Önceden Biçimlendirilmiş Mikrobubbles'tan Membran Filtreli Faz KaydırmaLı Decafluorobutane Nanodroplets Üretimi
Summary
Bu protokol, prob ucu sonikasyonu kullanarak büyük hacimlerde lipid kapsüllenmiş decafluorobutane mikrobubbles üretme ve daha sonra yüksek basınçlı ekstrüzyon ve mekanik filtrasyon kullanarak faz kaydırma nanodropletlerine yoğuşma yöntemini açıklar.
Abstract
Görüntüleme ve tedavi için buharlaştırılabilir faz kayması damlacıklarının üretimi için kullanılabilecek birçok yöntem vardır. Her yöntem farklı teknikler kullanır ve fiyat, malzeme ve amaca göre değişir. Bu imalat yöntemlerinin çoğu, tekdüze olmayan aktivasyon eşiklerine sahip polidispers popülasyonlarla sonuçlanır. Ek olarak, damlacık boyutlarının kontrol altına getirilmesi tipik olarak pratik in vivo olmayan yüksek aktivasyon eşiklerine sahip kararlı perflorokarbon sıvılar gerektirir. Düşük kaynayan nokta gazları kullanarak tek tip damlacık boyutları üretmek in vivo görüntüleme ve terapi deneyleri için faydalı olacaktır. Bu makalede, düşük kaynama noktası decafluorobutane (DFB) ile boyut filtreli lipid stabilize faz kaydırma nanodropletlerinin oluşumu için basit ve ekonomik bir yöntem açıklanmaktadır. Lipid mikrobubbles oluşturmanın yaygın bir yöntemi, tek bir adımda yüksek basınçlı ekstrüzyon ile yoğuşma yeni bir yönteme ek olarak açıklanmaktadır. Bu yöntem, birçok biyolojik laboratuvarda bulunan ortak laboratuvar ekipmanlarını kullanarak çok çeşitli uygulamalar için zamandan tasarruf etmek, verimliliği en üst düzeye çıkarmak ve çok çeşitli uygulamalar için daha büyük hacimlerde mikrobubble ve nanodroplet çözümleri üretmek için tasarlanmıştır.
Introduction
Ultrason kontrast ajanları (UCAs) görüntüleme ve tedavi uygulamaları için popülaritesi hızla artmaktadır. Mikrobubbles, orijinal UCA’lar, şu anda klinik tanı uygulamalarında kullanılan ana akım ajanlardır. Mikrobubbles, genellikle 1-10 μm çapında, lipid, protein veya polimer kabuklarla çevrili gaz dolu kürelerdir1. Ancak, boyutları ve in vivo stabiliteleri birçok uygulamada işlevlerini sınırlayabilir. Aşırı ısınmış bir sıvı çekirdek içeren faz kaydırma nanodropletleri, daha küçük boyutları ve geliştirilmiş dolaşım ömrü nedeniyle bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelebilir2. Isıya veya akustik enerjiye maruz kaldığında, aşırı ısınmış sıvı çekirdek buharlaşarak gaz mikrobubble2,3,4,5 oluşturur. Buharlaşma eşiği damlacık boyutu5,6 ile doğrudan ilişkili olduğundan, tekdüze boyutta damlacık süspansiyonlarının formüle edilmesi tutarlı aktivasyon eşiklerine ulaşmak için son derece arzu edilir. Tek tip damlacık boyutları üreten formülasyon yöntemleri genellikle karmaşık ve maliyetlidir, daha uygun maliyetli yaklaşımlar ise polidisperse çözümleriyle sonuçlanır7. Diğer bir sınırlama, vivo8’de verimli aktivasyon için kritik olan düşük kaynama noktası perflorokarbon (PFC) gazları ile kararlı faz kayması damlacıkları üretme yeteneğidir. Bu yazıda, in vivo görüntüleme ve terapi uygulamaları için kararlı filtrelenmiş düşük kaynama noktası buharlaştırılabilir faz kayması damlacıkları üretmek için bir protokol açıklanmıştır.
