Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att generera stora volymer av lipid inkapslade decafluorobutane microbubbles med hjälp av sond-tips ultraljudsbehandling och därefter kondensera dem till fas-skift nanodroplets med högtryck extrudering och mekanisk filtrering.
Abstract
Det finns många metoder som kan användas för produktion av vaporizable fas-shift droppar för avbildning och terapi. Varje metod använder olika tekniker och varierar i pris, material och syfte. Många av dessa tillverkningsmetoder resulterar i polydisperspopulationer med icke-enhetliga aktiveringströsklar. Dessutom kräver styrning av droppstorlekarna vanligtvis stabila perfluorkarbonvätskor med höga aktiveringströsklar som inte är praktiska in vivo. Att producera enhetliga droppar storlekar med låg kokpunkt gaser skulle vara fördelaktigt för in vivo imaging och terapi experiment. Denna artikel beskriver en enkel och ekonomisk metod för bildandet av storlek-filtrerade lipid-stabiliserade fas-skift nanodroppar med låg kokpunkt decafluorobutane (DFB). En vanlig metod för att generera lipidmikrobubblor beskrivs, förutom en ny metod för att kondensera dem med högtrycksprofilering i ett enda steg. Denna metod är utformad för att spara tid, maximera effektiviteten och generera större volymer av mikrobubble- och nanodropletlösningar för en mängd olika tillämpningar med hjälp av vanlig laboratorieutrustning som finns i många biologiska laboratorier.
Introduction
Ultraljud kontrastmedel (UCAs) växer snabbt i popularitet för imaging och terapi applikationer. Microbubbles, de ursprungliga UCAs, är för närvarande de vanliga agenterna som används i kliniska diagnostiska applikationer. Mikrobubblor är gasfyllda sfärer, vanligtvis 1-10 μm i diameter, omgivna av lipid-, protein- eller polymerskal1. Deras storlek och in vivo-stabilitet kan dock begränsa deras funktionalitet i många applikationer. Fasförskjutningsnanodroppar, som innehåller en överhettad vätskekärna, kan övervinna några av dessa begränsningar på grund av deras mindre storlek och förbättrade cirkulationslivslängd2. När den överhettade vätskekärnan utsätts för värme eller akustisk energi förångas den till en gasmikrobubble2,3,4,5. Eftersom förångningströskeln är direkt relaterad till droppstorlek5,6, skulle det vara mycket önskvärt att formulera droppfjädringar med enhetlig storlek för att uppnå konsekventa aktiveringströsklar. Formuleringsmetoder som producerar enhetliga droppstorlekar är ofta komplexa och kostsamma, medan mer kostnadseffektiva metoder resulterar i polydisperselösningar7. En annan begränsning är förmågan att generera stabila fasförskjutningsdroppar med PFC-gaser (Low-boiling Point perfluorocarbon), vilket är avgörande för effektiv aktivering in vivo8. I detta manuskript beskrivs ett protokoll för att generera stabila filtrerade låg kokpunkt vaporizable fas-shift droppar för in vivo imaging och terapi applikationer.
Det finns många metoder för att producera monodispersed submicron fasförskjutning droppar7. En av de mest robusta metoderna för att kontrollera storleken är användningen av mikrofluidiska enheter. Dessa enheter kan vara kostsamma, ha långsam produktion av droppar (~ 104-106 droppar / s) 7 och kräver omfattande utbildning. Mikrofluidiska enheter kräver också i allmänhet gaser med hög kokpunkt för att undvika spontan förångning och igensättning av systemet7. En ny studie av de Gracia Lux et al.9 visar dock hur kylning av en mikrofluidizer kan användas för att generera höga koncentrationer av submikrinfasförskjutning (1010-1012/ml) med låg kokpunkt dekafluorbutan (DFB) eller octafluorpropan (OFP).
