Summary
Hühnerembryonen werden als klassisches Entwicklungsmodell in unserem Labor verwendet, um Entwicklungskardiotoxizitäten nach Exposition gegenüber verschiedenen Umweltkontaminanten zu bewerten. Expositionsmethoden und morphologische/funktionelle Bewertungsmethoden werden in diesem Manuskript beschrieben.
Abstract
Hühnerembryonen sind ein klassisches Modell in Entwicklungsstudien. Während der Entwicklung von Hühnerembryonen ist das Zeitfenster der Herzentwicklung gut definiert, und es ist relativ einfach, eine präzise und rechtzeitige Exposition durch mehrere Methoden zu erreichen. Darüber hinaus ähnelt der Prozess der Herzentwicklung bei Hühnerembryonen Säugetieren, was auch zu einem Vierkammerherz führt, was es zu einem wertvollen alternativen Modell bei der Beurteilung von Entwicklungskardiotoxizitäten macht. In unserem Labor wird das Hühnerembryomodell routinemäßig bei der Bewertung von Entwicklungskardiotoxizitäten nach Exposition gegenüber verschiedenen Umweltschadstoffen verwendet, darunter Per- und Polyfluoralkylsubstanzen (PFAS), Feinstaub (PMs), Dieselabgase (DE) und Nanomaterialien. Die Belichtungszeit kann je nach Bedarf frei gewählt werden, vom Beginn der Entwicklung (Embryonaltag 0, ED0) bis zum Tag vor dem Schlüpfen. Zu den wichtigsten Expositionsmethoden gehören Luftzellinjektion, direkte Mikroinjektion und Luftzellinhalation (ursprünglich in unserem Labor entwickelt), und die derzeit verfügbaren Endpunkte umfassen Herzfunktion (Elektrokardiographie), Morphologie (histologische Bewertungen) und molekularbiologische Bewertungen (Immunhistochemie, qRT-PCR, Western Blotting usw.). Natürlich hat das Hühnerembryomodell seine eigenen Grenzen, wie z.B. die begrenzte Verfügbarkeit von Antikörpern. Da jedoch immer mehr Labore beginnen, dieses Modell zu verwenden, kann es verwendet werden, um signifikante Beiträge zur Untersuchung von Entwicklungskardiotoxizitäten zu leisten.
Introduction
Der Hühnerembryo ist ein klassisches Entwicklungsmodell, das seit über zweihundert Jahren verwendet wird1. Das Hühnerembryo-Modell hat verschiedene Vorteile gegenüber traditionellen Modellen. Zunächst einmal war bereits vor über 70 Jahren die normale Entwicklung des Hühnerembros sehr deutlich im Hamburger-Hamilton Staging Guide2dargestellt worden, in dem insgesamt 46 Stadien während der Hühnerembryoentwicklung mit genauen zeitlichen und morphologischen Merkmalen definiert wurden, was den Nachweis abnormaler Entwicklungen erleichterte. Darüber hinaus weist das Hühnerembryomodell weitere Merkmale auf, wie z. B. relativ kostengünstig und redundant in der Menge, relativ genaue Expositionsdosiskontrollen, ein unabhängiges, geschlossenes System innerhalb der Schale und eine einfache Manipulation des sich entwickelnden Embryos, die alle sein Potenzial garantieren, als leistungsfähiges toxikologisches Bewertungsmodell verwendet zu werden.
Bei der Kardiotoxizität weist der Hühnerembryo ein Vierkammerherz auf, ähnlich wie Säugetierherzen, aber mit dickeren Wänden, was eine einfachere morphologische Beurteilung ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht der Hühnerembryo eine Entwicklungsinhalationsexposition, die in Säugetiermodellen nicht möglich ist: Im späteren Entwicklungsstadium wechselt der Hühnerembryo von der inneren Atmung zur externen Atmung (Sauerstoff über die Lunge erhalten); Letzteres erfordert, dass der Embryo mit dem Schnabel in die Luftzellmembran eindringt und beginnt, Luft zu atmen3, wodurch die Luftzelle zu einer Mini-Inhalationskammer wird. Unter Ausnutzung dieses Phänomens können die toxikologischen Wirkungen von Gasverunreinigungen auf das Herz (und andere Organe) bewertet werden, ohne dass spezielle Inhalationskammerinstrumente erforderlich sind.
In diesem Manuskript werden mehrere Expositions- / Endpunktbewertungsmethoden beschrieben, die alle dazu dienen, den Hühnerembryo zu einem leistungsfähigen Werkzeug bei der Beurteilung der Entwicklungskardiotoxizität nach Exposition gegenüber Umweltkontaminanten zu machen.
