Summary
이 프로토콜은 프로브 팁 초음파 처리를 사용하여 대용량 지질 캡슐화된 데파플루오로부탄 마이크로버블을 생성하고 고압 압출 및 기계적 여과를 사용하여 위상 시프트 나노 방울로 응축시키는 방법을 설명합니다.
Abstract
화상 진찰 및 치료를 위한 vaporizable 상 시프트 물방울의 생산을 위해 이용될 수 있는 많은 방법이 있습니다. 각 방법은 서로 다른 기술을 활용하고 가격, 재료 및 목적에 따라 다릅니다. 이러한 제조 방법의 대부분은 균일하지 않은 활성화 임계값을 가진 다분산 인구를 초래합니다. 또한, 액적 크기를 제어하려면 일반적으로 생체 내에서 실용적이지 않은 높은 활성화 임계값을 가진 안정적인 퍼플루오로카본 액체가 필요합니다. 낮은 비등점 가스를 사용하여 균일 한 방울 크기를 생산하는 것은 생체 이미징 및 치료 실험에 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 저등점 데아플루오로부탄(DFB)을 이용한 크기 여과된 지질 안정화 위상 시프트 나노방울의 형성을 위한 간단하고 경제적인 방법을 설명합니다. 지질 마이크로 버블을 생성하는 일반적인 방법은 단일 단계에서 고압 압출로 응축하는 새로운 방법 외에도 설명됩니다. 이 방법은 많은 생물학적 실험실에서 발견되는 일반적인 실험실 장비를 사용하여 다양한 응용 분야에 대해 시간을 절약하고 효율성을 극대화하며 더 많은 양의 마이크로 버블 및 나노 드롭렛 솔루션을 생성하도록 설계되었습니다.
Introduction
초음파 조영제 (UCA)는 이미징 및 치료 응용 프로그램에 대한 인기가 급속히 증가하고 있습니다. 마이크로 버블, 원래 UCA, 현재 임상 진단 응용 프로그램에 사용되는 주류 에이전트입니다. 마이크로버블은 지질, 단백질 또는 폴리머 껍질1로 둘러싸인 직경 1-10 μm의 가스 로 채워진 구체입니다. 그러나 크기와 생체 내 안정성은 많은 응용 프로그램에서 기능을 제한할 수 있습니다. 과열된 액체 코어를 포함하는 위상 이동 나노 방울은 크기가 작고 순환 생활이 향상되어 이러한 제한 사항 중 일부를 극복 할 수 있습니다2. 열 또는 음향 에너지에 노출되면 과열된 액체 코어가 기화하여 가스 마이크로버블2,3,4,5를 형성합니다. 기화 임계값은 액적 크기5,6과 직접 관련이 있기 때문에 균일한 크기로 액적 현탁액을 공식화하는 것이 일관된 활성화 임계값을 달성하는 데 매우 바람직할 것입니다. 균일한 액적 크기를 생성하는 제형 방법은 종종 복잡하고 비용이 많이 드는 반면, 비용 효율적인 접근 방식은 다분산 솔루션7을 초래합니다. 또 다른 제한은 생체 내에서 효율적인 활성화에 매우 중요한 낮은 비등점 퍼플루오로카본(PFC) 가스로 안정적인 위상 시프트 방울을 생성하는 기능입니다. 이 원고에서, 프로토콜은 생체 내 이미징 및 치료 응용 을 위한 안정적인 여과 된 낮은 비등점 기발성 위상 이동 방울을 생성하기 위한 설명이다.
모노분산 서브미칸 위상 시프트 액적7을 생성하는 많은 방법이 있습니다. 크기를 제어하는 가장 강력한 방법 중 하나는 미세 유체 장치의 사용입니다. 이러한 장치는 비용이 많이 들 수 있으며, 물방울 생산 속도가 느려지며(~104-106방울/s)7이 필요하며 광범위한 교육이 필요합니다. 미세 유체 장치는 또한 일반적으로 시스템의 자발적인 기화 및 막힘을 피하기 위해 고비등점 가스가 필요합니다7. 그러나, de Gracia Lux et al.9에 의한 최근 연구는 저등점 decafluorobutane (DFB) 또는 옥타플루오로프로판 (OFP)를 사용하여 저조미크론 위상 시프트 (1010-1012/mL)의 고농도를 생성하는 데 미세 유체제를 냉각하는 방법을 보여줍니다.