I allmänhet är gaser med låg kokpunkt som DFB eller OFP lättare att hantera med förformade gasbubblor. Vaporizable droppar kan produceras från föregångare lipid-stabiliserade bubblor genom att kondensera gasen med låga temperaturer och förhöjt tryck5,10. Koncentrationen av droppar som produceras med denna metod beror på prekursormikrobubblekoncentration och effektiviteten av omvandling av bubblor till droppar. Koncentrerade mikrobubblor har rapporterats från tips ultraljudsbehandling närmar sig > 1010 MB/mL11, medan en separat studie har rapporterat droppkoncentrationer som sträcker sig från ~1-3 x1011 droppar/mL från kondenserade OFP och DFP bubblor12. När monodispersed droppar inte är ett problem, kondensation metoder är de enklaste och lägsta kostnadsmetoderna för att generera lipidstabiliserade fasförskjutning droppar med låg kokpunkt PFC. Metoder för att generera enhetliga storlek bubblor innan kondensering kan bidra till att skapa mer monodisperse populationer av droppar. Att generera monodisperse prekursorbubblor är dock också svårt, vilket kräver dyrare metoder som mikrofluidik eller upprepade differentialcentrifugeringstekniker11. Ett alternativt tillvägagångssätt för att producera DFB och OFB nanodroppar har nyligen publicerats med hjälp av spontana nukleering av droppar i liposomer13. Denna metod, med hjälp av en "Ouzo" -effekt, är ett enkelt sätt att generera PFC-droppar med låg kokpunkt utan att behöva kondensera bubblor. Storleksfördelningen av PFC droppar kan styras genom delikat titrering och blandning av PFC, lipid och etanol komponenter som används för att initiera nukleation av dropparna. Det är också värt att notera att blandning av perfluorkarboner kan användas för att kontrollera stabilitets- och aktiveringströsklar för nanodroppar14,15. Nyare arbete av Shakya et al. visar hur nanodropletaktivering kan justeras genom att emulgera höga kokpunkts-PFC inom ett kolväteendoskelett för att underlätta heterogen nukleation inom droppkärnan16, vilket är ett tillvägagångssätt som kan övervägas tillsammans med andra former av filtrering av droppstorlek.
När de har bildats kan fasförskjutningsdroppar extruderas efter bildandet för att skapa fler monodisperse populationer. Faktum är att ett liknande protokoll som den metod som beskrivs här har publicerats tidigare av Kopechek et al.17 med hjälp av hög kokpunkt dodecofluorpentane (DDFP) som droppkärna. Läsare som försöker använda fasförskjutningsdroppar med hög kokpunkt perfluorkarboner (stabila vid rumstemperatur) bör hänvisa till artikeln ovan istället. Att generera och extrudera droppar med låg kokpunktsgaser, såsom DFB och OFP, är mer komplicerat och kontaktas bäst genom att kondensera förformade gasbubblor.
I detta protokoll beskrivs en vanlig metod för att generera förformade lipid microbubbles med en DFB gas kärna med hjälp av sond tips ultraljudsbehandling. Därefter används en kommersiell extruder för att kondensera förformade mikrobubblor till submicronfasförskjutningsnanodroppar (figur 1). De resulterande dropparna aktiveras sedan med värme och ultraljud. Denna metod kan producera större volymer nanodropletlösning än konventionella kondensationsmetoder med smalare storleksfördelningar utan behov av dyra mikrofluidiska enheter. Produktion av nanodropletlösningar med smala storleksfördelningar kan sannolikt generera mer enhetliga förångningströsklar. Detta kommer att maximera deras potential för många applikationer såsom avbildning, ablation, läkemedelsleverans och embolization1,3,4,6.
