayatta ilk kez açıldıklarında hedef gaz / aerosol ile doldurabilir.- Aşağıdaki gerekli reaktifleri / aletleri hazırlayın: numune alma torbası (PVF torbası, maruz kalmadan önce gaz / aerosol numunesinin depolanmasını için), kateter iğnesi, şırınga, metal prob (herhangi bir keskin metal iğne / çubuk / ıvır zıvır ile ikame edebilir), bant, duman davlumbaz.
- Yumurtaları 1.1.2'de açıklandığı gibi temizleyin ve 1.1.3'te açıklandığı gibi mumlayın (inkübasyondan önce hava hücresini işaretlemek gerekli değildir) ve ardından yumurtaları ED17'ye kadar tedavi olmadan kuluçkaya yatırmak.
- Hava hücresi alanını işaretlemek için yumurtaları ED17'de mumla.
- ED18'de, inkübatörden bir yumurta alın, hava hücresi alanını% 75 etanol ile sterilize edin ve ardından hava hücresinin iki tarafında iki küçük deliği dikkatlice delin. Biri gaz / aerosol enjeksiyonu için, diğeri havanın dışarı atılması içindir. Deliklerin boyutunu dikkatlice kontrol edin, böylece enjeksiyon deliğinin boyutu kateter iğnesinin yerleştirilmesi için yeterlidir, dışarı atılan deliğin çapı ise biraz daha büyüktür (yaklaşık 1 mm).
- Kateter iğnesine bağlı bir şırınga ile enjeksiyon deliğinden 10 mL hedef gaz / aerosol enjekte edin. Negatif kontrol grubu8ile önemli bir farkı olmaması gereken bir soluma kontrol grubu için hava enjekte edin. Enjeksiyon deliğinden sızıntıyı en aza indirmek için kateter iğnesine karşı basınç uygulayın (uygun miktarda basınçla elastik iğne kabuağa itilebilir). Her iki deliği de hemen bantla kapatın ve yumurtayı inkübatöre geri verin.
NOT: Bu prosedür, gaz/aerosolun operatör tarafından solunmasını önlemek için bir duman kaputunda yapılmalıdır. - Tüm hava hücresinin hedef gaz/aerosol (isteğe bağlı) ile doldurulmasını sağlamak için açıklanan prosedürü bir saat sonra tekrarlayın.
- ED19'da açıklanan yordamı tekrarlayın (isteğe bağlı). Pozlamanın tekrarlanması, yumurtadan çıkana kadar tutarlı pozlamanın sağlanmasına yardımcı olur. Pozlama süresinin yaklaşık tahmini için tarama süresini kaydedin.
- İstenilen maruziyetler yapıldıktan ve mühürlendikten sonra, yumurtaları kuluçka için inkübatöre yerleştirin. Düşük çevresel sıcaklıktan ölümü önlemek için yumurtanın inkübatör dışında geçirdiği süreyi en aza indirin.
2. Uç nokta değerlendirme yöntemleri
NOT: İlgi kirleticinin gelişmekte olan embriyoya maruz kalmasını takiben, kardiyotoksisite de dahil olmak üzere çeşitli toksisite parametreleri değerlendirilebilir. Bu bölümde, sık kullanılan iki belirli yöntem ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Elektrokardiyografi (Şekil 4)
NOT: Tüylerin varlığı nedeniyle kuluçkalık tavuklarda invaziv olmayan elektrokardiyografi yapmak mümkün değildir. Bu nedenle, elektrotların deri altı implantasyonu anestezi gerektiren gereklidir. Laboratuvarda kullanılan doz intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 33 mg / kg pentobarbitaldir (bazı tavuklar% 50'ye kadar doz artışı gerektirebilir). Bu yöntem, hayvanların% 90'ından fazlasında stabil elektrokardiyografi ile sonuçlanacak ve kalp atış hızının analiz edilmesine izin verecektir.- Aşağıdaki gerekli reaktifleri/aletleri hazırlayın: Salin, şırınga, elektrik dengesi, ısıtıcı (gerekirse), iki kanallı metal iğne elektrotları ile tutturulmuş bir elektrokardiyografi aletinde (örneğin BL-420E+) %1 (10 mg/mL) pentobarbital çözelti.