일반적으로 DFB 또는 OFP와 같은 저등점 가스는 미리 형성된 가스 기포를 사용하여 취급하기가 더 쉽습니다. 증발성 물방울은 저온 및 고압5,10을 사용하여 가스를 응축시킴으로써 전구체 지질 안정화 기포로부터 생성될 수 있다. 이 방법을 사용하여 생산된 액적의 농도는 전구체 마이크로 버블 농도 및 방울로 의 기포 변환의 효율에 따라 달라집니다. 농축 마이크로 버블은 1010 MB /mL11 >에 접근하는 팁 초음파 처리에서 보고되었으며, 별도의 연구는 응축 된 OFP 및 DFP 거품12에서 ~ 1-3 x1011 방울 / mL에 이르는 방울 농도를보고했습니다. 단일 분산 된 액적문제가 우려되지 않는 경우 응축 방법은 낮은 비등점 PFC를 사용하여 지질 안정화 위상 시프트 액적을 생성하는 가장 간단하고 저렴한 방법입니다. 그러나, 단일분산 전구체 기포를 생성하는 것도 어렵기 때문에 미세유체또는 반복된 차동 원심분리기와 같은 비용이 많이 드는 접근법이 필요하다11. DFB와 OFB 나노방울을 생산하는 대체 접근법은 최근 리포솜13에 있는 물방울의 자발적인 핵을 사용하여 간행되었습니다. 이 방법은 "Ouzo" 효과를 활용하여 거품을 응축할 필요 없이 낮은 비등점 PFC 방울을 생성하는 간단한 방법입니다. PFC 액적의 크기 분포는 액적의 핵을 시작하는 데 사용되는 PFC, 지질 및 에탄올 성분을 섬세한 적정 및 혼합하여 제어할 수 있습니다. 또한 퍼플루오로카본의 혼합은 나노방울14,15의 안정성 과 활성화 임계값을 제어하는 데 사용될 수 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다. Shakya 외.에 의한 최신 연구는 탄화수소 내골격 내에서 높은 비등점 PFC를 유화하여 나노 방울 활성화가 다른 형태의 액적 크기 여과와 함께 고려될 수 있는 접근법인 액적 코어16 내에서 이종성 핵화를 용이하게 함으로써 어떻게 조정할 수 있는지를 보여줍니다.
일단 형성되면, 위상 이동 액적더는 더 많은 단일 분산 인구를 만들기 위해 형성 후 압출 될 수있다. 실제로, 여기서 설명된 방법과 유사한 프로토콜은 코모펙 외.17 에 의해 이전에 공표되어 높은 비등점 도데코플루오펜타네(DDFP)를 액적 코어로 사용하였다. 높은 비등점 퍼플루오로카본 (실온에서 안정)과 위상 시프트 방울을 사용하고자하는 독자는 대신 위의 기사를 참조해야합니다. DFB 및 OFP와 같이 낮은 비등점 가스로 물방울을 생성하고 압출하는 것이 더 복잡하며 미리 형성된 가스 기포를 응축하여 접근하는 것이 가장 좋습니다.
본 프로토콜에서, 프로브 팁 초음파 처리를 사용하여 DFB 가스 코어로 미리 형성된 지질 마이크로버블을 생성하는 일반적인 방법이 설명된다. 다음으로, 상업용 압출기는 전형 마이크로버블을 서브미칸 위상 시프트 나노방울로 응축하는 데 사용된다(도 1). 결과 물방울은 열과 초음파에 의해 활성화됩니다. 이 방법은 고가의 미세 유체 장치 없이는 크기 분포가 좁은 기존 응축 방법보다 더 많은 양의 나노 드롭렛 솔루션을 생성할 수 있습니다. 크기 분포가 좁은 나노 드롭렛 솔루션의 생산은 더 균일한 기화 임계값을 생성할 수 있습니다. 이것은 화상 진찰, 절제, 약 납품 및 색전화1,3,4,6와 같은 수많은 응용에 대한 그들의 잠재력을 최대화할 것입니다.
그림 1: 전형성 마이크로버블을 위상 시프트 나노방울로 응축하기 위한 고압 압출 설정의 회로도. 마이크로버블 용액은 압출기 챔버에 첨가되고 함유되고, 질소 탱크로부터 250psi가 챔버 입구 밸브를 통해 가적용됩니다. 질소 가스는 챔버의 기저에 있는 필터를 통해 마이크로버블 용액을 밀어 내고 샘플을 나노방울로 응축합니다. 용액은 마침내 샘플 콘센트 튜브를 통해 압출기에서 밀려 나서 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 지질 필름 만들기
- 다음 방향을 사용하여 올바른 비율로 지질을 혼합하여 90% DSPC 및 10% DSPE-PEG2K를 사용하여 마이크로버블 생성을 위한 지질 필름을 준비합니다.
