Herstellung von membrangefilterten Phase-Shift-Decafluorbutan-Nanotröpfchen aus vorgeformten Mikrobläschen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen lipidverkapselter Decafluorbutan-Mikrobläschen mittels Sondenspitzen-Beschallung und anschließender Kondensation zu phasenverschobenen Nanotröpfchen mittels Hochdruckextrusion und mechanischer Filtration.

Abstract

Es gibt viele Methoden, die zur Herstellung von verdampfbaren Phasenverschiebungströpfchen für die Bildgebung und Therapie verwendet werden können. Jede Methode verwendet unterschiedliche Techniken und variiert in Preis, Material und Zweck. Viele dieser Herstellungsmethoden führen zu polydispersen Populationen mit ungleichmäßigen Aktivierungsschwellen. Darüber hinaus erfordert die Kontrolle der Tröpfchengrößen typischerweise stabile Perfluorcarbonflüssigkeiten mit hohen Aktivierungsschwellen, die in vivo nicht praktikabel sind. Die Herstellung einheitlicher Tröpfchengrößen unter Verwendung von Gasen mit niedrigem Siedepunkt wäre für In-vivo-Bildgebungs- und Therapieexperimente von Vorteil. Dieser Artikel beschreibt eine einfache und wirtschaftliche Methode zur Bildung von größengefilterten lipidstabilisierten Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen mit niedrig siedendem Decafluorbutan (DFB). Eine gängige Methode zur Erzeugung von Lipid-Mikrobläschen wird beschrieben, zusätzlich zu einer neuartigen Methode, sie mit Hochdruckextrusion in einem einzigen Schritt zu kondensieren. Diese Methode wurde entwickelt, um Zeit zu sparen, die Effizienz zu maximieren und größere Mengen an Mikroblasen- und Nanotröpfchenlösungen für eine Vielzahl von Anwendungen mit gängigen Laborgeräten zu erzeugen, die in vielen biologischen Labors zu finden sind.

Introduction

Ultraschall-Kontrastmittel (UCAs) werden für Bildgebungs- und Therapieanwendungen immer beliebter. Mikroblasen, die ursprünglichen UCAs, sind derzeit die Mainstream-Wirkstoffe, die in klinischen diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Mikrobläschen sind gasgefüllte Kugeln mit einem Durchmesser von typischerweise 1-10 μm, die von Lipid-, Protein- oder Polymerhüllen umgeben ^sind1. Ihre Größe und In-vivo-Stabilität können jedoch ihre Funktionalität in vielen Anwendungen einschränken. Phasenverschobene Nanotröpfchen, die einen überhitzten flüssigen Kern enthalten, können einige dieser Einschränkungen aufgrund ihrer geringeren Größe und verbesserten Kreislauflebensdauer ^überwinden2. Wenn er Hitze oder akustischer Energie ausgesetzt wird, verdampft der überhitzte flüssige Kern zu einer Gasmikrobläsche2,3,4,5. Da die Verdampfungsschwelle in direktem Zusammenhang mit der Tröpfchengröße5,6 steht, wäre die Formulierung von Tröpfchensuspensionen mit einheitlicher Größe sehr wünschenswert, um konsistente Aktivierungsschwellen zu erreichen. Formulierungsverfahren, die einheitliche Tröpfchengrößen erzeugen, sind oft komplex und kostspielig, während kostengünstigere Ansätze zu polydispersen Lösungen ^führen7. Eine weitere Einschränkung ist die Fähigkeit, stabile Phasenverschiebungströpfchen mit perfluorierten (PFC)-Gasen mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen, was für eine effiziente Aktivierung ^{in vivo8} entscheidend ist. In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur Erzeugung stabiler, gefilterter, verdampfbarer Phasenverschiebungströpfchen mit niedrigem Siedepunkt für In-vivo-Bildgebungs- und Therapieanwendungen beschrieben.