Bild 1: Schematisk högtrycksprofilering för kondensering av förformade mikrobubblor till fasförskjutningsnanodroppar. Mikrobubblelösning tillsätts till och finns i extruderkammaren, och 250 psi, från kvävetanken, appliceras genom kammarens inloppsventil. Kvävegasen kommer att driva mikrobubblelösningen genom filtret vid kammarens botten och kondensera provet till nanodroppar. Lösningen trycks slutligen ut ur extrudern genom provutloppsröret och samlas in. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Göra lipidfilmer
- Förbered lipidfilmer för mikrobubblegenerering med 90% DSPC och 10% DSPE-PEG2K genom att blanda lipiderna i rätt förhållande med följande anvisningar:
- Gör lagerfetter av DSPC och DSPE-PEG2K i kloroform. Väg 50 mg av varje lipidpulver i separata injektionsflaska. Tillsätt 1 ml kloroform till varje flaska med en 1 ml glasspruta.
- Tillsätt 287 μL DSPC-buljong och 113 μL DSPE-PEG2K-buljong (båda 50 mg/ml) i en 20 ml scintillationsflaska med en glasspruta.
- Torka de blandade lipiderna för att avlägsna kloroform med kväve. Använd en lämplig slanglängd som är ansluten till husets kväve, flöda lätt kvävegas över injektionsflaskans huvudutrymme under blandning. Fortsätt tills ingen kloroform observeras och den återstående lipidfilmen börjar bli vit. Använd polypropylenskruvlock, täck provet samtidigt som kväve förs in i huvudutrymmet.
- Placera injektionsflaskan under vakuum över natten med hjälp av en vakuumavsick för att avlägsna eventuell kvarvarande kloroform. En tunn genomskinlig film kommer att förbli som täcker botten av injektionsflaskan.
- Förvara injektionsflaskan vid -20 °C tills det behövs.
2. Generera mikrobubblor från lipidfilmer
- För att göra mikrobubblorna, tillsätt 10 ml 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS) som innehåller 20% v/v Propylenglykol och 20% v/v Glycerol (slutligt pH 7,2-7,4) till en torr lipidfilm.
- Kapsejsa provet och varmprovet till 65 °C i 30 minuter på ett värmeblock (eller uppvärmt vattenbad).
- Medan provet värms upp ber du badljudatorn genom att höja badtemperaturen till 65 °C.
OBS: Denna process är snabbare om vattnet är förvärmt i mikrovågsugn eller kokplatta innan det placeras i badljudaren. - Placera scintillationsflaskan som innehåller det uppvärmda provet i badljudaren så att endast den del av injektionsflaskan som innehåller lipidlösningen är nedsänkt i vattenbadet.
- Sonikera den varma lipidlösningen i minst 15 min. Se till att vattentemperaturen förblir vid 65 °C. Fortsätt att sonikera i intervaller om 10-15 min tills lösningen är helt klar (figur 2).
OBS: Om en badljuderare inte är tillgänglig kan lösningen spetsas med 10% effekt tills den är klar. Mikrotip kommer dock att slitas ut snabbare och är dyrare att byta ut.
Figur 2: Exempel på hydratiserade lipidfilmer. Exempel på hydratiserad lipidfilm (A) före och (B) efter bad ultraljudsbehandling att bilda uni-lamellar vesiklar. Efter bad ultraljudsbehandling, lipid lösningen bör skifta från en mer ogenomskinlig till genomskinlig lösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- När du fortfarande är varm, ta bort locket och kläm fast injektionsflaskan i ljudisolatorns ljudisolerade hölje så att ljudatorns mikrotoppfäste är nedsänkt precis under luft-/vätskegränssnittet (bild 3).
- Placera tanken på decafluorbutan bredvid ljudisolatorhöljet.
- Förbered ett isbad och placera det bredvid det ljudisolerade höljet. Detta kommer att användas senare i steg 2.14.
- Slå på strömbrytaren för ljuddatorn.
- När systemet har startat ställer du in effektnivån på 70 %. Överskrid inte 70% amplitud med microtip-tillbehöret. Starta inte ljuddatorn för tillfället.