Monodispersed altmikron faz-shift damlacıkları üretmenin birçok yöntemi vardır7. Boyutu kontrol etmenin en sağlam yöntemlerinden biri mikroakışkan cihazların kullanılmasıdır. Bu cihazlar maliyetli olabilir, yavaş damlacık üretim oranlarına (~104-106 damlacık/ s)7 sahip olabilir ve kapsamlı eğitim gerektirir. Mikroakışkan cihazlar ayrıca sistemin kendiliğinden buharlaşmasını ve tıkanmasını önlemek için genellikle yüksek kaynama noktası gazlarına ihtiyaç duyar7. Bununla birlikte, de Gracia Lux ve ark.9 tarafından yapılan yeni bir çalışma, bir mikrofloluidizatörin soğutulmasının, düşük kaynama noktası decafluorobutane (DFB) veya octafluoropropane (OFP) kullanarak yüksek konsantrasyonlarda mikron faz kayması (1010-1012/mL) üretmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Genel olarak, DFB veya OFP gibi düşük kaynayan nokta gazlarının önceden biçimlendirilmiş gaz kabarcıkları kullanılarak işlenmesi daha kolaydır. Buharlaştırılabilir damlacıklar, düşük sıcaklıklar ve yüksek basınç5,10 kullanılarak gazın yoğunlaşarak öncü lipid stabilize kabarcıklardan üretilebilir. Bu yöntem kullanılarak üretilen damlacıkların konsantrasyonu öncü mikrobubble konsantrasyonuna ve kabarcıkların damlacıklara dönüştürülmesinin verimliliğine bağlıdır. Konsantre mikrobubbles 1010 MB / mL11 > yaklaşan uç sonication bildirilmiştir, ayrı bir çalışma yoğunlaşmış OFP ve DFP kabarcıkları gelen ~1-3 x1011 damlacık / mL arasında değişen damlacık konsantrasyonları bildirilmiştir12. Monodispersed damlacıklar bir sorun olmadığında, yoğuşma yöntemleri, düşük kaynama noktası PFC’leri kullanarak lipid stabilize faz kaydırma damlacıkları üretmenin en basit ve en düşük maliyetli yöntemleridir. Yoğuşmadan önce tekdüze boyut kabarcıkları oluşturma yöntemleri, daha fazla monodisperse damlacık popülasyonu oluşturmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, monodisperse öncü kabarcıkları üretmek de zordur, mikroakışkanlar veya tekrarlanan diferansiyel santrifüj teknikleri gibi daha maliyetli yaklaşımlar gerektirir11. DFB ve OFB nanodroplets üretimine alternatif bir yaklaşım son zamanlarda lipozomlarda damlacıkların kendiliğinden çekirdeklenmesi kullanılarak yayınlanmıştır13. Bir “Uzo” etkisi kullanan bu yöntem, kabarcıkları yoğunlaştırarak ihtiyaç duymadan düşük kaynama noktası PFC damlacıkları üretmenin basit bir yoludur. PFC damlacıklarının boyut dağılımı, damlacıkların çekirdeklenmesini başlatmak için kullanılan hassas titrasyon ve PFC, lipid ve etanol bileşenlerinin karıştırılması ile kontrol edilebilir. Ayrıca, perflorokarbonların karıştırılmasının nanodropletlerin stabilitesini ve aktivasyon eşiklerini kontrol etmek için kullanılabileceğini belirtmek gerekir14,15. Shakya ve ark. tarafından yapılan daha yeni çalışmalar, damlacık çekirdeği içindeki heterojen çekirdeklenmeyi kolaylaştırmak için bir hidrokarbon endoskeleton içindeki yüksek kaynama noktası PFC’leri emülsifiye edilerek nanodroplet aktivasyonunun nasıl ayarlanabileceğini göstermektedir16, bu da diğer damlacık boyutu filtrasyon biçimleriyle birlikte düşünülebilecek bir yaklaşımdır.