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Protocol
Alle beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Qingdao University genehmigt. In unserem Labor wurden die Eier in zwei Inkubatoren bebrütet. Eier wurden aufrecht im Inkubator gehalten und zufällig in die Regale gestellt. Die Inkubationsbedingungen für die Eier waren wie folgt: Die Inkubationstemperatur begann bei 37,9 ° C und sank allmählich auf 37,1 ° C im Laufe der Inkubation; die Luftfeuchtigkeit begann bei 50% und stieg allmählich auf 70%.
1. Expositionsmethoden
HINWEIS: Die Exposition von Umweltkontaminanten gegenüber Hühnerembryonen kann auf verschiedene Arten erreicht werden. In diesem Abschnitt werden drei routinemäßig verwendete Methoden ausführlich beschrieben.
- Luftzelleninjektion (Abbildung 1)
HINWEIS: Dies ist die klassische Expositionsmethode für Hühnerembryonen4,5,6, die für eine Vielzahl von Materialien geeignet ist und in einem sehr breiten Zeitfenster vom Beginn der Entwicklung (embryonaler Tag Null, ED0) bis zum Tag vor dem Schlüpfen (ED20) durchgeführt werden kann. Als Vehikel wird Sonnenblumenöl verwendet. Frühere Studien haben gezeigt, dass keine signifikanten Veränderungen der Mortalität, Derrbarkeit oder des Körpergewichts zwischen unbehandelten Embryonen und Embryonen, denen Sonnenblumenöl injiziert wurde, beobachtet wurden7.- Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien / Werkzeuge vor: 75% Ethanol, Seidenpapier, Metallsonde (kann durch jede scharfe Metallnadel / Stick / Ahle ersetzt werden), geschmolzenes Paraffin, Bürste, Povidoniodidlösung, Pipette, Pipettenspitzen, Candling-Lampe, Dosiermischung. Bereiten Sie die Dosierungsmischung mit Sonnenblumenöl vor (empfohlen)4. Um andere Verdünnungsmittel zu verwenden, führen Sie eine Fahrzeugkontrolle durch (im Vergleich zu unbehandelten Embryonen).
- Reinigen Sie die Oberfläche der Eier mit Povidoniodidlösung (handelsübliche Povidoniodidlösung 1:5 verdünnt mit entionisiertem Wasser) und trocknen Sie die Eierschale mit Seidenpapier ohne Schrubben. Durch das Schrubben wird die Schutzschicht, die die Außenseite der Schale bedeckt, gebrochen.
- Kerzen Sie die Eier in einem dunklen Raum und markieren Sie die Luftzelle mit Bleistift. Eier mit Rissen auf der Schale ausschließen. Schließen Sie Eier mit Luftzellen an der Seite anstelle der stumpfen Spitze aus, da es sehr unwahrscheinlich ist, dass diese normal schlüpfen.
- Desinfizieren Sie den Luftzellenbereich mit 75% Ethanol und bohren Sie dann mit der Metallsonde ein kleines Loch in der Mitte des Luftzellenbereichs. Stecken Sie die Sonde nicht tief in die Luftzelle, da sonst die innere Membran beschädigt werden kann, sondern brechen Sie die Schale nur mit der Spitze der Sonde. Wenn das Loch nicht groß genug ist, um in eine feine Pipettenspitze zu passen, brechen Sie die Schale in der Nähe des vorhandenen Lochs erneut auf, bis das Loch groß genug ist, um das Einsetzen der 10 μL Pipettenspitze zu ermöglichen.
- Die Dosiermischung kräftig vortexen und sofort die Lösung zur Pipettenspitze ziehen. Das empfohlene Injektionsvolumen beträgt 1 μL pro 10 Gramm Ei (z. B. 5 μL Injektionsvolumen für ein 50-Gramm-Ei), da größere Injektionsvolumina hypoxische oder anoxische Bedingungen für den sich entwickelnden Embryo verursachen können. Berechnen Sie die Konzentration der Dosierlösung für die gewünschte mg/Ei kg Dosis.
- Setzen Sie die Pipettenspitze in das Loch ein, wobei die Spitze die innere Membran berührt. Die Dosiermischung langsam auswerfen, mindestens zehn Sekunden gedrückt halten (das viskose Öl vollständig dosieren lassen) und dann die Spitze entfernen.
- Versiegeln Sie das Loch mit einer Bürste und einem Tropfen geschmolzenem Paraffin. Achten Sie darauf, geschmolzenes Paraffin nicht auf die innere Membran zu tropfen.
- Nach dem Versiegeln legen Sie die Eier in den Inkubator, bis sie das gewünschte Embryonalstadium erreicht haben. Führen Sie bei sich bereits entwickelnden Embryonen den gesamten Prozess so schnell wie möglich durch, um einen möglichen Embryoverlust aufgrund niedriger Umgebungstemperaturen zu verhindern.