- Fäst en lämplig slanglängd för att styra gasen från DFB-tankens utlopp till den varma lipidlösningen som hålls i höljet. Röret ska placeras precis i injektionsflaskans hals så att gas kan flöda in i huvudutrymmet under ultraljudsbehandling (figur 3).
- Öppna tankventilen långsamt tills gasen kan ses flöda över lipidlösningen. Detta kommer att orsaka små krusningar på vätskans yta. Om gasflödet är för högt kommer lösningen att flöda över under mikrobubbleformuleringen.
- Starta ljudatorn och kör i 10 s kontinuerligt för att generera mikrobubblor. Om bubbellösningen börjar svämma över under ultraljudsbehandling, stoppa omedelbart ljudbehandlingsdonatorn.
- Stäng av ljudatorn och stäng omedelbart DFB-tankventilen.
- Kapa snabbt mikrobubblelösningen och dränk injektionsflaskan i isbadet för att kyla provet under 55 °C (DSPC:s glasövergångstemperatur)
- Lämna mikrobubbleproverna i isbadet tills det behövs.
Bild 3: Placering av sondspets i lipidlösning för att optimera mikrobubblebildningen. Var försiktig så att sondens spets inte vidrör glaset. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
3. Förbereda extruder för mikrobubblekondensation
- Montera högtrycks extruder enligt bruksanvisningen med ett 200 nm keramiskt filter (levereras från tillverkaren).
- Placera extrudern i mitten av en vattentät behållare så att provutloppsröret inte pressas mot sidan eller pressas.
- Koppla extrudern till kvävegastanken med hjälp av adaptern som levereras av tillverkaren.
- Gör ett saltat isbad på -2 °C i den vattentäta behållaren runt extrudern med 400 ml vatten och 10 g natriumklorid.
- Placera utloppsrörets ände i en scintillationsflaska för att samla in det extruderade provet.
OBS: Fäst röret på behållaren med tejp om det inte ligger platt eller stannar i injektionsflaskan.
4. Priming extrudern för mikrobubblekondensation
- Öppna och stäng frigöringsventilen för att se till att det inte finns något tryck i extrudern.
- Ta bort kammarlocket och tillsätt 5 ml 1x PBS i extruderkammaren.
- Sätt tillbaka locket så att det klickar säkert på plats igen.
- Öppna kvävegastanken så att tryckmätaren avläser 250 psi. Se till att tryckregleringsventilen är stängd.
- Stäng gastanken och öppna extruderkammarens inloppsventil. PBS-lösningen kommer att skjutas genom systemet och ut provutloppsröret i scintillationsflaskan.
- När endast gasen lämnar slangen, öppna frigöringsventilen och låt trycket falla till 0 psi.
- Ta bort scintillationsflaskan.
5. Förkylning av mikrobubblor för extrudering
- Öppna och stäng frigöringsventilen för att se till att det inte finns något tryck i extrudern. Placera en ny scintillationsflaska i slutet av utloppsröret.
- Fyll en stålbehållare med 2-metyl butan och tillsätt torris för att få ner temperaturen till -18 °C.
- Sätt in mikrobubblelösningen i den kylda 2-metyl butanen så att provet är nedsänkt i 2 min. Flytta scintillationsflaskan under 2 min för att försiktigt blanda bubblorna. Tillsätt torris efter behov för att hålla temperaturen mellan -15 och -18 °C. Var försiktig så att du inte överskrider -20 °C, annars fryser och förstörs bubbelprovet.
OBS: Steg 5.2 och 5.3 kan också göras genom att kyla bubbelprovet i en laboratoriefrys under en längre tidsperiod. Försiktighet bör dock iakttas för att noggrant övervaka frysens temperatur och undvika att frysa provet. - Efter 2 min, ta bort mikrobubblorna från den kylda 2-metyl butanen, skaka försiktigt injektionsflaskan för att blanda mikrobubblorna och använd en kyld 10 ml spruta för att överföra lösningen till extrudern.