Oluştuktan sonra, faz kayması damlacıkları oluşumdan sonra ekstrüde edilerek daha fazla monodispers popülasyonu oluşturulabilir. Aslında, burada açıklanan yönteme benzer bir protokol daha önce Kopechek ve ark.17 tarafından damlacık çekirdeği olarak yüksek kaynama noktası dodecofluorpentane (DDFP) kullanılarak yayımlanmıştır. Yüksek kaynama noktası perflorokarbonlu (oda sıcaklığında stabil) faz kaydırma damlacıkları kullanmak isteyen okuyucular bunun yerine yukarıdaki makaleye referans vermelidir. DFB ve OFP gibi düşük kaynama noktası gazları ile damlacık üretmek ve ekstrüde etmek daha karmaşıktır ve en iyi önceden biçimlendirilmiş gaz kabarcıklarının yoğunlaştırılmasıyla yaklaşılır.
Bu protokolde, prob ucu sonikasyonu kullanılarak DFB gaz çekirdeği ile önceden biçimlendirilmiş lipid mikrobubbles oluşturmanın yaygın bir yöntemi açıklanmıştır. Daha sonra, önceden biçimlendirilmiş mikrobubbles mikromikron faz kaydırma nanodroplets içine yoğuşmak için ticari bir ekstrüder kullanılır (Şekil 1). Elde edilen damlacıklar daha sonra ısı ve ultrason ile aktive edilebilir. Bu yöntem, pahalı mikroakışkan cihazlara ihtiyaç duymadan daha dar boyut dağılımlarına sahip geleneksel yoğuşma yöntemlerinden daha büyük miktarlarda nanodroplet çözeltisi üretebilir. Dar boyutlu dağılımlara sahip nanodroplet çözeltilerinin üretimi muhtemelen daha düzgün buharlaşma eşikleri oluşturabilir. Bu, görüntüleme, ablasyon, ilaç teslimi ve embolizasyon gibi çok sayıda uygulama için potansiyellerini en üst düzeye çıkaracaktır1,3,4,6.
Şekil 1: Önceden biçimlendirilmiş mikrobubbles faz kaydırma nanodropletler içine yoğuşmak için yüksek basınçlı ekstrüzyon kurulumu şeması. Mikrobubble çözeltisi ekstrüder odasına eklenir ve bulunur ve azot tankından 250 psi, oda giriş vanasından uygulanır. Azot gazı, mikrobubble çözeltisini odanın tabanındaki filtreden geçirerek numuneyi nano damlacıklara yoğunlayacaktır. Çözelti sonunda numune çıkış tüpünden ekstrüder dışına itilir ve toplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vivo görüntüleme ve tedavi için mikrobubbles ve faz kaydırma damlacıklarının formülasyon, fizik ve potansiyel uygulamalarını tartışan kapsamlı bir literatür gövdesi mevcuttur. Bu tartışma açıkça lipid mikrobubbles üretmek ve düşük kaynama noktası DFB gaz ve yüksek basınç ekstrüzyon kullanarak mikron altı faz kaydırma damlacıkları dönüştürmekle ilgili. Burada özetlenen yöntem, önceki mikrobubble yoğuşma yöntemlerini tek bir adımda damlacık ekstrüzyonu ile birleştirerek büy?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Ken Hoyt’un laboratuvarındaki Dominique James’e buharlaştırılabilir faz kaydırma nanodropletlerinin TRSP analizini sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | – | – | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | – | – | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | – | – | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | – | – | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).
- Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).
- Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects. Scientifica. 2014, 579684 (2014).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).
- Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Wu, S. -. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Li, D. S., et al. Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents. Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting. Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).
- Shakya, G., et al. Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions. Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).
- Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).
