إنتاج الأغشية المصفاة مرحلة التحول ديكافلوروبوتان Nanodroplets من الفقاعات الدقيقة مسبقة التشكيل
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد كميات كبيرة من الفقاعات الدقيقة المغلفة بالدهون decafluorobutane باستخدام سونيكيشن رأس المسبار وتكثيفها لاحقا في قطرات نانوية تحول المرحلة باستخدام البثق عالي الضغط والترشيح الميكانيكي.
Abstract
هناك العديد من الطرق التي يمكن استخدامها لإنتاج قطرات مرحلة التحول vaporizable للتصوير والعلاج. كل طريقة تستخدم تقنيات مختلفة وتختلف في السعر والمواد والغرض. العديد من هذه الأساليب تلفيق يؤدي إلى مجموعات متعددة التخصصات مع عتبات التنشيط غير موحدة. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب التحكم في أحجام القطرات عادة سوائل بيرفلوروكربون مستقرة مع عتبات تنشيط عالية غير عملية في الجسم الحي. إنتاج أحجام قطرات موحدة باستخدام غازات نقطة الغليان المنخفض سيكون مفيدا لتجارب التصوير والعلاج في الجسم الحي. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة واقتصادية لتشكيل القطرات النانوية المرحلية التي يتم تصفيتها بالدهون والمثبتة بالحجم مع ديكافلوروبوتان نقطة الغليان المنخفض (DFB). يتم وصف طريقة شائعة لتوليد الفقاعات الدقيقة الدهنية ، بالإضافة إلى طريقة جديدة لتكثيفها مع قذف الضغط العالي في خطوة واحدة. تم تصميم هذه الطريقة لتوفير الوقت، وتحقيق أقصى قدر من الكفاءة، وتوليد كميات أكبر من الفقاعات الصغيرة وحلول القطرات النانوية لمجموعة واسعة من التطبيقات باستخدام معدات المختبرات المشتركة الموجودة في العديد من المختبرات البيولوجية.
Introduction
وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية (UCAs) تنمو بسرعة في شعبية لتطبيقات التصوير والعلاج. الفقاعات الصغيرة ، وUCAs الأصلي ، هي حاليا العوامل الرئيسية المستخدمة في تطبيقات التشخيص السريري. الفقاعات الدقيقة هي مجالات مملوءة بالغاز ، وعادة ما يكون قطرها 1-10 ميكرومتر ، وتحيط بها الدهون أو البروتين أو قذائف البوليمر1. ومع ذلك، يمكن لحجمها واستقرارها في الجسم الحي الحد من وظائفها في العديد من التطبيقات. يمكن للقطرات النانوية المتحولة للمرحلة ، والتي تحتوي على نواة سائلة شديدة التسخين ، التغلب على بعض هذه القيود بسبب حجمها الأصغر وتحسين الدورة الدموية-life2. عندما تتعرض للحرارة أو الطاقة الصوتية، يتبخر اللب السائل المحموم لتشكيل ميكروبوببلة غاز2،3،4،5. وبما أن عتبة التبخير ترتبط مباشرة بحجم القطيرات 5،6، فإن صياغة تعليقات قطرات بحجم موحد ستكون مرغوبة للغاية لتحقيق عتبات تنشيط متسقة. وغالبا ما تكون طرق التركيب التي تنتج أحجام قطرات موحدة معقدة ومكلفة، في حين أن النهج الأكثر فعالية من حيث التكلفة تؤدي إلى حلول متعددة التخصصات7. وثمة قيد آخر هو القدرة على توليد قطرات مستقرة من مرحلة التحول مع غازات البيرفلوروكربون ذات نقطة الغليان المنخفضة ، وهو أمر بالغ الأهمية لتنشيط فعال في vivo8. في هذه المخطوطة، يتم وصف بروتوكول لتوليد قطرات تحويل مرحلي مستقرة قابلة للتبخير في تطبيقات التصوير والعلاج في الجسم الحي.
هناك العديد من الطرق لإنتاج قطرات المرحلة التحول submicron أحادية التشتت7. واحدة من أقوى الطرق للسيطرة على الحجم هو استخدام الأجهزة microfluidic. يمكن أن تكون هذه الأجهزة مكلفة ، ولها معدلات بطيئة لإنتاج القطيرات (~ 104-106 قطرات / ثانية)7 ، وتتطلب تدريبا مكثفا. تتطلب أجهزة Microfluidic أيضا غازات عالية الغليان لتجنب التبخير التلقائي وانسداد النظام7. ومع ذلك، توضح دراسة حديثة أجراها دي غراسيا لوكس وآخرون.9 كيف يمكن استخدام سائل التبريد الدقيق لتوليد تركيزات عالية من التحول المرحلي دون الميكرون (1010-1012/مل) باستخدام نقطة الغليان المنخفض ديكافلوروبوتان (DFB) أو الأوكتافلوروبران (OFP).