- Ta bort extruderkammarlocket och tillsätt mikrobubblelösningen i kammaren genom att långsamt trycka kolven på sprutan. Byt ut extruderlocket och se till att det klickar säkert tillbaka på plats.
- Kontrollera att tryckregleringsventilen och extruderns frigöringsventil är i stängt läge.
- Öppna kvävegastanken tills tryckmätaren avläser 250 psi, stäng gastanken och vrid tryckregleringsventilen till öppet läge.
- När lösningen har fyllt scintillationsflaskan vid utgångsslangen, och endast gasen lämnar röret, öppna långsamt tryckavlastningsventilen och låt trycket falla till 0 psi.
- Placera scintillationsflaskan i ett isbad eller kylskåp för förvaring.
- För långvarig lagring och minimering av spontan förångning, förvara provet i en standardfrys. Se till att temperaturen är -20 °C eller högre för att undvika frysning av provet (den hjälpbara lösningen på 20% PPG och 20% Glycerol kommer att hålla provet från att frysa i de flesta laboratoriefrysar).
6. Separera droppar från liposomer genom centrifugering
- Överför 10 ml av den extruderade dropplösningen till ett 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera det extruderade provet vid 1 500 x g i 10 min vid 4 °C. En pellet bestående av DFB-nanodroppar kommer att visas längst ner på röret (figur 4). Spontant förångade droppar kommer att dyka upp högst upp i lösningen och bör kasseras.
Figur 4: Exempel på fasförskjutning av DFB droppar pelletering efter centrifugering. DFB nanodroppar är tätare än liposomer och kommer att samlas längst ner på centrifugröret i en pellet( röd låda). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten i 2 ml 1x PBS med 20% glycerol och 20% propylenglykol.
- Blanda röret försiktigt för att få en homogen lösning och överför dropparna till ett mindre 2 ml centrifugrör.
- Tvätta provet ytterligare två gånger i 2 ml centrifugrör.
- Efter den sista tvätten återanvänds pelleten i 100 μL 1x PBS med 20% glycerol och 20% propylenglykol och förvaras på is eller i frysen tills det behövs.
7. Mikroskopiverifiering av droppförångning
- Gör en utspädd dropplösning genom att tillsätta 2,5 μl koncentrerade droppar till 7,5 μl 1x PBS.
- Förbered en mikroskopbild med 10 μl av det utspädda provet. Använd ett 40x-mål och observera exemplet och spara bilder.
- Ta bort bilden från mikroskopet och placera den på en 65 °C värmeplatta i 1 min för att förånga nanodroppar till mikrobubblor.
- Använd samma 40x-mål för att observera provet efter uppvärmning för att verifiera droppångning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat av storleksfördelningen ingår med hjälp av analys av dynamisk ljusspridning (DLS) och tunable resistiv pulsavkänning (TRSP). Figur 5 visar storleksfördelningen för kondenserade bubbellösningar med och utan extrudering. Utan extrudering slutar protokollet vid steg 5.3. De kylda bubblorna kondenseras genom att provet ventileras till atmosfärstryck medan det är kallt. Det kondenserade endast provet har en mycket bredare fördelning centrerad nära 400 nm. Det extruderade provet har en smalare fördelning centrerad vid 200 nm. Båda proverna inkluderar både liposomer och droppar, som inte kan urskiljas med DLS. Figur 6 visar ett representativt urval av fasförskjutningsdroppar efter att de har tvättats genom centrifugering för att avlägsna överflödiga liposomer (steg 6.7). TRPS användes för denna analys för att utvärdera både storleksfördelning och koncentration av dropparna ensam. I likhet med DLS visar TRPS droppstorlekarna nära 200 nm. Koncentrationerna varierar mellan 1011-1012 droppar per ml efter återanvändning av alla 100 μL slutlig dropplösning i 1 ml. TRPS-data är i genomsnitt tre mätningar per prov.