- Mikroinjektion (Abbildung 2)
HINWEIS: Dies ist eine direktere Expositionsmethode, die zu einer definitiven Exposition gegenüber der interessierenden Substanz führt und besonders für Verbindungen mit kurzer Wirkungsdauer (z. B. Lentivirus) geeignet ist, da die klassische Luftzelleninjektion Zeit benötigt, damit die Verbindungen in die innere Membran eindringen. Diese Methode kann auch ausprobiert werden, wenn durch Luftzelleninjektion keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden konnten. Diese Methode eignet sich am besten für frühe Embryonen (bis ED2), kann aber auch an älteren Embryonen durchgeführt werden (mit höherem Risiko für Embryonenverlust).- Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien / Werkzeuge vor: 75% Ethanol, Povidoniodidlösung, Mikroinjektor (5 μL), Metallsonde (kann mit jeder scharfen Metallnadel / Stick / Ahle ersetzen sollte funktionieren), feine Zinnen, Klebeband. Bereiten Sie die Dosiermischung mit steriler Kochsalzlösung vor, die auch als Injektionskontrolle dient, ohne die Schlupffähigkeit wesentlich zu beeinträchtigen. Stellen Sie die Sterilität der Kochsalzlösung sicher, da eine kontaminierte Injektion die Mortalität dramatisch erhöht.
- Reinigen Sie die Eier wie in 1.1.2 beschrieben.
- Kerzen Sie die Eier wie in 1.1.3 beschrieben.
- Desinfizieren Sie den Luftzellenbereich mit 75% Ethanol und bohren Sie dann mit der Metallsonde ein kleines Loch in der Mitte des Luftzellenbereichs. Stecken Sie die Sonde nicht tief in die Luftzelle, da sonst die innere Membran beschädigt werden kann, sondern brechen Sie die Schale nur mit der Spitze der Sonde. Verwenden Sie dann die feine Zette, um das Loch vorsichtig zu vergrößern, bis der Durchmesser etwa 2 mm beträgt, was eine visuelle Bestätigung der inneren Membran ermöglicht.
- Laden Sie die Lösung in den Mikroinjektor (maximales Injektionsvolumen: 0,5 μL/10 g Ei. (z. B. 2,5 μL für ein 50 g Ei) und führen Sie die Nadel vorsichtig durch das Loch in die innere Membran für ca. 2-3 mm ein. Dosieren Sie die Lösung vorsichtig und entfernen Sie die Nadel. Halten Sie die Nadel so senkrecht wie möglich zur Membran.
- Versiegeln Sie das Loch mit einem kleinen Stück Klebeband. Decken Sie das Loch vollständig ab, um die Austrocknung und den Tod des Embryos während der anschließenden Inkubation zu verhindern. Vermeiden Sie jedoch Klebebandstücke, die zu groß sind, um Hypoxie zu verhindern.
- Nach dem Versiegeln legen Sie die Eier in den Inkubator, bis sie das gewünschte Embryonalstadium erreicht haben. Führen Sie bei sich bereits entwickelnden Embryonen den gesamten Prozess so schnell wie möglich durch, um einen möglichen Embryoverlust aufgrund niedriger Umgebungstemperaturen zu verhindern.
- Inhalation von Luftzellen (Abbildung 3)
HINWEIS: Dies ist eine neuartige Inhalationsmethode, die die Luftzelle nutzt, aus der der Hühnerembryo im Spätstadium beginnt, Luft zu atmen. Es eignet sich für Gas- oder Aerosolexpositionen und kann sehr früh im Leben Inhalationsexpositionen erreichen und die Lunge mit dem Zielgas / Aerosol füllen, wenn sie sich zum ersten Mal im Leben öffnen.- Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien / Werkzeuge vor: Probenahmebeutel (PVF-Beutel, zur Lagerung von Gas- / Aerosolprobe vor der Exposition), Katheternadel, Spritze, Metallsonde (kann durch jede scharfe Metallnadel / Stick / Ahle ersetzt werden sollte funktionieren), Klebeband, Abzug.
- Reinigen Sie die Eier wie in 1.1.2 beschrieben und kerzen Sie sie wie in 1.1.3 beschrieben (es ist nicht notwendig, die Luftzelle vor der Inkubation zu markieren), und inkubieren Sie dann die Eier ohne Behandlung bis ED17.
- Kerzen Sie die Eier bei ED17, um den Luftzellenbereich zu markieren.
- Bei ED18 nehmen Sie ein Ei aus dem Inkubator, desinfizieren Sie den Luftzellenbereich mit 75% Ethanol und bohren Sie dann vorsichtig zwei kleine Löcher auf zwei Seiten der Luftzelle. Einer ist für die Injektion von Gas / Aerosol, der andere ist für die Ausstoßung von Luft. Kontrollieren Sie sorgfältig die Größe der Löcher, so dass die Größe des Injektionslochs gerade ausreicht, um die Katheternadel einzulegen, während der Durchmesser des Ausstoßlochs etwas größer ist (ca. 1 mm).