- Tavukları bir denge ile tartın ve gerekli pentobarbital çözelti hacmini hesaplayın ve tavukları enjekte edin. 30 g ağırlığındaki bir tavuk için 0,1 mL pentobarbital çözelti gerekir. Yumurta sarısı ortada bulunduğundan ve enjeksiyon etkili olmayabileceğinden, enjeksiyonun karnın yan tarafında yapıldığından emin olun.
- Enjekte edilen tavuklar uyuşturulup uyuşturulana kadar bekleyin (boynun gerginliği yoksa ve kafa serbestçe sallanabilirse, anestezi yeterlidir). Tavukları çalışma masasına yerleştirin (oda sıcaklığı 20 ° C'nin altındaysa ısıtıcılar gereklidir).
- Karnın iki tarafından deri altından iki iğne elektrodu yerleştirin. Cildi biraz kaldırıp oradan iğne sokarak iğnelerin karın boşluğuna girmemesine dikkat edin. Yerleştirildikten sonra, iğneyi göğüs boşluğunun kenarına ulaşana kadar dikkatlice ileri itin. İğnenin vücudun derinliklerine gitmediğinden veya ciltten dışarı çıkmadığından emin olun.
- Ölçümleri elektrokardiyografi aleti ile yapın. Elektrokardiyografi yapabilen diğer benzer aletler kullanılabilir.
- Tavuklar kurban edilecekse, zaten anestezi altında oldukları için elektrokardiyografiden sonra ötanazi gerçekleştirin. Tavuklar hayatta kalacaksa, onları kafeslerine geri yerleştirin ve uyanana kadar ısıtın. Bunları inkübatöre iade etmek başka bir seçenektir.
- Histomomorfometri (Şekil 5)
NOT: Kalbin enine bölümlerinde doğru ventrikül duvar kalınlığını değerlendirmek için özel bir yöntem geliştirilmiştir. Sağ ventrikül boyutunun ekokardiyografi ile morfolojik değerlendirmesi sağ ventrikülün düzensiz şekli nedeniyle %100 doğru değildir ve bu yöntem sağ ventrikül için morfolojik değerlendirmelerde iyi bir takviye görevi görebilir.- Aşağıdaki gerekli reaktifleri / aletleri hazırlayın: % 4 fosfat tamponlu formaldehit, keskin bıçak, fosfat tamponlu salin, kağıt havlu, elektrik dengesi, küçük makas, genel histolojik işlem ajanları (dereceli etanol, ksilen, parafin).
- Hayvanlar kurban edildikten sonra, tüyleri ıslatmak için su kullanın. Bu, göğsü açarken uçan tüylere bağlı potansiyel kirlenmeyi en aza indirmektir.
- Göğüs boşluğunu kalbe zarar vermeden dikkatlice açın. Vaskülatları kesmek ve kalbi göğüs boşluğundan hafifçe çıkarmak için küçük makas kullanın. Kalbe bağlı küçük bir parça (yaklaşık 1-2 mm) vaskülat bırakın, çünkü bu kalbe zarar vermeden kalbin daha sonra taşınması için uygun olabilir.
- Çıkarıldıktan sonra, kanı çıkarmak ve kası gevşetmek için kalbi soğuk fosfat tamponlu salinle durulayın. Daha sonra doğru ağırlık okuması için tartmadan önce kalbi kağıt havluya batırın. Kalbi oda sıcaklığında 24 saat boyunca 10x hacimli fiksatif (%4 fosfat tamponlu formaldehit) içine koyun. Sabit dokular daha sonra parafin bloklarına işlenebilir veya yıllarca 4 °C'de saklanabilir (immünostokimya planlanıyorsa önerilmez).