Figur 7 visar representativa mikroskopidata för nanodroplet förångning vid uppvärmning. I figur 7A (före förångning) är vissa mikrobubblor uppenbara i synfältet (vita pilar). Detta beror på de överhettade nanodropparnas spontana förångning när mikroskopbilder bereds och avbildas vid rumstemperatur. Efter uppvärmning observeras stora mikrobubblor (figur 7B). Data här fångar inte bubblorna omedelbart efter förångning. Det är troligt att kolescensen av bubblor uppstår efter förångning innan de kan avbildas igen. Denna strategi är användbar för att bekräfta förekomsten av nanodroppar före TRPS-storlek eller användning in vivo.
Kylning av bubblorna före kondensation är ett viktigt steg för att maximera dropputbytet. Figur 8 visar representativa bilder av droppar efter förångning när ingen kylning utförs (figur 8A), extrudern kyls till 0 °C, men mikrobubblorna kyls inte till -18 °C (figur 8B) och när protokollet följs exakt (figur 8C).
Detta protokoll genomfördes också, som skrivet, för att kondensera låg kokpunkt OFP bubblor. Figur 9 visar representativa bilder av OFP-droppar före och efter förångning från värme. Liksom med DFB-dropparna är en betydande mängd kolescens sannolikt efter uppvärmning. Således är bubbelstorlekarna sannolikt inte representativa för de första dropparna eller bubblorna vid förångning. Pelletering och mikroskopi bekräftar närvaron och aktiviteten hos fasförskjutning AV OFP droppar.
Bild 5: Dynamiska ljusspridningsdata som jämför droppfjädring med (heldragen linje) och utan (streckad linje) extrudering. Proverna mättes omedelbart efter kondensering och extrudering med hjälp av ett DLS-ljusspridningssystem. De data som visas här är i genomsnitt tre mätningar per prov. Analys utförs före tvätt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Storleksfördelning av storleksfiltrerade dekafluorbutandroppar från TRPS-analys. Data kommer från i genomsnitt tre mätningar på ett enda prov. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 7: Exempel mikroskopi bilder av fasförskjutning decafluorobutane droppar före och efter förångning. (A) Vissa bubblor kan observeras före förångning, sannolikt på grund av spontan förångning av låg kokpunkt DFB droppar i bubblor (mikroskopi utförs vid rumstemperatur). B) En betydande ökning av mikrobubblor observeras efter uppvärmning. Skalningsstaplar är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 8: Exempelmikroskopibilder efter förångning av fasförskjutningsdroppar kondenserade vid olika temperaturer. (A) Mikrobubblor sätts in i extrudern direkt utan förkylning. b) Extrudern kyls till 0°C i ett isbad och mikrobubblor sätts in i kammaren och får balansera i 2 min(C) Extrudern kyls till 0 °C i ett isbad och mikrobubblorna förkyls till -18 °C i 2 minuter innan den placeras i extrudern. Förkylda mikrobubblor kommer i allmänhet att ha mindre storlekar och ett högre utbyte av droppar. Skalstängerna är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 9: Exempel mikroskopibilder fasförskjutning octofluorpropane droppar före och efter förångning. Skalningsstaplar är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En omfattande mängd litteratur finns tillgänglig som diskuterar formulering, fysik och potentiella tillämpningar av microbubbles och fas-skift droppar för in vivo imaging och terapi. Denna diskussion gäller uttryckligen att generera lipidmikrobubblor och omvandla dem till sub-micron fasförskjutning droppar med hjälp av en låg kokpunkt DFB gas och högtryck extrudering. Metoden som beskrivs här är avsedd att ge en relativt enkel metod för att producera stora mängder lipidmikrobubblor och DFB fasförskjutningsdroppar genom att kombinera tidigare mikrobubblekondensationsmetoder med droppprofilering i ett enda steg. Denna metod har fördelen att generera höga koncentrationer av bubblor som används för att bilda DFB droppar med smala storleksfördelningar baserat på filterval. Den smala storleksfördelningen är betydande på grund av de resulterande konsekventa förångningströsklarna. Den här metoden är enklare och billigare än andra vanliga metoder som används för att generera en smal storleksfördelning. Dessutom är den potentiella lösningsvolymen större än andra jämförbara metoder. Protokollet kan delas in i tre huvudkategorier: (1) Generera lipidmikrobubblor, (2) Kondenserande och extruderande mikrobubblor, (3) Separera fasförskjutningsdroppar från liposomer genom centrifugering.