بشكل عام، تكون الغازات منخفضة الغليان مثل DFB أو OFP أسهل في التعامل معها باستخدام فقاعات الغاز مسبقة التكوين. يمكن إنتاج قطرات Vaporizable من فقاعات السلائف استقرت الدهون عن طريق تكثيف الغاز باستخدام درجات حرارة منخفضة وارتفاع pressure5,10. تركيز قطرات المنتجة باستخدام هذه الطريقة يعتمد على تركيز microbubble السلائف وكفاءة تحويل الفقاعات إلى قطرات. وقد تم الإبلاغ عن الفقاعات الدقيقة المركزة من سونيكيشن تلميح تقترب من > 1010 MB/mL11، في حين ذكرت دراسة منفصلة تركيزات قطرات تتراوح بين ~ 1-3 x1011 قطرات / مل من فقاعات OFP وDFP مكثف12. عندما لا تكون القطرات أحادية التشتت مصدر قلق ، فإن طرق التكثيف هي أكثر الطرق مباشرة وأقل تكلفة لتوليد قطرات تحول المرحلة المستقرة من الدهون باستخدام PFCs نقطة الغليان المنخفضة. ومع ذلك، فإن توليد فقاعات السلائف أحادية التشتت أمر صعب أيضا، حيث يتطلب اتباع نهج أكثر تكلفة مثل السوائل الدقيقة أو تقنيات الطرد المركزي التفاضلية المتكررة11. وقد تم مؤخرا نشر نهج بديل لإنتاج قطرات نانوية DFB و OFB باستخدام نواة عفوية من قطرات في liposomes13. هذه الطريقة ، وذلك باستخدام تأثير “Ouzo” ، هي طريقة بسيطة لتوليد قطرات PFC نقطة الغليان المنخفض دون الحاجة إلى تكثيف الفقاعات. يمكن التحكم في توزيع حجم قطرات PFC عن طريق المعايرة الدقيقة وخلط مكونات PFC والدهون والإيثانول المستخدمة لبدء نواة القطرات. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه يمكن استخدام خلط مركبات الكربون البيرفلورية للتحكم في الاستقرار وعتبات التنشيط للقطرات النانوية14,15. يوضح العمل الأحدث الذي قام به Shakya وآخرون كيف يمكن ضبط تنشيط القطرات النانوية عن طريق استحلاب مركبات الكربون المشبعة بالفلور عالية الغليان داخل الهيكل الخارجي الهيدروكربوني لتسهيل النوى غير المتجانسة داخل core16 القطيرات ، وهو نهج يمكن النظر فيه جنبا إلى جنب مع أشكال أخرى من ترشيح حجم القطيرات.
بمجرد تشكيلها ، يمكن قذف قطرات التحول المرحلي بعد التكوين لإنشاء المزيد من المجموعات السكانية الأحادية. في الواقع ، تم نشر بروتوكول مماثل للطريقة الموصوفة هنا سابقا من قبل Kopechek et al.17 باستخدام dodecofluorpentane نقطة الغليان العالية (DDFP) كجوهر قطرة. القراء الذين يسعون إلى استخدام قطرات المرحلة التحول مع نقطة الغليان العالي perfluorocarbons (مستقرة في درجة حرارة الغرفة) وينبغي الرجوع إلى المادة أعلاه بدلا من ذلك. توليد وقذف قطرات مع الغازات نقطة الغليان منخفضة، مثل DFB و OFP، هو أكثر تعقيدا وأفضل اقترب من خلال تكثيف فقاعات الغاز مسبقة التشكيل.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف طريقة شائعة لتوليد الفقاعات الدقيقة الدهنية مسبقة التشكيل مع نواة غاز DFB باستخدام صوتنة طرف المسبار. بعد ذلك ، يتم استخدام البثق التجاري لتكثيف الفقاعات الدقيقة مسبقة التشكيل في قطرات نانوية مرحلية submicron (الشكل 1). ثم يتم تنشيط القطرات الناتجة عن طريق الحرارة والموجات فوق الصوتية. يمكن أن تنتج هذه الطريقة كميات أكبر من محلول القطرات النانوية من طرق التكثيف التقليدية مع توزيعات حجم أضيق دون الحاجة إلى أجهزة ميكروفلويديك باهظة الثمن. ومن المرجح أن يؤدي إنتاج حلول القطرات النانوية ذات التوزيعات الضيقة الحجم إلى توليد عتبات تبخير أكثر اتساقا. وهذا من شأنه أن يزيد من إمكاناتها للعديد من التطبيقات مثل التصوير، والاجتثاث، وتسليم الأدوية، والانسداد1،3،4،6.
الشكل 1: تخطيطي لإعداد البثق عالي الضغط لتكثيف الفقاعات الدقيقة مسبقة التشكيل في قطرات نانوية تعمل بالمرحلة. يضاف محلول الفقاعات الصغيرة إلى غرفة البثق ويحتوى عليها، ويتم تطبيق 250 psi، من خزان النيتروجين، من خلال صمام مدخل الغرفة. سوف يدفع غاز النيتروجين محلول الفقاعات الدقيقة من خلال الفلتر في قاعدة الغرفة ، مما يكثف العينة إلى قطرات نانوية. يتم دفع الحل أخيرا من البثق من خلال أنبوب منفذ العينة وجمعها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتوفر مجموعة شاملة من الأدبيات التي تناقش التركيب والفيزياء والتطبيقات المحتملة للفقاعات الدقيقة وقطرات التحول المرحلي للتصوير والعلاج في الجسم الحي. تتعلق هذه المناقشة صراحة بتوليد الفقاعات الدقيقة الدهنية وتحويلها إلى قطرات تحول مرحلة دون ميكرون باستخدام غاز DFB منخفض الغليان والبثق …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر دومينيك جيمس في مختبر الدكتور كين هويت لتقديم تحليل TRSP للقطرات النانوية القابلة للتبخير في مرحلة التحول
Materials
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | – | – | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | – | – | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | – | – | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | – | – | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).
- Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).
- Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects. Scientifica. 2014, 579684 (2014).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).
- Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Wu, S. -. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Li, D. S., et al. Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents. Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting. Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).
- Shakya, G., et al. Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions. Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).
- Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).