- 클로로폼으로 DSPC 및 DSPE-PEG2K의 스톡 지질을 만듭니다. 무게 50 별도의 바이알각 지질 분말의 mg. 1mL 유리 주사기를 사용하여 각 유리병에 1mL의 클로로폼을 추가합니다.
- DSPC 재고 287 μL과 DSPE-PEG2K 스톡 113 μL(모두 50 mg/mL)을 유리 주사기를 사용하여 20mL 의 진동 바이알에 넣습니다.
- 혼합 지질을 건조하여 질소를 사용하여 클로로포형을 제거합니다. 집 질소에 연결된 튜브의 적절한 길이를 사용하여 혼합하는 동안 유리병의 헤드 스페이스 에 질소 가스를 가볍게 흐르게합니다. 클로로폼이 관찰되지 않고 나머지 지질 필름이 흰색으로 바뀌기 시작할 때까지 계속합니다. 폴리 프로필렌 나사 캡을 사용하여 헤드 스페이스에 질소를 도입하면서 샘플을 덮습니다.
- 진공 건조기를 사용하여 하룻밤 동안 진공 밑에 바이알을 놓아 잔류 클로로폼을 제거하십시오. 바이알 의 바닥을 코팅 얇은 반투명 필름남아있을 것입니다.
- 필요할 때까지 바이알을 -20°C로 보관하십시오.
2. 지질 필름에서 마이크로 버블 생성
- 마이크로 버블을 만들려면, 1x 인산염 완충식염식염수(PBS)의 10mL를 20% v/v 프로필렌 글리콜과 20% v/v 글리세롤(최종 pH 7.2-7.4)을 드라이 지질 필름에 넣습니다.
- 시료를 65°C로 다시 캡하여 가열 블록(또는 가열된 수조)에서 30분 동안 다시 채장합니다.
- 시료가 온난화되는 동안 목욕 온도를 65°C로 늘려 목욕 초음파 처리기를 준비합니다.
참고: 욕조 초음파 처리기에 넣기 전에 전자레인지 나 핫플레이트에서 물이 예열된 경우이 과정이 빠릅니다. - 지질용액을 함유한 유리병의 일부만 수조에 침수되도록 목욕 초음파 처리기에서 따뜻한 시료를 함유한 신경병바이알을 놓는다.
- 따뜻한 지질 용액을 최소 15분 동안 초음파 처리합니다. 수온이 65°C로 유지되는지 확인합니다. 솔루션이 완전히 명확해질 때까지 10-15분 간격으로 초음파 처리를 계속합니다(그림 2).
참고: 목욕 초음파 처리기를 사용할 수 없는 경우 솔루션이 10%의 전력으로 초음파 처리될 수 있습니다. 그러나 마이크로 팁은 더 빨리 마모되고 교체비용이 더 비쌉습니다.
그림 2: 수화 지질 필름의 예. 목욕 초음파 처리 전후 (B) 수화 지질 필름 (A)의 예는 유니 라멜라 소포를 형성한다. 목욕 초음파 처리 후, 지질 용액은 반투명 솔루션에 더 불투명에서 이동해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 여전히 따뜻한 동안 캡을 제거하고 초음파 처리기의 방음 인클로저에 유리병을 고정하여 초음파 처리기의 마이크로 팁 부착이 공기 / 액체 인터페이스 바로 아래에 잠급니다 (그림 3).
- 초음파 처리기의 방음 인클로저 옆에 데카플루오로부탄 탱크를 놓습니다.
- 얼음 목욕을 준비하고 방음 인클로저 옆에 놓습니다. 이 단계는 2.14 단계에서 나중에 사용됩니다.
- 초음파 처리기의 전원 스위치를 켭니다.
- 시스템이 시작된 후 전원 레벨을 70%로 설정합니다. 마이크로팁 부착물로 진폭70%를 초과하지 마십시오. 이 시간에 초음파 처리기를 시작하지 마십시오.
- DFB 탱크 콘센트에서 인클로저에 보관된 따뜻한 지질 용액으로 가스를 안내하기 위해 적절한 튜브 길이를 부착합니다. 튜브는 초음파 처리 중에 가스가 헤드 스페이스로 흐를 수 있도록 유리병의 목에 배치해야합니다 (그림 3).