Es gibt viele Methoden zur Herstellung monodispersierter Submikron-Phasenverschiebungströpfchen7. Eine der robustesten Methoden zur Kontrolle der Größe ist die Verwendung von mikrofluidischen Geräten. Diese Geräte können teuer sein, eine langsame Tröpfchenproduktion aufweisen (~ 104-106 Tröpfchen / s) ⁷ und erfordern ein umfangreiches Training. Mikrofluidische Geräte benötigen im Allgemeinen auch Gase mit hohem Siedepunkt, um eine spontane Verdampfung und Verstopfung des Systems zu ^vermeiden7. Eine aktuelle Studie von de Gracia Lux et ^al.9 zeigt jedoch, wie die Kühlung eines Mikrofluididizers verwendet werden kann, um hohe Konzentrationen von Submikron-Phasenverschiebung (^1010-1012 / ml) unter Verwendung von Decafluorbutan (DFB) oder Octafluorpropan (OFP) mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen.

Im Allgemeinen sind Niedrigsiedepunktgase wie DFB oder OFP mit vorgeformten Gasblasen einfacher zu handhaben. Verdampfbare Tröpfchen können aus lipidstabilisierten Vorläuferblasen hergestellt werden, indem das Gas bei niedrigen Temperaturen und erhöhtem Druck kondensiert ^wird5,10. Die Konzentration der mit dieser Methode hergestellten Tröpfchen hängt von der Mikroblasenkonzentration der Vorstufe und der Effizienz der Umwandlung von Blasen in Tröpfchen ab. Konzentrierte Mikrobläschen wurden von der Spitzenbeschallung berichtet, die sich > ¹⁰¹⁰ MB / ^ml11 nähert, während eine separate Studie Tröpfchenkonzentrationen von ~ 1-3 x1011 Tröpfchen / ml aus kondensierten OFP- und DFP-Blasen12 gemeldet hat. Wenn monodispersierte Tröpfchen kein Problem darstellen, sind Kondensationsmethoden die einfachsten und kostengünstigsten Methoden zur Erzeugung von lipidstabilisierten Phasenverschiebungströpfchen unter Verwendung von PFCs mit niedrigem Siedepunkt. Methoden zur Erzeugung von Blasen gleichmäßiger Größe vor der Kondensation können dazu beitragen, mehr monodisperse Tröpfchenpopulationen zu erzeugen. Die Erzeugung monodisperser Vorläuferblasen ist jedoch ebenfalls schwierig, was kostspieligere Ansätze wie Mikrofluidik oder wiederholte differentielle Zentrifugationstechniken ^erfordert11. Ein alternativer Ansatz zur Herstellung von DFB- und OFB-Nanotröpfchen wurde kürzlich unter Verwendung der spontanen Keimbildung von Tröpfchen in Liposomen ^{veröffentlicht13}. Diese Methode, die einen “Ouzo” -Effekt verwendet, ist eine einfache Möglichkeit, PFC-Tröpfchen mit niedrigem Siedepunkt zu erzeugen, ohne Blasen kondensieren zu müssen. Die Größenverteilung der PFC-Tröpfchen kann durch delikate Titration und Mischen von PFC-, Lipid- und Ethanolkomponenten gesteuert werden, die zur Einleitung der Keimbildung der Tröpfchen verwendet werden. Es ist auch erwähnenswert, dass das Mischen von perfluorierten Kohlenwasserstoffen verwendet werden kann, um die Stabilität und die Aktivierungsschwellen von Nanotröpfchen zu ^{kontrollieren14,15}. Neuere Arbeiten von Shakya et al. zeigen, wie die Nanotröpfchenaktivierung durch Emulgieren von PFCs mit hohem Siedepunkt in einem Kohlenwasserstoff-Endoskelett abgestimmt werden kann, um die heterogene Keimbildung innerhalb des Tröpfchenkerns zu ^{erleichtern16}, was ein Ansatz ist, der zusammen mit anderen Formen der Tröpfchengrößenfiltration in Betracht gezogen werden kann.