Microbubble generation med hjälp av sond-tip ultraljudsbehandling är ett av de vanligaste sätten att göra lipid mikrobubbles. Det finns många publikationer som beskriver denna procedur. Detta protokoll är anpassat från Feshitan et al.11 och optimerat för att göra 10 ml mikrobubblelösning, vilket är den maximala kapaciteten hos extrudern. Denna metod kan också skalas upp för att generera större volymer av lipidmikrobubblor lösning genom att ta bort microtip-fästet och öka lipidlösningsvolymen till 100 ml eller mer, vilket framgår av Feshitan et al11. På samma sätt kan större extruders i kommersiell skala som rymmer volymer från 100 ml till 800 ml användas för att rymma ökade mikrobubblevolymer, vilket maximerar droppproduktionen. Metodens resultat begränsas endast av den utrustning som används, som kan modifieras för att öka volymen i enlighet därmed. Storleksfiltrerad droppproduktion är fördelaktig för olika applikationer på grund av mer enhetliga förångningströsklar. Framtida ändringar av protokollet kan göras för att individualisera resultaten för specifika behov, såsom funktionalisering av mikrobubble och droppskal för antikroppsbelastning och molekylär inriktning.
Extruderingsmetoden som används här används ofta för monodispersed liposomberedning. En liknande metod har också använts tidigare för att generera fasförskjutningsdroppar med hjälp av högre kokpunkt DDFP droppar17. Det finns vissa kritiska skillnader i denna beskrivna metod, nämligen (1) generering av förformade mikrobubblor med lågkokningspunktsgaser (DFB), (2) kylning av bubbellösningen och extrudersystemet för att effektivt bilda droppar och (3) snabb applicering av tryck för att maximera droppkondenseringseffektiviteten och undvika bubbelgasupplösning10.
Kylning av mikrobubbleprovet för extrudering är ett viktigt steg för att generera höga koncentrationer av stabila DFB-droppar. I detta protokoll placeras hela extrudern i ett salt som innehåller isbad och hålls vid -2 °C. Extrudern har inlopps- och utloppsportar för cirkulerande vätska för att möjliggöra effektivare och snabbare kylning, vilket kräver en cirkulerande pump. För DFB-droppproduktion kan höga koncentrationer av droppar (1011-1012 droppar/ml) genereras utan ett cirkulerande vattensystem. Det förväntas dock att produktionen av droppar kan förbättras ännu mer genom att inkludera ett kallt cirkulerande bad, vilket minskar väntetiden för kylning. Detta exakta protokoll har också använts för OFP-mikrobubblor. Intressant nog tycktes OFP-bubblorna vara mer talrika och mindre när de observerades med mikroskopi (figur 9), även om utbytet av droppar är märkbart mindre efter tvättning och insamling av pelleten. Att kyla extrudern ytterligare och öka trycket från kvävetanken skulle sannolikt förbättra OFP-droppproduktionen. OFP droppar är också notoriskt instabila och kräver skonsam hantering och korrekta lagringsförhållanden för att minimera spontan förångning.