- 가스가 지질 용액 위로 흐르는 것을 볼 수있을 때까지 탱크 밸브를 천천히 엽니 다. 이것은 액체의 표면에 약간의 파문을 일으킬 것입니다. 가스 흐름이 너무 높으면 마이크로 버블 제형 중에 용액이 오버플로됩니다.
- 초음파 처리기를 시작하고 마이크로 버블을 생성하기 위해 10 s 연속 실행합니다. 초음파 처리 중에 거품 솔루션이 오버플로되기 시작하면 초음파 처리기를 즉시 중지하십시오.
- 초음파 처리기를 끄고 DFB 탱크 밸브를 즉시 닫습니다.
- 마이크로 버블 용액을 빠르게 캡하고 얼음 욕조에 유리병을 잠그면 55 °C 이하의 샘플을 냉각시 (DSPC의 유리 전이 온도)
- 필요한 때까지 마이크로 버블 샘플을 얼음 욕조에 둡니다.
그림 3: 마이크로 버블 형성을 최적화하기 위해 지질 용액에 프로브 팁을 배치합니다. 프로브의 끝이 유리를 만지지 않도록주의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 마이크로 버블 응축용 압출기 준비
- 200nm 세라믹 필터(제조업체에서 공급)를 사용하여 사용자 설명서에 자세히 설명된 대로 고압 압출기조립합니다.
- 방수 용기의 중앙에 압출기배치하여 샘플 콘센트 튜브가 측면에 대해 누르거나 압착되지 않도록 합니다.
- 제조 자가 공급 한 어댑터를 사용하여 압출기를 질소 가스 탱크에 결합하십시오.
- 400mL의 물과 10g의 염화 나트륨을 사용하여 압출기 주변의 방수 용기에 -2 °C 소금에 절인 얼음 목욕을하십시오.
- 압출 된 샘플을 수집하기 위해 출구 튜브의 끝을 신경병 바이알에 놓습니다.
참고: 평평하게 놓이지 않거나 유리병 내에 머무르지 않으면 테이프로 용기에 튜브를 고정합니다.
4. 마이크로 버블 응축용 압출기 프라이밍
- 방출 밸브를 열고 닫아 압출기 내에 압력이 없는지 확인합니다.
- 챔버 뚜껑을 제거하고 압출기 챔버에 1x PBS의 5 mL을 추가합니다.
- 뚜껑을 교체하여 안전하게 다시 제자리에 고정되도록 합니다.
- 압력 게이지가 250 psi를 읽을 수 있도록 질소 가스 탱크를 엽니 다. 압력 제어 밸브가 닫힌 위치에 있는지 확인합니다.
- 가스 탱크를 닫고 압출기 챔버 입구 밸브를 엽니다. PBS 용액은 시스템을 통해 밀어내고 샘플 출구 튜브를 신자극 유리병으로 밀어 넣을 것입니다.
- 가스만 튜브를 빠져나갈 때, 방출 밸브를 열고 압력이 0 psi로 떨어질 수 있도록 합니다.
- 반짝이 유리병을 제거합니다.
5. 압출을 위한 사전 냉각 마이크로 버블
- 방출 밸브를 열고 닫아 압출기 내에 압력이 없는지 확인합니다. 콘센트 튜브 의 끝에 새로운 반짝이는 유리병을 놓습니다.
- 2-메틸 부탄으로 강철 용기를 채우고 드라이 아이스를 추가하여 온도를 -18 °C로 끌어 올립니다.
- 차가운 2-메틸 부탄에 마이크로 버블 용액을 삽입하여 샘플을 2 분 동안 잠수하십시오. 2분 내내 반짝이는 유리병을 움직여 거품을 부드럽게 섞습니다. -15에서 -18 °C 사이의 온도를 유지하기 위해 필요에 따라 드라이 아이스를 추가합니다. -20°C를 초과하거나 부형제용이 동결및 파괴되지 않도록 주의하십시오.
참고: 단계 5.2 및 5.3은 더 오랜 기간 동안 실험실 냉동고에서 버블 샘플을 냉각하여 수행할 수도 있습니다. 그러나 냉동고의 온도를 주의 깊게 모니터링하고 시료를 동결하지 않도록주의해야 합니다. - 2 분 후, 차가운 2 메틸 부탄에서 마이크로 버블을 제거하고 유리병을 부드럽게 흔들어 마이크로 버블을 혼합하고 냉각 된 10 mL 주사기를 사용하여 용액을 압출기로 옮춥니다.