- Gömmeden önce, daha kolay işlem için dokuları tepe noktasından kalp sayımının yaklaşık%60'ınıkesin ( Şekil 5A ). Hızlı ve dikey temiz kesim için bir mikrotom bıçağı önerilir. Bir günden büyük tavuklar için, daha kolay parafin penetrasyonu ve dokunun doku kasetlerine sığmasını sağlamak için tepe noktasından yaklaşık% 25-30 uzunluğunda başka bir kesim yapın.
- Dokuları aşağıdaki koşullarla işleyin (gerektiği gibi ayarlayın): 1 saat için% 70 etanol, 1 saat için% 80 etanol, 1 saat x2 için% 95 etanol, 30 dk x2 için% 100 etanol, 5 dk x2 için ksilen, 1,5 saat için parafin (erime noktası 52-54 °C), 1 saat boyunca parafin (erime noktası 62-64 °C) ve daha sonra dokuları parafin (erime noktası 62-64 °C) ve parafin (erime noktası 52-54 °C) karışımına gömün.
- Dokuyu 6 μm kalınlığında bölümle. Sağ ventrikülde anatomik bir dönüm noktasının (septomarginal trabecula) varlığını ve boyutunu doğrulayarak kesitlerin özdeş göreceli pozisyonlarını dikkatlice koruyun. Her bölümde orta uzunlukta bir dönüm noktasını onaylayın(Şekil 5B, ok).
- Logo programcılı iki elektronik cetvel yapın: Cetvel 1, iki bitişik ölçü çizgisi arasında 22,5° ile orta noktaya bağlı 7 yarıçaplı ölçü çizgisine sahip düz bir çizgidir. Cetvel 2, T şeklinde sadece iki dik çizgidir (Şekil 5B).
- İki yazılım programıyla ölçüm: Adobe Photoshop ve ImageJ.
- Photoshop'ta cetvel 1'i (yeniden şekillendirme YOK) yeniden boyutlandırarak cetvelin iki ucunun serbest sağ ventrikül duvarının iki ucuna yerleştirilmesini, böylece cetvel 1'deki yedi ölçü çizgisinin her biri sağ iç ventrikül duvarını karşılar. Daha sonra cetvel 2'yi kullanarak iç ventrikül duvarından dış ventrikül duvarına dik ölçümler yapın (Şekil 5B).
- Her kalp için yedi ölçüm yapmak için ImageJ'i kullanın.
- Belirli ihtiyaçlara bağlı olarak, bir temsili sağ ventrikül duvar kalınlığı için yedi ölçümü veya ortalamayı analiz edin. Belirli ventrikül duvar kalınlığı değişiklikleri için tüm kalp ağırlığına normalleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pozlama sonuçları
Hava hücresi enjeksiyonu
Hava hücresi enjeksiyonu, gelişmekte olan tavuk embriyolarını, daha sonra embriyoların / kuluçka tavuklarının toplanan örneklerinde (serum, doku vb.) tespit edilebilen çeşitli ajanlara etkili bir şekilde maruz bırakabilir. Perflorooktanoik asidin (PFOA) hava hücresi enjekte edildiği ve serum PFOA konsantrasyonlarının daha sonra Ultra performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi ile belirlendiği bir örnektir. Serum konsantrasyonları enjekte edilen dozlara karşılık gelerek bu işlemin etkinliğini gösterir (Şekil 6).
Mikroenjeksiyon
Mikroenjeksiyon, gelişmekte olan embriyoları iç zara etkili bir şekilde nüfuz edemeyen veya lentivirüs gibi kısa süreli etki ile ajanlara maruz bırakabilir. İşte bu yöntemle ikinci embriyonik günde lentivirüs enjekte edildiği ve daha sonra embriyonik gün 15 embriyonun kalbinde lentivirüs transfeksiyonunun etkinliğini gösteren önemli yeşil floresan gözlendiği bir örnektir(Şekil 7).
Hava hücresi infüzyonu
Hava hücresi infüzyonu, dış solunumun başlangıç aşamasında az miktarda gaz / aerosol soluma maruziyeti için çok iyi çalışabilecek yeni bir yöntemdir. İşte dizel egzozun embriyonik gün 18 ve 19'da hava hücresine aşılandığını ve kardiyak ve pulmoner dokularda önemli fibrotik değişikliklere neden olduğu bir örnektir (Şekil 8).
Uç nokta değerlendirme sonuçları
Elektrokardiyografi sonuçları
İki elektrot sınırlaması nedeniyle sadece 3 kanallı elektrokardiyografi gösterilebilir. Ancak r dalgalarını ayırt etmek için yeterlidirler, bu nedenle fonksiyonel değerlendirmeler için kullanılabilirler. Gerçek hayattaki bir örnekte, dizel egzoza maruz kalan tavukların elektrokardiyografisi, fonksiyonel değişiklikleri gösteren önemli ölçüde kısaltılmış R-R aralığını belirtmiştir (Şekil 9).
Histopatoloji sonuçları
Sağ ventrikül duvar kalınlığı değerlendirme yöntemimiz çeşitli çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır5,7,8 ,9,10,11,12. Önceki çalışmalarımızdan birinde dizel egzoz maruziyeti sağ ventrikül duvarının kalınlaşmış olarak sonuçlanmasına neden oldu(Şekil 10).
Şekil 1: Hava hücresi enjeksiyonunun gösterimi. Resimde gelişmemiş verimli bir yumurta gösterilir, ancak tüm farklı aşamalardaki embriyolar bu yöntemle açığa çıkabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroenjeksiyon gösterimi. Bu yöntem için tercih edilen maruz kalma süresi olan resimde erken embriyo gösterilir, ancak diğer zaman noktaları da denenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hava hücresi infüzyonunun gösterimi. Bu yöntem için tercih edilen maruz kalma süresi olan resimde iç pipping geçiren geç evre embriyo gösterilir. Operasyonun dört aşaması gösterildi. 1: Sağlam embriyo. 2: İki delik açılmıştır. 3: infüzyon yapılmaktadır. PVF örnekleme torbası sol altta da gösterilir. 4: infüzyon bitti, delikler bantla kapatıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Elektrokardiyografi gösterimi. Sol üst panel, yavru bir tavuğun nasıl uyuşturulduktan ve elektrokardiyografi ölçümünden geçirildiğinden gösterdi. Sağ üst panel elektrokardiyografi aletini elektrotlar takılı olarak gösterir. Alt panel, tavuklardan elde edilen temsili bir elektrokardiyografi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sağ ventrikül duvar kalınlığının histopatolojik değerlendirmesinin gösterimi (Hematoksilin ve eozin lekeleme). (A) Gömmeden önce tavuk kalplerinin kesme pozisyonunun gösterimi. (B) Sağ ventrikül duvar kalınlığı ölçümünün gösterimi. Ölçek çubukları 1000 μm'dir. Mavi daireler sağ iç ventrikül duvarındaki yedi ölçüm noktasını gösterir. Kırmızı daire dış sağ ventrikül duvarında bir ölçüm noktası gösterir. Ok, uygun kesit pozisyonu için anatomik dönüm noktasını gösterir. Bu rakam Jiang ve ark. Toksikoloji'dendeğiştirilmiştir. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kuluçkadan önce 0, 0.5, 1 veya 2 mg/yumurta kg perflorootanoik asit ile hava hücresi enjeksiyonunu takiben kuluçka tavuklarından perflorooktanoik asit serum konsantrasyonu. Elde edilen serum konsantrasyonları, hava hücresi enjeksiyonunun etkinliğini gösteren enjekte edilen dozlara karşılık gelir. Bu rakam Jiang ve ark. Toksikoloji'dendeğiştirilmiştir. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Mikroenjeksiyon maruziyetini takiben lentivirüs transeksiyon etkinliğinin gösterimi (Kriyo kesiti takiben doğrudan gözlem). Sol panellerde ışık alanı görüntüleri, sağ panellerde ise aynı doku bölümleri için yeşil floresan görüldü. Embriyonik gün iki tavuk embriyosuna lentivirüs veya kontrol enjekte edildi ve daha sonra embriyonik 15. Kalpler donmuş bölümlenmiş ve floresan mikroskop altında doğrudan görselleştirilmiştir. (A) Kontrol grubu, az yeşil floresan mevcuttu. (B) Lentivirüs maruz kalan grup, mikroenjeksiyondan sonra lentivirüs transfeksiyonunun etkinliğini gösteren önemli yeşil floresan gözlendi. Ölçek çubukları 125 μm'dir. Bu rakam Zhao ve ark. Çevresel Toksikoloji ve Farmakoloji'den değiştirilmiştir. 56, 136-144 (2017)11. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Hava hücresi infüzyonunun etkinliğinin gösterilmesi. Tavuk embriyoları embriyonik 18 ve 19. Kalp dokuları fibrotik lezyonlar için Masson Trichrome lekelenme ile değerlendirildi. Oklar fibrotik lezyonları (mavi lekelenme) gösterdi. *: istatistiksel olarak kontrolden farklıdır (P<0.05 varyans analizinden ve en az anlamlı fark testlerinden). Ölçek çubukları 150 μm'dir. Bu rakam Jiang ve ark. Çevre Kirliliği'nden değiştirilmiştir. 264, 114718 (2020)8. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Elektrokardiyografinin etkinliğinin gösterimi. Embriyonik 18 ve 19. günde tavuk embriyolarına dizel egzoz aşılandı ve daha sonra yumurtadan çıkan tavuklar 0, 1 veya 2 hafta bekletildi ve ardından elektrokardiyografi yapıldı. Hava hücresi infüzyonu yoluyla dizel egzoza maruz kalan tavuklarda, yöntemin etkinliğini gösteren önemli ölçüde kısaltılmış R-R aralıkları gözlenmiştir. *: istatistiksel olarak kontrolden farklıdır (P<0.05 varyans analizinden ve en az anlamlı fark testlerinden). Bu rakam Jiang ve ark. Çevre Kirliliği'nden değiştirilmiştir. 264, 114718 (20208. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Sağ ventrikül duvar kalınlığı ölçümünün etkinliğinin gösterimi (Hematoksilin ve eozin lekeleme). Embriyonik 18 ve 19. günde tavuk embriyolarına dizel egzoz aşılandı ve daha sonra yumurtadan çıkan tavuklar 1 hafta bekletildi ve ardından sağ ventrikül duvar kalınlığının histolojik değerlendirmesi yapıldı. C: Kalp kesitlerinin temsili resimleri. Tüm sağ ventriküllerde anatomik belirteç varlığına dikkat edin (Yaşlı tavuklarda, işaretleyici istenen pozisyonda biraz daha uzun olma eğilimindedir, bu da ölçümlerin doğruluğunu etkilemez). B: Öncelikle standart slaytlarla gerçek uzunluğa dönüştürülen ve daha sonra tüm kalp ağırlığı ile normalleştirilen sağ ventrikül duvar kalınlığının nicelemesi böylece um/ug şeklinde temsil edildi. Mavi oklar: serbest sağ ventrikül duvarının iki ucu. Kırmızı oklar: sağ ventrikül duvarının orta noktaları. Siyah oklar: anatomik işaretleyici. *: istatistiksel olarak kontrolden farklıdır (P<0.05 varyans analizinden ve en az anlamlı fark testlerinden). Ölçek çubukları 1000 μm'dir. Bu rakam Jiang ve ark. Çevre Kirliliği'nden değiştirilmiştir. 264, 114718 (2020)8. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tavuk embriyosu 200 yıldır gelişim çalışmalarında klasik bir model olmuştur1. Bu yazıda sunulan yöntemlerimiz, perflorooktanoik asit, partikül madde ve başarı 5 , 7 ,8,9,10,11,12ile dizel egzoz dahil olmak üzere çeşitli çevresel kirleticilerin değerlendirilmesinde kullanılmıştır. Bu yöntemlerle gelişimsel kardiyotoksiklik uygun maliyetli ve net bir şekilde belirtilmiştir. Ayrıca, tavuk embriyolarını diğer ilgi çekici bileşiklerle ortaya çıkarmak ve potansiyel gelişimsel kardiyotoksikliği değerlendirmek zor değildir.