- Mit einer an der Katheternadel befestigten Spritze vorsichtig 10 ml Zielgas/Aerosol aus dem Injektionsloch injizieren. Injizieren Sie Luft für eine Inhalationskontrollgruppe, die keine signifikanten Unterschiede zu einer negativen Kontrollgruppe aufweisen sollte8. Drücken Sie Druck auf die Katheternadel aus (bei entsprechendem Druck kann die elastische Nadel gegen die Schale gedrückt werden), um das Auslaufen aus dem Injektionsloch zu minimieren. Verschließen Sie beide Löcher sofort mit Klebeband und bringen Sie das Ei in den Inkubator zurück.
HINWEIS: Dieses Verfahren sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um das Einatmen von Gas / Aerosol durch den Bediener zu verhindern. - Wiederholen Sie den beschriebenen Vorgang nach einer Stunde, um sicherzustellen, dass die gesamte Luftzelle mit Zielgas / Aerosol gefüllt ist (optional).
- Wiederholen Sie den beschriebenen Vorgang bei ED19 erneut (optional). Die Wiederholung der Belichtung hilft, eine konsistente Belichtung bis zum Schlüpfen zu gewährleisten. Notieren Sie die Schraffurzeit für eine ungefähre Abschätzung der Expositionsdauer.
- Sobald die gewünschten Expositionen durchgeführt und versiegelt wurden, legen Sie die Eier zum Schlüpfen in den Inkubator. Minimieren Sie die Zeit, die das Ei außerhalb des Inkubators verbringt, um den Tod durch niedrige Umgebungstemperatur zu verhindern.
2. Methoden zur Endpunktbewertung
HINWEIS: Nach Exposition von Kontaminanten von Interesse für den sich entwickelnden Embryo können mehrere Toxizitätsparameter bewertet werden, einschließlich der Kardiotoxizität. In diesem Abschnitt werden zwei häufig verwendete spezifische Methoden ausführlich beschrieben.
- Elektrokardiographie (Abbildung 4)
HINWEIS: Es ist unmöglich, eine nicht-invasive Elektrokardiographie bei schlüpfenden Hühnern aufgrund des Vorhandenseins von Federn zu machen. Daher ist die subkutane Implantation von Elektroden unerlässlich und erfordert eine Anästhesie. Die im Labor verwendete Dosis beträgt 33 mg/kg Pentobarbital durch intraperitoneale Injektion (einige Hühner benötigen möglicherweise eine Dosiserhöhung von bis zu 50%). Diese Methode führt zu einer stabilen Elektrokardiographie bei über 90% der Tiere, was eine Analyse der Herzfrequenz ermöglicht.- Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien/Werkzeuge vor: 1% (10 mg/ml) Pentobarbitallösung in Kochsalzlösung, Spritze, elektrische Waage, Heizung (falls erforderlich), ein Elektrokardiographie-Instrument (z. B. BL-420E+) mit zweikanaligen Metallnadelelektroden.
- Wiegen Sie die Hühner mit einer Waage und berechnen Sie das notwendige Volumen der Pentobarbitallösung und injizieren Sie die Hühner. Für ein Huhn, das 30 g wiegt, werden 0,1 ml Pentobarbitallösung benötigt. Stellen Sie sicher, dass die Injektion auf der seitlichen Seite des Bauches erfolgt, da sich das Eigelb in der Mitte befindet und die Injektion dort möglicherweise nicht wirksam ist.
- Warten Sie, bis die injizierten Hühner betäubt sind (halten Sie das Huhn in der Hand, wenn der Hals keine Spannung hat und der Kopf frei geschwungen werden kann, ist die Betäubung ausreichend). Hühner auf den Operationstisch legen (Heizungen sind notwendig, wenn die Raumtemperatur unter 20 °C liegt).
- Führen Sie zwei Nadelelektroden von zwei Seiten des Abdomens subkutan ein. Stellen Sie sicher, dass die Nadeln nicht in die Bauchhöhle gelangen, indem Sie die Haut ein wenig anheben und von dort aus die Nadel einführen. Drücken Sie die Nadel nach dem Einsetzen vorsichtig nach vorne, bis sie die Seite der Brusthöhle erreicht. Achten Sie darauf, dass die Nadel nicht tief in den Körper eindreckt oder aus der Haut herausragt.
- Nehmen Sie die Messungen mit dem Elektrokardiographie-Gerät vor. Andere ähnliche Instrumente, die elektrokardiographisch fähig sind, können verwendet werden.