- 압출기 챔버 뚜껑을 제거하고 주사기의 플런저를 천천히 밀어 챔버에 마이크로 버블 용액을 추가합니다. 압출기 캡을 교체하여 안전하게 다시 제자리에 클릭합니다.
- 압출기의 압력 제어 밸브와 방출 밸브가 닫힌 위치에 있는지 확인합니다.
- 압력 게이지가 250 psi를 읽을 때까지 질소 가스 탱크를 열고 가스 탱크를 닫고 압력 제어 밸브를 열린 위치로 돌립니다.
- 용액이 출구 튜브에서 신경병 유리병을 채우고 가스만 튜브를 빠져나가는 경우 압력 방출 밸브를 천천히 열고 압력이 0 psi로 떨어질 수 있습니다.
- 반짝이는 유리병을 얼음 욕조 나 냉장고에 넣어 보관하십시오.
- 장기 저장 및 자발적기화를 최소화하기 위해 샘플을 표준 냉동고에 보관하십시오. 시료를 동결하지 않도록 온도가 -20°C 이상인지 확인하십시오(20% PPG 및 20% 글리세롤의 부형제용은 대부분의 실험실 냉동고에서 샘플을 동결하지 못하게 합니다).
6. 리포솜에서 원심분리로 방울을 분리
- 압출 된 액적 액액의 10 mL을 15 mL 원심분리기 튜브로 옮기십시오.
- 4°C에서 10분 동안 1,500 x g 의 압출 된 샘플을 원심 분리합니다. DFB 나노 방울로 구성된 펠릿은 튜브의 바닥에 명백합니다 (도 4). 자발적으로 기화 된 물방울은 솔루션의 상단에 나타나고 폐기해야합니다.
그림 4: 원심 분리 후 위상 이동 DFB 물방울 펠릿의 예. DFB 나노 방울은 리포솜보다 밀도가 높으며 펠릿(빨간색 상자)에서 원심분리기 튜브의 바닥에서 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 상체를 제거하고 20 % 글리세롤과 20 % 프로필렌 글리콜로 1 x PBS의 2 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
- 튜브를 부드럽게 섞어 균일한 용액을 얻고 작은 2mL 원심분리기 튜브로 방울을 옮기습니다.
- 2mL 원심분리기 튜브에서 2회 더 세척하십시오.
- 마지막 세척 후, 펠릿을 1x PBS 100 μL에 20% 글리세롤과 20% 프로필렌 글리콜로 재차판으로 재차 판하고 필요할 때까지 얼음이나 냉동실에 보관하십시오.
7. 액적 기화의 현미경 검사
- 농축 된 물방울의 2.5 μl을 1 x PBS의 7.5 μl에 추가하여 희석 된 액적 용액을 만듭니다.
- 희석된 시료의 10μl로 현미경 슬라이드를 준비합니다. 40배 의 목표를 사용하여 샘플을 관찰하고 이미지를 저장합니다.
- 현미경에서 슬라이드를 제거하고 마이크로 버블로 나노 방울을 기화하기 위해 1 분 동안 65 °C 열판에 놓습니다.
- 동일한 40배 의 목표를 사용하여 가열 후 샘플을 관찰하여 액적 기화를 확인합니다.
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Representative Results
크기 분포의 대표적인 결과는 동적 광 산란(DLS) 및 튜닝 가능한 저항 펄스 감지(TRSP) 분석을 사용하여 포함됩니다. 도 5는 압출 유무에 관계없이 응축된 버블 솔루션의 크기 분포를 나타낸다. 압출없이 프로토콜은 5.3 단계에서 끝납니다. 차가운 거품은 차가운 동안 대기압에 샘플을 배출하여 응축된다. 응축된 샘플만 400nm 에 가까운 훨씬 더 넓은 분포를 가지고 있습니다. 압출된 샘플은 200nm를 중심으로 분포가 좁습니다. 두 샘플 모두 DLS를 사용하여 식별할 수 없는 리포솜과 물방울을 모두 포함합니다. 도 6은 원심분리에 의해 세척된 후 위상 시프트 액적의 대표적인 샘플을 나타내며 과도한 리포솜(6.7단계)을 제거한다. TRPS는 이 분석에 사용되어 방울의 크기 분포와 농도를 단독으로 평가했습니다. DLS와 마찬가지로 TRPS는 200nm 근처의 액적 크기를 보여줍니다. 농도범위는 1mL의 최종 액적 용액 100 μL을 모두 재연한 후 mL당 1011-1012 방울 사이입니다. TRPS 데이터는 샘플당 평균 3개의 측정값입니다.