Einmal gebildet, können Phasenverschiebungströpfchen nach der Bildung extrudiert werden, um mehr monodisperse Populationen zu erzeugen. Tatsächlich wurde ein ähnliches Protokoll wie die hier beschriebene Methode zuvor von Kopechek et ^al.17 unter Verwendung von Dodecofluorpentan (DDFP) mit hohem Siedepunkt als Tröpfchenkern veröffentlicht. Leser, die Phasenverschiebungströpfchen mit perfluorierten Kohlenwasserstoffen mit hohem Siedepunkt (stabil bei Raumtemperatur) verwenden möchten, sollten stattdessen auf den obigen Artikel verweisen. Das Erzeugen und Extrudieren von Tröpfchen mit Gasen mit niedrigem Siedepunkt wie DFB und OFP ist komplizierter und wird am besten durch Kondensieren von vorgeformten Gasblasen angegangen.

In diesem Protokoll wird eine gängige Methode zur Erzeugung von vorgeformten Lipid-Mikrobläschen mit einem DFB-Gaskern mittels Sondenspitzen-Beschallung beschrieben. Als nächstes wird ein kommerzieller Extruder verwendet, um vorgeformte Mikrobläschen zu Submikron-Phasenverschiebungs-Nanotröpfchen zu kondensieren (Abbildung 1). Die entstehenden Tröpfchen sind dann durch Hitze und Ultraschall aktierbar. Diese Methode kann größere Mengen an Nanotröpfchenlösung erzeugen als herkömmliche Kondensationsmethoden mit engeren Größenverteilungen, ohne dass teure mikrofluidische Geräte erforderlich sind. Die Herstellung von Nanotröpfchenlösungen mit engen Größenverteilungen kann wahrscheinlich gleichmäßigere Verdampfungsschwellen erzeugen. Dies wird ihr Potenzial für zahlreiche Anwendungen wie Bildgebung, Ablation, Arzneimittelabgabe und Embolisation maximieren1,3,4,6.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Hochdruck-Extrusionsaufbaus zur Kondensation von vorgeformten Mikrobläschen zu phasenverschobenen Nanotröpfchen. Mikrobläschenlösung wird in die Extruderkammer gegeben und in ihr enthalten, und 250 psi aus dem Stickstofftank werden durch das Kammereinlassventil aufgetragen. Das Stickstoffgas drückt die Mikrobläschenlösung durch den Filter an der Basis der Kammer und kondensiert die Probe zu Nanotröpfchen. Die Lösung wird schließlich durch das Probenauslassrohr aus dem Extruder geschoben und gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Lipidfilme herstellen Bereiten Sie Lipidfilme für die Mikrobläschenerzeugung mit 90% DSPC und 10% DSPE-PEG2K vor, indem Sie die Lipide im richtigen Verhältnis unter Verwendung der folgenden Anweisungen mischen: Herstellung von Stammlipiden aus DSPC und DSPE-PEG2K in Chloroform. Wiegen Sie 50 mg jedes Lipidpulvers in separaten Fläschchen. Geben Sie 1 ml Chloroform in jede Durchstechflasche mit einer 1 ml Glasspritze. Geben Sie 287 μL DSPC-Material und 113 μL DSPE-PEG2K-Material (beide…

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse der Größenverteilung sind unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung (DLS) und der abstimmbaren resistiven Pulserfassung (TRSP) enthalten. Abbildung 5 zeigt die Größenverteilung von kondensierten Blasenlösungen mit und ohne Extrusion. Ohne Extrusion endet das Protokoll bei Schritt 5.3. Die gekühlten Blasen werden kondensiert, indem die Probe kalt auf Atmosphärendruck entlüftet wird. Die kondensierte einzige Probe hat eine viel breitere Verteilung in der…

Discussion

Es steht eine umfassende Literatur zur Verfügung, die die Formulierung, Physik und mögliche Anwendungen von Mikrobläschen und Phasenverschiebungströpfchen für die In-vivo-Bildgebung und -Therapie diskutiert. Diese Diskussion bezieht sich explizit auf die Erzeugung von Lipid-Mikrobläschen und deren Umwandlung in Submikron-Phasenverschiebungströpfchen unter Verwendung eines DFB-Gases mit niedrigem Siedepunkt und einer Hochdruckextrusion. Die hier beschriebene Methode soll ein relativ einfaches Verfahren zur Herstell…

Materials

15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	–	–	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	–	–	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	–	–	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	–	–	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets