झिल्ली-फ़िल्टर्ड फेज-शिफ्ट Decafluorobutane Nanodroplets का उत्पादन Preformed Microbubbles से
Summary
यह प्रोटोकॉल जांच-टिप sonication का उपयोग करके लिपिड encapsulated decafluorobutane microbubbles की बड़ी मात्रा उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करता है और बाद में उच्च दबाव बाहर निकालना और यांत्रिक निस्पंदन का उपयोग करके उन्हें चरण-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट में संघनित करता है।
Abstract
कई तरीके हैं जिनका उपयोग इमेजिंग और थेरेपी के लिए वाष्पीकरणीय चरण-शिफ्ट बूंदों के उत्पादन के लिए किया जा सकता है। प्रत्येक विधि विभिन्न तकनीकों का उपयोग करती है और मूल्य, सामग्री और उद्देश्य में भिन्न होती है। इन निर्माण विधियों में से कई के परिणामस्वरूप गैर-समान सक्रियण थ्रेसहोल्ड के साथ पॉलीडिस्पर्स आबादी होती है। इसके अतिरिक्त, ड्रॉपलेट आकारों को नियंत्रित करने के लिए आमतौर पर उच्च सक्रियण थ्रेसहोल्ड के साथ स्थिर परफ्लोरोकार्बन तरल पदार्थ की आवश्यकता होती है जो विवो में व्यावहारिक नहीं हैं। कम-क्वथनांक गैसों का उपयोग करके एक समान बूंद आकार का उत्पादन विवो इमेजिंग और थेरेपी प्रयोगों में फायदेमंद होगा। यह आलेख आकार-फ़िल्टर किए गए लिपिड-स्थिर चरण-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट्स के गठन के लिए एक सरल और किफायती विधि का वर्णन करता है जिसमें कम-क्वथनांक डेकाफ्लोरोब्यूटेन (DFB) होता है। लिपिड माइक्रोबबल्स उत्पन्न करने की एक सामान्य विधि का वर्णन किया गया है, एक ही चरण में उच्च दबाव वाले एक्सट्रूज़न के साथ उन्हें संघनित करने की एक उपन्यास विधि के अलावा। इस विधि को समय बचाने, दक्षता को अधिकतम करने और कई जैविक प्रयोगशालाओं में पाए जाने वाले सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोबबल और नैनोड्रॉपलेट समाधानों की बड़ी मात्रा उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
Introduction
अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट (यूसीए) इमेजिंग और थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए लोकप्रियता में तेजी से बढ़ रहे हैं। Microbubbles, मूल यूसीए, वर्तमान में नैदानिक नैदानिक अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले मुख्यधारा के एजेंट हैं। माइक्रोबबल्स गैस से भरे गोले होते हैं, आमतौर पर व्यास में 1-10 μm, लिपिड, प्रोटीन या बहुलक गोले से घिरा होता है। हालांकि, उनका आकार और विवो स्थिरता में कई अनुप्रयोगों में उनकी कार्यक्षमता को सीमित कर सकते हैं। फेज-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट्स, जिसमें एक सुपरहीटेड तरल कोर होता है, अपने छोटे आकार और बेहतर परिसंचरण-जीवन 2 के कारण इनमें से कुछ सीमाओं को दूर कर सकता है। जब गर्मी या ध्वनिक ऊर्जा के संपर्क में आता है, तो सुपरहीटेड तरल कोर एक गैस माइक्रोबबल 2,3,4,5 बनाने के लिए वाष्पीकृत होता है। चूंकि वाष्पीकरण थ्रेशोल्ड सीधे बूंद आकार 5,6 से संबंधित है, इसलिए समान आकार के साथ ड्रॉपलेट निलंबन तैयार करना लगातार सक्रियण थ्रेसहोल्ड प्राप्त करने के लिए अत्यधिक वांछनीय होगा। एक समान बूंद आकार का उत्पादन करने वाले सूत्रीकरण विधियां अक्सर जटिल और महंगी होती हैं, जबकि अधिक लागत प्रभावी दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप पॉलीडिस्पर्स समाधान 7 होता है। एक अन्य सीमा कम-क्वथनांक perfluorocarbon (PFC) गैसों के साथ स्थिर चरण-शिफ्ट बूंदों को उत्पन्न करने की क्षमता है, जो vivo8 में कुशल सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है। इस पांडुलिपि में, विवो इमेजिंग और थेरेपी अनुप्रयोगों में स्थिर फ़िल्टर किए गए कम-क्वथनांक वाष्पीकरणीय चरण-शिफ्ट बूंदों को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
मोनोडिस्पर्स्ड सबमाइक्रोन फेज-शिफ्ट ड्रॉपलेट्स 7 के उत्पादन के कई तरीके हैं। आकार को नियंत्रित करने के सबसे मजबूत तरीकों में से एक माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग है। ये उपकरण महंगे हो सकते हैं, बूंद उत्पादन की धीमी दर (~ 104-106 बूंदों / एस) 7, और व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को आमतौर पर सिस्टम 7 के सहज वाष्पीकरण और क्लॉगिंग से बचने के लिए उच्च-क्वथनांक गैसों की आवश्यकता होती है। हालांकि, डी ग्रासिया लक्स एट अल.9 द्वारा हाल ही में किए गए एक अध्ययन से पता चलता है कि माइक्रोफ्लुइडाइज़र को ठंडा करने का उपयोग कम-क्वथनांक डेकाफ्लोरोब्यूटेन (डीएफबी) या ऑक्टाफ्लोरोप्रोपेन (ओएफपी) का उपयोग करके उप-माइक्रोन फेज-शिफ्ट (1010-1012 / एमएल) की उच्च सांद्रता उत्पन्न करने के लिए कैसे किया जा सकता है।
सामान्य तौर पर, कम क्वथनांक गैसों जैसे कि डीएफबी या ओएफपी को पूर्वनिर्मित गैस बुलबुले का उपयोग करके संभालना आसान होता है। Vaporizable बूंदों को अग्रदूत लिपिड-स्थिर बुलबुले से कम तापमान और ऊंचा दबाव 5,10 का उपयोग करके गैस को संघनित करके उत्पादित किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके उत्पादित बूंदों की एकाग्रता अग्रदूत माइक्रोबबल एकाग्रता और बूंदों में बुलबुले के रूपांतरण की दक्षता पर निर्भर करती है। केंद्रित microbubbles टिप sonication से 1010 MB / mL11 > आ रहा है से सूचित किया गया है, जबकि एक अलग अध्ययन में संघनित OFP और DFP बुलबुले 12 से ~ 1-3 x1011 बूंदों / mL से लेकर बूंद सांद्रता की सूचना दी गई है। जब मोनोडिस्पर्स्ड ड्रॉपलेट्स चिंता का विषय नहीं होते हैं, तो संक्षेपण विधियां कम-क्वथनांक PFCs का उपयोग करके लिपिड-स्थिर चरण-शिफ्ट बूंदों को उत्पन्न करने के सबसे सरल और सबसे कम लागत वाले तरीके हैं। संघनन से पहले समान आकार के बुलबुले उत्पन्न करने के तरीके बूंदों की अधिक मोनोडिस्पर्स आबादी बनाने में मदद कर सकते हैं। हालांकि, मोनोडिस्पर्स अग्रदूत बुलबुले उत्पन्न करना भी मुश्किल है, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक्स या दोहराए गए विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन तकनीकों जैसे अधिक महंगे दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। DFB और OFB nanodroplets के उत्पादन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हाल ही में liposomes13 में बूंदों के सहज न्यूक्लिएशन का उपयोग करके प्रकाशित किया गया है। यह विधि, एक “ओज़ो” प्रभाव का उपयोग करते हुए, बुलबुले को संघनित करने की आवश्यकता के बिना कम-क्वथनांक पीएफसी बूंदों को उत्पन्न करने का एक सरल तरीका है। पीएफसी बूंदों के आकार-वितरण को नाजुक अनुमापन द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है और पीएफसी, लिपिड और इथेनॉल घटकों को मिलाकर किया जा सकता है जो बूंदों के न्यूक्लिएशन को शुरू करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। यह भी ध्यान देने योग्य है कि परफ्लोरोकार्बन के मिश्रण का उपयोग नैनोड्रॉपलेट्स 14,15 की स्थिरता और सक्रियण थ्रेसहोल्ड को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है। शाक्य एट अल द्वारा हाल ही में किए गए काम से पता चलता है कि कैसे नैनोड्रॉपलेट सक्रियण को हाइड्रोकार्बन एंडोस्केलेटन के भीतर उच्च उबलते-बिंदु पीएफसी को इमल्सीफाइंग करके ट्यून किया जा सकता है ताकि ड्रॉपलेट कोर 16 के भीतर हेटरोजेनस न्यूक्लिएशन की सुविधा हो सके, जो एक ऐसा दृष्टिकोण है जिसे बूंद आकार निस्पंदन के अन्य रूपों के साथ माना जा सकता है।