- Wenn die Hühner geopfert werden sollen, führen Sie nach der Elektrokardiographie eine Euthanasie durch, da sie bereits unter Betäubung stehen. Wenn Hühner überleben sollen, legen Sie sie wieder in ihre Käfige und wärmen Sie sie bis zum Aufwachen. Die Rückgabe an den Inkubator ist eine weitere Option.
- Histomorphometrie (Abbildung 5)
HINWEIS: Es wird eine spezielle Methode entwickelt, um die rechtsventrikuläre Wandstärke in Querabschnitten des Herzens zu beurteilen. Die morphologische Beurteilung der Abmessungen des rechten Ventrikels mittels Echokardiographie ist aufgrund der unregelmäßigen Form des rechten Ventrikels nicht 100% genau, und diese Methode kann als gute Ergänzung bei den morphologischen Bewertungen für den rechten Ventrikel dienen.- Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien / Werkzeuge vor: 4% phosphatgepuffertes Formaldehyd, scharfe Klinge, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Papiertuch, elektrische Waage, kleine Schere, allgemeine histologische Verarbeitungsmittel (abgestuftes Ethanol, Xylol, Paraffin).
- Sobald tiere geopfert sind, verwenden Sie Wasser, um die Federn zu benetzen. Dies dient dazu, die mögliche Kontamination durch fliegende Federn beim Öffnen der Brust zu minimieren.
- Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig, ohne das Herz zu beschädigen. Verwenden Sie eine kleine Schere, um das Gefäß zu schneiden und das Herz vorsichtig aus der Brusthöhle zu entfernen. Lassen Sie ein kleines Stück (ca. 1-2 mm) Gefäße am Herzen befestigt, da dies für die spätere Handhabung des Herzens bequem sein kann, ohne das Herz zu schädigen.
- Spülen Sie das Herz nach der Entfernung in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus, um Blut zu entfernen und den Muskel zu entspannen. Dann tauchen Sie das Herz auf papiertuch, bevor Sie es wiegen, um das Gewicht genau zu lesen. Das Herz für 24 Stunden bei Raumtemperatur in 10x Volumenfixiermittel (4% phosphatgepuffertes Formaldehyd) geben. Fixierte Gewebe können anschließend zu Paraffinblöcken verarbeitet oder jahrelang bei 4 °C gelagert werden (nicht empfohlen, wenn eine Immunhistochemie geplant ist).
- Schneiden Sie vor dem Einbetten das Gewebe in etwa 60% Länge des Herzens ab der Spitze (Abbildung 5A), um die nachfolgende Verarbeitung zu erleichtern. Für einen schnellen und vertikalen sauberen Schnitt wird eine Mikrotomklinge empfohlen. Für Hühner, die älter als einen Tag sind, machen Sie einen weiteren Schnitt mit einer Länge von etwa 25-30% von der Spitze, um das Eindringen von Paraffin zu erleichtern und das Gewebe in Gewebekassetten passen zu lassen.
- Verarbeiten Sie die Gewebe unter folgenden Bedingungen (nach Bedarf anpassen): 70% Ethanol für 1 h, 80% Ethanol für 1 h, 95% Ethanol für 1 h x2, 100% Ethanol für 30 min x2, Xylol für 5 min x2, Paraffin (Schmelzpunkt 52-54 °C) für 1,5 h, Paraffin (Schmelzpunkt 62-64 °C) für 1 h und dann die Gewebe in eine 3:1-Mischung aus Paraffin (Schmelzpunkt 62-64 °C) und Paraffin (Schmelzpunkt 52-54 °C) einbetten.
- Schnitten Sie das Gewebe mit einer Dicke von 6 μm. Bewahren Sie sorgfältig identische relative Positionen der Querschnitte auf, indem Sie das Vorhandensein und die Größe eines anatomischen Landmarks (septomarginale Trabecula) im rechten Ventrikel bestätigen. Bestätigen Sie eine Landmarke mit moderater Länge auf jedem Abschnitt(Abbildung 5B,Pfeil).
- Machen Sie zwei elektronische Lineale mit Logo-Programmierer: Lineal 1 ist eine gerade Linie mit 7 Radius-Messlinien, die am Mittelpunkt befestigt sind, mit 22,5° zwischen zwei benachbarten Messlinien. Lineal 2 besteht nur aus zwei senkrechten Linien in T-Form (Abbildung 5B).
- Messen Sie mit zwei Softwareprogrammen: Adobe Photoshop und ImageJ.
- Ändern Sie in Photoshop die Größe von Lineal 1 (KEINE Umformung), um die beiden Enden des Lineals an den beiden Enden der freien rechtsventrikulären Wand zu platzieren, sodass die sieben Maßlinien auf Lineal 1 jeweils auf die innere rechte Ventrikelwand treffen. Verwenden Sie dann Lineal 2, um senkrechte Messungen von der innen- zur äußeren Ventrikelwand durchzuführen (Abbildung 5B).
- Verwenden Sie ImageJ, um die sieben Messungen für jedes Herz durchzuführen.
- Analysieren Sie je nach Bedarf die sieben Messungen oder den Mittelwert für eine repräsentative rechtsventrikuläre Wandstärke. Normalisieren Sie sich auf das ganze Herzgewicht für spezifische ventrikuläre Wanddickenänderungen.
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Representative Results
Belichtungsergebnisse
Luftzellen-Injektion
Die Injektion von Luftzellen kann sich entwickelnde Hühnerembryonen effektiv verschiedenen Wirkstoffen aussetzen, die anschließend in den gesammelten Proben (Serum, Gewebe usw.) von Embryonen / schlüpfenden Hühnern nachgewiesen werden können. Hier ist ein Beispiel, bei dem Perfluoroctansäure (PFOA) in Luftzellen injiziert wurde und die Serum-PFOA-Konzentrationen dann mit Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie bestimmt wurden. Die Serumkonzentrationen entsprachen den injizierten Dosen, was auf die Wirksamkeit dieses Verfahrens hinweist (Abbildung 6).
Mikroinjektion
Die Mikroinjektion kann die sich entwickelnden Embryonen Wirkstoffen aussetzen, die möglicherweise nicht effektiv in die innere Membran eindringen, oder mit einer kurzen Wirkungsdauer, wie z. B. Lentivirus. Hier ist ein Beispiel, bei dem Lentivirus am zweiten Embryonaltag mit dieser Methode injiziert wurde und dann eine signifikante grüne Fluoreszenz im Herzen der embryonalen Embryonen des 15. Tages beobachtet wurde, was auf die Wirksamkeit der Lentivirus-Transfektion hinweist (Abbildung 7).
Infusion von Luftzellen
Die Luftzellinfusion ist eine neuartige Methode, die sehr gut für eine geringe Menge an Gas- / Aerosolinhalationsexposition während der Einleitungsphase der externen Atmung funktionieren kann. Hier ist ein Beispiel, bei dem Dieselabgase am embryonalen Tag 18 und 19 in die Luftzellen infundiert wurden, was zu signifikanten fibrotischen Veränderungen im Herz- und Lungengewebe führte (Abbildung 8).
Ergebnisse der Endpunktbewertung
Ergebnisse der Elektrokardiographie
Aufgrund der Begrenzung von zwei Elektroden können nur 3 Kanäle der Elektrokardiographie gezeigt werden. Sie reichen jedoch aus, um r-Wellen zu unterscheiden, so dass sie für funktionelle Bewertungen verwendet werden können. In einem realen Beispiel zeigte die Elektrokardiographie von Hühnern, die Dieselabgasen ausgesetzt waren, ein signifikant verkürztes R-R-Intervall, was auf funktionelle Veränderungen hinweist (Abbildung 9).
Histopathologische Ergebnisse
Unsere Methode der rechtsventrikulären Wanddickenbewertung wurde in mehreren Studien erfolgreich eingesetzt5,7,8,9,10,11,12. In einer unserer früheren Studien führte die Exposition gegenüber Dieselabgasen zu einer verdickten rechtsventrikulären Wand (Abbildung 10).
Abbildung 1: Demonstration der Luftzelleninjektion. Ein unentwickeltes fruchtbares Ei ist auf dem Bild zu sehen, aber Embryonen in allen verschiedenen Stadien können mit dieser Methode exponiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Demonstration der Mikroinjektion. Im Bild ist ein früher Embryo zu sehen, der der bevorzugte Belichtungszeitpunkt für diese Methode ist, aber auch andere Zeitpunkte können ausprobiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Demonstration der Luftzelleninfusion. Ein Embryo im Spätstadium, der sich einem inneren Pipping unterzieht, ist auf dem Bild zu sehen, was der bevorzugte Belichtungszeitpunkt für diese Methode ist. Vier Stufen der Operation wurden gezeigt. 1: Intakter Embryo. 2: Zwei Löcher wurden gemacht. 3: Infusion wird durchgeführt. Der PVF-Probenahmebeutel ist ebenfalls unten links dargestellt. 4: Die Infusion ist abgeschlossen, die Löcher mit Klebeband versiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Demonstration der Elektrokardiographie. Das obere linke Feld zeigte, wie ein jungendes Huhn betäubt und einer Elektrokardiographie-Messung unterzogen wurde. Oben rechts zeigt das Elektrokardiographie-Instrument mit den angebrachten Elektroden. Die untere Tafel zeigt eine repräsentative Elektrokardiographie, die von den Hühnern erworben wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Demonstration der histopathologischen Beurteilung der rechtsventrikulären Wanddicke (Hämatoxylin- und Eosinfärbung). (A) Demonstration der Schnittposition von Hühnerherzen vor der Einbettung. (B) Demonstration der rechtsventrikulären Wanddickenmessung. Maßstabsbalken stellen 1000 μm dar. Blaue Kreise zeigen die sieben Messpunkte an der rechten Innenventrikelwand. Der rote Kreis zeigt einen Messpunkt an der äußeren rechten Ventrikelwand. Arrow demonstriert die anatomische Landmarke für die entsprechende Querschnittsposition. Diese Zahl wurde von Jiang et al. Toxicologymodifiziert. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Serumkonzentration von Perfluoroctansäure aus Bruthühnern nach Luftzelleninjektion mit 0, 0,5, 1 oder 2 mg/Ei kg Perfluoroctansäure vor der Inkubation. Die resultierenden Serumkonzentrationen entsprachen den injizierten Dosen, was auf die Wirksamkeit der Luftzelleninjektion hinweist. Diese Zahl wurde von Jiang et al. Toxicologymodifiziert. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Nachweis der Lentivirus-Transfektionswirksamkeit nach Mikroinjektionsexposition (Direkte Beobachtung nach Kryoschnitt). Linke Panels zeigten Lichtfeldbilder, während rechte Panels grüne Fluoreszenz für die gleichen Gewebeabschnitte zeigten. Embryonaler Tag zwei Hühnerembryonen wurden mit Lentivirus oder Kontrolle injiziert und dann bis zum embryonalen Tag 15 inkubiert. Die Herzen wurden eingefroren und direkt unter einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. (A) Kontrollgruppe, wenig grüne Fluoreszenz war vorhanden. (B) Lentivirus-exponierte Gruppe, signifikante grüne Fluoreszenz wurde beobachtet, was auf die Wirksamkeit der Lentivirus-Transfektion nach Mikroinjektion hinweist. Maßstabsbalken stellen 125 μm dar. Diese Zahl wurde von Zhao et al. Environmental Toxicology and Pharmacologymodifiziert. 56, 136-144 (2017)11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Demonstration der Wirksamkeit der Luftzellinfusion. Hühnerembryonen wurden am embryonalen Tag 18 und 19 mit Dieselabgasen infundiert, und dann wurden die geschlüpften Hühner für 0, 1 oder 2 Wochen gehalten und dann geopfert. Das Herzgewebe wurde mit Masson Trichrome-Färbung auf fibrotische Läsionen untersucht. Pfeile zeigten die fibrotischen Läsionen (blaue Färbung). *: statistisch verschieden von der Kontrolle (P<0,05 aus der Varianzanalyse und den Tests mit den geringsten signifikanten Unterschieden). Maßstabsbalken stellen 150 μm dar. Diese Zahl wurde von Jiang et al. Environmental Pollutionmodifiziert. 264, 114718 (2020)8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Demonstration der Wirksamkeit der Elektrokardiographie. Hühnerembryonen wurden am embryonalen Tag 18 und 19 mit Dieselabgasen infundiert, und dann wurden die geschlüpften Hühner für 0, 1 oder 2 Wochen gehalten und dann wurde eine Elektrokardiographie durchgeführt. Signifikant verkürzte R-R-Intervalle wurden bei den Hühnern beobachtet, die durch Luftzelleninfusion Dieselabgasen ausgesetzt waren, was auf die Wirksamkeit der Methode hinweist. *: statistisch verschieden von der Kontrolle (P<0,05 aus der Varianzanalyse und den Tests mit den geringsten signifikanten Unterschieden). Diese Zahl wurde von Jiang et al. Environmental Pollutionmodifiziert. 264, 114718 (20208. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Demonstration der Wirksamkeit der rechtsventrikulären Wanddickenmessung (Hämatoxylin- und Eosinfärbung). Hühnerembryonen wurden am embryonalen Tag 18 und 19 mit Dieselabgasen infundiert, und dann wurden die geschlüpften Hühner für 1 Woche gehalten, und dann wurde eine histologische Beurteilung der rechtsventrikulären Wanddicke durchgeführt. A: Repräsentative Bilder der Herzquerschnitte. Beachten Sie das Vorhandensein eines anatomischen Markers in allen rechten Ventrikeln (Bei älteren Hühnern ist der Marker an der gewünschten Position tendenziell etwas länger, was die Genauigkeit der Messungen nicht beeinträchtigt). B: Quantifizierung der rechtsventrikulären Wandstärke, die zunächst mit Standardobjektträgern auf tatsächliche Länge umgerechnet und dann mit ganzem Herzgewicht normalisiert wurde, wurde somit in Form von um/ug dargestellt. Blaue Pfeile: zwei Enden der freien rechtsventrikulären Wand. Rote Pfeile: die Mittelpunkte der rechtsventrikulären Wand. Schwarze Pfeile: anatomischer Marker. *: statistisch verschieden von der Kontrolle (P<0,05 aus der Varianzanalyse und den Tests mit den geringsten signifikanten Unterschieden). Maßstabsbalken stellen 1000 μm dar. Diese Zahl wurde von Jiang et al. Environmental Pollutionmodifiziert. 264, 114718 (2020)8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der Hühnerembryo ist seit 200 Jahren ein klassisches Modell in Entwicklungsstudien1. Unsere in diesem Manuskript vorgestellten Methoden wurden bei der Bewertung mehrerer Umweltkontaminanten, einschließlich Perfluoroctansäure, Feinstaub und Dieselabgasen, mit Erfolg5,7,8,9,10,11,12verwendet. Mit diesen Methoden wurde die Entwicklungskardiotoxizität kostengünstig und eindeutig angezeigt. Darüber hinaus ist es nicht schwierig, Hühnerembryonen mit anderen interessanten Verbindungen auszusetzen und eine mögliche Entwicklungskardiotoxizität zu bewerten.