도 7은 가열시 나노방울 기화의 대표적인 현미경 데이터를 나타낸다. 도 7A (기화 전)에서 일부 마이크로버블은 시야(흰색 화살표)에서 명백합니다. 이는 현미경 슬라이드가 실내 온도에서 준비되고 이미지화됨에 따라 과열된 나노방울의 자발적인 기화 때문입니다. 가열 후 큰 마이크로 버블이 관찰됩니다(그림 7B). 여기서 데이터는 기화 직후의 거품을 캡처하지 않습니다. 기화 후 거품의 결합이 다시 이미지화될 수 있습니다. 이 전략은 TRPS 크기 조정 또는 생체 내에서 사용하기 전에 나노 방울의 존재를 확인하는 데 유용합니다.
응축 전에 기포를 냉각하는 것은 액적 수율을 최대화하는 중요한 단계입니다. 도 8 은 냉각이 수행되지 않을 때 기화 후 액적의 대표적인 이미지를 나타내며(도 8A), 압출기는 0°C로 냉각되지만 마이크로버블은 -18°C(도 8B)로 냉각되지 않으며 프로토콜을 정확하게 따를 때(도 8C).
이 프로토콜은 또한 저등점 OFP 거품을 응축시키기 위해 작성된 대로 구현되었습니다. 도 9 에서는 열로부터 기화 전후의 OFP 물방울의 대표적인 이미지를 나타낸다. DFB 물방울과 마찬가지로, 상당한 양의 유착은 가열 후 가능성이 높습니다. 따라서, 기포 크기는 기화 시 초기 물방울 또는 거품을 대표하지 않을 가능성이 있다. 펠릿및현미경검사는 OFP 물방울의 위상 이동의 존재와 활성을 확인한다.
그림 5: 액적 현탁액을 (단선)과 비교하고(파선) 압출을 비교하는 동적 광 산란 데이터. 샘플은 DLS 광 산란 시스템을 사용하여 응축 및 압출 직후측정하였다. 여기에 표시된 데이터는 샘플당 평균 세 가지 측정값입니다. 분석은 세척 전에 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: TRPS 분석에서 크기 여과 된 데바플루오로부탄 방울의 크기 분포. 데이터는 단일 샘플에서 평균 세 가지 측정에서 나온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 기화 전후의 위상 시프트 데아플루오로부탄 방울의 예미세 현미경 이미지. (A) 일부 기포는 기화 전에 관찰될 수 있으며, 이는 낮은 비등점 DFB 방울을 기포로 자발적으로 기화하기 때문일 가능성이 있다(실온에서 수행된 현미경 검사법). (B) 가열 후 마이크로버블의 현저한 증가가 관찰된다. 스케일 바는 10 μm 입니다.
그림 8: 다양한 온도에서 응축된 위상 시프트 방울의 기화 에 따른 예 현미경 이미지. (A) 마이크로버블은 사전 냉각 없이 압출기에 직접 삽입된다. (B) 압출기는 얼음 욕조에서 0°C로 냉각되고 마이크로버블은 챔버에 삽입되어 2분 동안 평형화할 수 있습니다. (C) 압출기는 얼음 욕조에서 0°C로 냉각되고 마이크로버블은 압출기에 배치되기 전에 2분 동안 -18°C로 예냉각된다. 미리 냉각된 마이크로버블은 일반적으로 크기가 작고 물방울의 수율이 높습니다. 스케일 바는 10 μm 입니다.
그림 9: 예시 현미경 이미지 단계-시프트 옥포플루오프로판 액방울기 전후기. 스케일 바는 10 μm 입니다.