एक बार बनने के बाद, अधिक मोनोडिस्पर्स आबादी बनाने के लिए गठन के बाद फेज-शिफ्ट बूंदों को बाहर निकाला जा सकता है। वास्तव में, यहां वर्णित विधि के समान प्रोटोकॉल को पहले कोपेचेक एट अल.17 द्वारा प्रकाशित किया गया है, जिसमें ड्रॉपलेट कोर के रूप में उच्च क्वथनांक डोडेकोफ्लोरपेंटेन (डीडीएफपी) का उपयोग किया गया है। उच्च-क्वथनांक perfluorocarbons (कमरे के तापमान पर स्थिर) के साथ चरण-शिफ्ट बूंदों का उपयोग करने की मांग करने वाले पाठकों को इसके बजाय ऊपर दिए गए लेख का संदर्भ देना चाहिए। कम उबलते बिंदु गैसों के साथ बूंदों को उत्पन्न करना और बाहर निकालना, जैसे कि डीएफबी और ओएफपी, अधिक जटिल है और पूर्वनिर्मित गैस बुलबुले को संघनित करके सबसे अच्छा संपर्क किया जाता है।
इस प्रोटोकॉल में, एक DFB गैस कोर के साथ preformed लिपिड microbubbles उत्पन्न करने की एक आम विधि जांच टिप sonication का उपयोग कर वर्णित है. इसके बाद, एक वाणिज्यिक extruder का उपयोग पूर्वनिर्मित माइक्रोबबल्स को सबमाइक्रोन फेज-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट्स (चित्रा 1) में संघनित करने के लिए किया जाता है। परिणामस्वरूप बूंदों तो गर्मी और अल्ट्रासाउंड द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. यह विधि महंगे माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की आवश्यकता के बिना संकीर्ण आकार-वितरण के साथ पारंपरिक संघनन विधियों की तुलना में नैनोड्रॉपलेट समाधान की बड़ी मात्रा का उत्पादन कर सकती है। संकीर्ण आकार के वितरण के साथ नैनोड्रॉपलेट समाधानों का उत्पादन संभवतः अधिक समान वाष्पीकरण थ्रेसहोल्ड उत्पन्न कर सकता है। यह इमेजिंग, एब्लेशन, दवा वितरण, और embolization1,3,4,6 जैसे कई अनुप्रयोगों के लिए उनकी क्षमता को अधिकतम करेगा।
चित्रा 1: चरण-शिफ्ट नैनोड्रॉपलेट्स में पूर्वनिर्मित माइक्रोबबल्स को संघनित करने के लिए उच्च दबाव एक्सट्रूज़न सेटअप की योजनाबद्ध। Microbubble समाधान के लिए जोड़ा जाता है और extruder कक्ष में निहित है, और 250 साई, नाइट्रोजन टैंक से, कक्ष इनलेट वाल्व के माध्यम से लागू किया जाता है। नाइट्रोजन गैस कक्ष के आधार पर फिल्टर के माध्यम से माइक्रोबबल समाधान को धक्का देगी, नमूने को नैनोड्रॉपलेट्स में संघनित करेगी। समाधान अंत में नमूना आउटलेट ट्यूब के माध्यम से extruder से बाहर धकेल दिया है और एकत्र किया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
साहित्य का एक व्यापक शरीर उपलब्ध है जो विवो इमेजिंग और थेरेपी में माइक्रोबबल्स और फेज-शिफ्ट बूंदों के निर्माण, भौतिकी और संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा करता है। यह चर्चा स्पष्ट रूप से लिपिड माइक्रोबबल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ केन होयट की प्रयोगशाला में डोमिनिक जेम्स को वाष्पीकरणीय चरण-शिफ्ट नैनोड्रोप्लेट्स के टीआरएसपी विश्लेषण प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं
Materials
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | – | – | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | – | – | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | – | – | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | – | – | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
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