Snabb tillämpning av tryck är ett annat kritiskt steg i detta förfarande. Användningen av extrudering i detta protokoll beror på ett tryck och omedelbar tillämpning av detta tryck på mikrobubblorna i extruderkammaren. I standardprotokoll för lipidprofiler ökar trycket långsamt tills provet börjar passera genom membranfiltret. Experimentella observationer visade att långsam tillämpning av tryck kan leda till gasupplösning från bubbla kärnan, snarare än kondensering av bubblor i droppar. Därför beslutades att "prime" extruder inloppsrören med kvävegas genom att stänga gasinloppsventilen och ställa tanktrycket till 250 psi. Tanken måste sedan stängas av innan inloppsventilen öppnas mot extrudern. Underlåtenhet att följa denna del av förfarandet kommer att leda till snabb utvisning och förlust av prov från extruderns utlopp. Tryck över 250 psi kan också orsaka provförlust på grund av snabb utvisning av provet, även när tanken stängdes ordentligt. Vid förberedelse, slutförande av steg eller användning av extrudern på något sätt bör man vara noga med att kontrollera tryckmätare och ventiler. Om trycket inte sjunker till noll eller lösningen inte lämnar extrudern som förväntat, kontrollera först att alla ventiler är i rätt läge; tryckavlastningsventilen alltid kan öppnas för att frigöra trycket utan att påverka kammarens innehåll. Det är också viktigt att lyssna efter flyktgas och titta på tryckmätare när trycket appliceras på extrudern. I allmänhet, om tryck appliceras, kommer lösningen antingen att börja komma ut ur utgångsslangen, eller så finns det en läcka i systemet. Se alltid till att prima systemet för att säkerställa att extrudern monteras korrekt innan du lägger till en mikrobubblelösning i kammaren. Med tiden kan O-ringarna slitas ut och förhindra att systemet tätas korrekt. För bästa resultat, se till att alla delar fungerar korrekt och att en tät tätning skapas. I protokollet som beskrivs här utfördes endast en enda extrudering. Det är möjligt att begränsa storleksfördelningen ytterligare genom att återinföra droppprovet i extrudern och utföra flera extruderingssteg (vanligtvis mellan 5 och 10). Flera profilering kommer sannolikt att minska den totala avkastningen av droppar. Med tanke på storleksfördelningarna från DLS och TRSP är en enda extrudering sannolikt tillräcklig för de flesta applikationer. Slutligen har detta protokoll optimerats för 200 nm filter. Trycket skulle sannolikt behöva optimeras för större eller mindre filterstorlekar.
När provet har extruderats bör det testas för att kontrollera om bubblorna var ordentligt kondenserade till droppar. Submicron droppar är inte synliga med hjälp av standard ljusavbildningstekniker, så de måste först förångas för att bli mer synliga6. Det är fortfarande viktigt att avbilda provet före förångning för att verifiera frånvaron av mikrobubblor eller bestämma nivån av spontan förångning innan du värmer dropparna. Bildbehandlingsprogram kan användas för att räkna och storleksanpassa mikrobubblorna i bilden för att tillhandahålla data om nanodropparna indirekt. Det bör dock noteras att efter förångning kommer bubblorna snabbt att förenas under uppvärmningen. Således återspeglar bubbelstorlek och räkningar från mikroskopianalys sannolikt inte de ursprungliga dropparna och koncentrationerna. Direkta mätningar av droppfördelningen och koncentrationen utförs bäst med hjälp av tunable resistiv pulsavkänning (TRPS) om tillgängligt. Representativa uppgifter om dropletfördelning från TRSP har lämnats (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dominique James i Dr. Ken Hoyts labb för att ha tillhandahållit TRSP-analys av vaporizable fas-shift nanodroppar
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).
- Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).
- Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects. Scientifica. 2014, 579684 (2014).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).
- Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Wu, S. -Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Li, D. S., et al. Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents. Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting. Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).
- Shakya, G., et al. Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions. Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).
- Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).