Hava hücresi enjeksiyon yöntemi daha önce birçok çalışmada kullanılan klasik bir yöntemdir13,14,15, uygun ve etkilidir. Kemirgen modelleri16 , 17,18gibi diğer gelişimsel maruz kalma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, anne etkileri ve çeşitli atılımlar nedeniyle değişkenlikleri büyük ölçüde azaltan kapalı bir sisteme doğrudan maruz kalma özelliğine sahiptir. Mikroenjeksiyon, kemirgen modellerinde rahim enjeksiyonlarında olduğu gibi benzer etkiler elde edebilecek erken embriyo geliştirme veya çevresinde kesin maruziyet sağlayan hava hücresi enjeksiyon yönteminin bir geliştirmesidir19,20. Rahim enjeksiyonlarına kıyasla, yöntemimiz enjeksiyonun nispeten kolay manipülasyon adımlarıyla görsel olarak onaylanmasına izin verir ve embriyoların gerçek miktarının ve ağırlığının kolayca elde edildiği rahim enjeksiyonunda mümkün olmayan yumurta ağırlığını kontrol ederek doğru enjeksiyon kolayca elde edilir. infüzyon yöntemi esas olarak pulmoner sistemdeki solunan ajanların değerlendirilmesi içindir, ancak kardiyotoksisite ve pulmoner toksisite sıklıkla birlikte ortaya çıkar. Bu yöntem, az miktarda gaz veya aerosol aşılanan hava hücresinden yararlanır ve belirli soluma odalarına ihtiyaç duymadan gaz / aerosolun sürekli solunmasını sağlar. Muadil kemirgen modellerinin nispeten büyük miktarlarda gaz / aerosol ve büyük, pahalı inhalasyon aletleri kullanması gerekir21,22.
Laboratuvarımızda rutin olarak test edilen iki uç nokta, elektrokardiyografi ve sağ ventrikül duvar kalınlığının histoporfometrik değerlendirmesi, toksikan maruziyetini takiben fonksiyonel ve morfolojik değişiklikleri temsil eder. Sağ ventrikül duvar kalınlığının değerlendirilmesi, sağ ventrikül üzerinde geleneksel ekokardiyografi tabanlı değerlendirme, sağ ventrikülün asimetrik ve karmaşık hilal şekli nedeniyle genellikle zorlu ve çok doğru olmadığı için, sağ ventrikül duvarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasında özel avantajlara sahiptir23. Yöntemimiz, temsili bir pozisyonda doğru ventrikül duvar kalınlığı hakkında ek bilgilerle destekleyerek bu yanlışlığın üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Şu anda hepsi manueldir, gelecekte ölçümler otomatik olarak yapılabilir ve ölçüm noktalarının sayısı önemli ölçüde artırılabilir ve bu yöntemin doğruluğu daha da artırılabilir.
Tavuk embriyosu bazlı gelişimsel modeller, toksikolojik çalışmalarda nispeten doğru bir maruziyet dozu, kabuk içinde bağımsız bir maruz kalma sistemi ve gelişmekte olan embriyonun kolay manipülasyonu gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Kardiyotoksiklik ile ilgili olarak, tavuklar nispeten büyük kalplere ve kalın ventrikül duvarlarına sahiptir ve kolay histopomorfometrik değerlendirmelere izin verir. Yumurtadan sonra tavuk yetiştiriliyorsa, kemirgenlere kıyasla antikorların / astarların mevcudiyeti ve ekstra kafes alanı gereksinimleri gibi bazı eksiklikler vardır. Bununla birlikte, tavuk embriyosu potansiyel gelişimsel kardiyotoksisite değerlendirmeleri için hala kullanılacak iyi bir alternatif toksikolojik modeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