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Discussion
생체 내 이미징 및 치료를 위한 마이크로 버블 및 위상 시프트 물방울의 제형, 물리학 및 잠재적인 응용 분야에 대해 설명하는 포괄적인 문헌 본문이 있습니다. 이 토론은 지질 마이크로 버블을 생성하고 낮은 비등점 DFB 가스 및 고압 압출을 사용하여 하위 미크로른 위상 이동 방울로 변환하는 데 명시적으로 관련됩니다. 여기에 설명된 방법은 이전 마이크로버블 응축 방법을 한 단계로 결합하여 다량의 지질 마이크로버블 및 DFB 위상 이동 액적을 생산하는 비교적 간단한 방법을 제공하기 위한 것이다. 이 방법은 필터 선택에 따라 좁은 크기 분포로 DFB 액적을 형성하는 데 사용되는 고농도의 거품을 생성하는 장점이 있습니다. 좁은 크기 분포는 일관된 샘플 기화 임계값으로 인해 중요합니다. 이 방법은 좁은 크기 분포를 생성하는 데 사용되는 다른 일반적인 방법보다 더 간단하고 비용이 적게 듭니다. 또한 솔루션의 잠재적 볼륨은 다른 유사한 방법보다 큽습니다. 프로토콜은 세 가지 주요 범주로 분리 될 수있다: (1) 지질 마이크로 버블생성, (2) 응축 및 압출 마이크로 버블, (3) 원심 분리에 의해 리포솜에서 위상 시프트 액적을 분리.
프로브 팁 초음파 처리를 사용하여 마이크로 버블 생성은 지질 마이크로 버블을 만드는 일반적인 방법 중 하나입니다. 이 절차를 설명하는 많은 간행물이 있습니다. 이 프로토콜은 Feshitan et al.11 에서 적용되며 벤치 탑 압출기의 최대 용량인 마이크로 버블 용액 10mL를 만들기 위해 최적화되었습니다. 이 방법은 또한 Feshitan et al11에 의해 입증된 바와 같이 마이크로팁 부착물을 제거하고 지질 용액 부피를 100mL 이상으로 증가시킴으로써 더 많은 양의 지질 마이크로버블 용액을 생성하도록 확장될 수 있다. 마찬가지로 100mL에서 800mL까지 의 볼륨을 수용할 수 있는 대형 상업용 압출기를 사용하여 증가된 마이크로버블 볼륨을 수용할 수 있으므로 액적 생산을 극대화할 수 있습니다. 이 방법의 결과는 사용되는 장비에 의해서만 제한되며, 이에 따라 부피를 증가시키기 위해 수정할 수 있습니다. 크기 필터링 된 물방울 생산은 더 균일 한 기화 임계값으로 인해 다양한 응용 프로그램에 유용합니다. 프로토콜에 대한 향후 수정은 항체 로딩 및 분자 표적화를 위한 마이크로버블 및 액적 쉘의 기능화와 같은 특정 요구에 대한 결과를 개별화하기 위해 이루어질 수 있다.
여기서 사용되는 압출 방법은 일반적으로 단일 분산 리포솜 제제에 사용됩니다. 유사한 방법은 또한 더 높은 비등점 DDFP 방울17을 사용하여 위상 시프트 방울을 생성하기 위해 과거에 사용되었습니다. 이 설명된 방법론, 즉 (1) 낮은 비등점 가스(DFB)를 사용하여 미리 형성된 마이크로버블을 생성하는 방법에는 몇 가지 중요한 차이가 있으며, (2) 방울을 효율적으로 형성하고 (3) 방울을 효율적으로 형성하고 (3) 방울을 효율적으로 형성하고 (3) 방울 응축 효율을 극대화하고 버블 가스 용해를 피하기 위해 압력의 신속한 적용을 냉각한다.
압출을 위해 마이크로 버블 샘플을 냉각하는 것은 안정적인 DFB 액적의 고농도를 생성하는 중요한 단계입니다. 이 프로토콜에서, 전체 압출기는 얼음 목욕을 포함하는 소금에 배치되고 -2 °C에서 유지된다. 압출기는 보다 효율적이고 빠른 냉각을 가능하게 하기 위해 유체순환을 위한 입구와 출구 포트를 가지고 있으며, 순환 펌프가 필요합니다. DFB 물방울 생산을 위해 순환하는 물 시스템 없이 고농도 의 물방울(1011-1012 물방울/mL)을 생성할 수 있습니다. 그러나 냉순환욕을 포함시켜 물방울 생산 효율을 더욱 개선할 수 있어 냉각 대기 시간을 줄일 수 있을 것으로 기대된다. 이 정확한 프로토콜은 OFP 마이크로 버블에도 사용되었습니다. 흥미롭게도, OFP 기포는 현미경 검사법을 사용하여 관찰될 때 더 많고 작은 것으로 나타났다 (그림 9), 물방울의 수율은 펠릿을 세척하고 수집 한 후 눈에 띄게 적지만. 압출자를 더욱 냉각시키고 질소 탱크의 압력을 증가시키면 OFP 물방울 생산이 향상될 가능성이 높습니다. OFP 물방울은 또한 악명 높게 불안정하고 자발적인 기화를 최소화하기 위하여 온화한 취급 및 적당한 저장 조건이 필요합니다.