Die Luftzellinjektionsmethode ist eine klassische Methode, die zuvor in vielen Studien13,14,15verwendet wurde und bequem und effektiv ist. Im Vergleich zu anderen Entwicklungsexpositionsmethoden, wie den Nagetiermodellen16,17,18, weist es eine direkte Exposition in einem geschlossenen System auf, was die Variabilitäten aufgrund mütterlicher Effekte und unterschiedlicher Ausscheidung stark reduziert. Die Mikroinjektion ist eine Verbesserung der Luftzellinjektionsmethode, die eine endgültige Exposition an oder in der Nähe der Entwicklung eines frühen Embryos gewährleistet, die ähnliche Wirkungen wie bei Utero-Injektionen in Nagetiermodellen erzielen kann19,20. Im Vergleich zu In-utero-Injektionen ermöglicht unsere Methode eine visuelle Bestätigung der Injektion mit relativ einfachen Manipulationsschritten, und eine genaue Injektion wird leicht durch die Kontrolle des Eigewichts erreicht, was bei der In-utero-Injektion nicht möglich ist, wo die tatsächliche Menge und das Gewicht der Embryonen nicht leicht erworben werden können. Die Infusionsmethode dient hauptsächlich der Beurteilung von inhalativen Agenzien auf dem Lungensystem, aber Kardiotoxizität und Lungentoxizität treten oft gleichzeitig auf. Diese Methode nutzt die Luftzelle, in die eine kleine Menge Gas oder Aerosol infundiert wird, was eine kontinuierliche Inhalation von Gas / Aerosol ohne die Notwendigkeit spezifischer Inhalationskammern ermöglicht. Gegenstück-Nagetiermodelle müssen relativ große Mengen an Gas / Aerosol und große, teure Inhalationsinstrumente verwenden21,22.
Die beiden routinemäßig in unserem Labor getesteten Endpunkte, die Elektrokardiographie und die histomorphometrische Beurteilung der rechtsventrikulären Wanddicke, stellen funktionelle bzw. morphologische Veränderungen nach toxischer Exposition dar. Die Beurteilung der rechtsventrikulären Wandstärke hat spezifische Vorteile, um ein umfassendes Verständnis der rechtsventrikulären Wand zu erhalten, da die traditionelle echokardiographische Beurteilung des rechten Ventrikels aufgrund der asymmetrischen und komplexen Halbmondform des rechten Ventrikels23in der Regel eine Herausforderung und nicht sehr genau ist. Unsere Methode kann helfen, diese Ungenauigkeit zu überwinden, indem sie mit zusätzlichen Informationen über die rechtsventrikuläre Wandstärke an einer repräsentativen Position ergänzt wird. Derzeit ist alles manuell, in Zukunft können die Messungen automatisch durchgeführt werden und die Anzahl der Messpunkte kann erheblich erhöht werden, was die Genauigkeit dieser Methode weiter verbessert.
Auf Hühnerembryonen basierende Entwicklungsmuster haben in toxikologischen Studien mehrere Vorteile, wie die Fähigkeit, eine relativ genaue Expositionsdosis zu liefern, ein unabhängiges Expositionssystem in der Schale und eine einfache Manipulation des sich entwickelnden Embryos. In Bezug auf die Kardiotoxizität haben Hühner relativ große Herzen und dicke ventrikuläre Wände, was eine einfache histomorphometrische Beurteilung ermöglicht. Es gibt einige Mängel, wie die Verfügbarkeit von Antikörpern / Primern und zusätzliche Käfigplatzanforderungen im Vergleich zu Nagetieren, wenn Hühner nach dem Schlüpfen aufgezogen werden. Dennoch ist der Hühnerembryo immer noch ein gutes alternatives toxikologisches Modell, das für mögliche Bewertungen der Kardiotoxizität in der Entwicklung verwendet werden kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
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