압력의 신속한 적용은이 절차에서 또 다른 중요한 단계입니다. 이 프로토콜에서 압출을 사용하면 압출기 챔버의 마이크로 버블에 압력의 축적과 즉각적인 적용에 따라 달라집니다. 표준 지질 압출 프로토콜에서 샘플이 멤브레인 필터를 통과하기 시작할 때까지 압력이 천천히 증가합니다. 실험적인 관측에 따르면 압력의 느린 적용은 거품이 방울로 응축되는 대신 기포 코어에서 가스 용해로 이어질 수 있음을 나타냅니다. 따라서 가스 입구 밸브를 닫고 탱크 압력을 250 psi로 설정하여 질소 가스로 압출기 입구 튜브를 "프라임"하기로 결정했습니다. 그런 다음 압출기로 입구 밸브를 열기 전에 탱크를 차단해야 합니다. 절차의이 부분을 따르지 않으면 압출기의 출구에서 샘플이 급속히 추방되고 손실됩니다. 250 psi 이상의 압력은 탱크가 제대로 닫혀 있더라도 시료의 급속한 퇴학으로 인한 시료 손실을 일으킬 수도 있습니다. 준비, 단계를 완료하거나 압출기를 사용할 때 압력 게이지 및 밸브를 검사하는 데 주의를 기울여야 합니다. 압력이 0으로 떨어지지 않거나 솔루션이 예상대로 압출기를 종료하지 않는 경우 먼저 모든 밸브가 적절한 위치에 있는지 확인하십시오. 압력 방출 밸브는 챔버 내용에 영향을 주지 않고 압력을 방출하기 위해 항상 열 수 있습니다. 압출기에 압력이 가해지면 가스 를 탈출하는 것을 듣고 압력 게이지를 보는 것도 중요합니다. 일반적으로 압력이 가해지면 솔루션이 출구 튜브에서 나오기 시작하거나 시스템에 누출이 있습니다. 챔버에 마이크로 버블 솔루션을 추가하기 전에 압출자가 올바르게 조립되었는지 확인하기 위해 시스템을 프라임해야 합니다. 시간이 지남에 따라 O-링이 마모되어 시스템이 올바르게 밀봉되는 것을 방지할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 모든 부품이 제대로 작동하고 단단한 씰이 생성되었는지 확인합니다. 여기에 설명된 프로토콜에서 단 하나의 압출만 수행되었습니다. 액적 샘플을 압출기로 다시 도입하고 다중 압출 단계(일반적으로 5와 10 사이)를 수행함으로써 크기 분포를 더 좁힐 수 있다. 여러 번 압출하면 물방울의 총 수율이 감소할 수 있습니다. DLS 및 TRSP의 크기 분포를 감안할 때 대부분의 응용 프로그램에 단일 압출이 충분할 수 있습니다. 마지막으로 이 프로토콜은 200nm 필터에 최적화되었습니다. 압력은 더 크거나 작은 필터 크기에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다.
샘플이 성공적으로 압출된 후, 거품이 물방울로 제대로 응축되었는지 확인하기 위해 테스트해야 합니다. Submicron 액적표준 광 이미징 기술을 사용하여 볼 수 없으므로 먼저 기화되어 더 눈에 띄게되어야합니다6. 기화 전에 샘플을 이미지화하여 미세 거품의 부재를 확인하거나 물방울을 가열하기 전에 자발적인 기화 수준을 결정하는 것이 여전히 중요합니다. 이미징 소프트웨어는 나노방울에 대한 데이터를 간접적으로 제공하기 위해 이미지의 마이크로 버블을 계산하고 크기를 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 기화 에 이어 온난화 중에 거품이 빠르게 합쳐질 것이라는 점에 유의해야합니다. 따라서, 현미경 분석에서 기포 크기와 카운트는 초기 액적 크기 및 농도를 반영하지 않을 가능성이 있다. 가능한 경우 적물 분포 및 농도의 직접 측정은 튜닝 가능한 저항 펄스 감지(TRPS)를 사용하여 수행하는 것이 가장 좋습니다. TRSP의 대표적인 액적 분포 데이터가 제공되었습니다(그림 6).
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 vaporizable 위상 시프트 나노 방울의 TRSP 분석을 제공하는 박사 켄 호이트의 실험실에서 도미니크 제임스에게 감사드립니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
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