미리 형성된 마이크로버블에서 멤브레인 여과 위상 시프트 데카플루오로부탄 나노방울의 생산
Summary
이 프로토콜은 프로브 팁 초음파 처리를 사용하여 대용량 지질 캡슐화된 데파플루오로부탄 마이크로버블을 생성하고 고압 압출 및 기계적 여과를 사용하여 위상 시프트 나노 방울로 응축시키는 방법을 설명합니다.
Abstract
화상 진찰 및 치료를 위한 vaporizable 상 시프트 물방울의 생산을 위해 이용될 수 있는 많은 방법이 있습니다. 각 방법은 서로 다른 기술을 활용하고 가격, 재료 및 목적에 따라 다릅니다. 이러한 제조 방법의 대부분은 균일하지 않은 활성화 임계값을 가진 다분산 인구를 초래합니다. 또한, 액적 크기를 제어하려면 일반적으로 생체 내에서 실용적이지 않은 높은 활성화 임계값을 가진 안정적인 퍼플루오로카본 액체가 필요합니다. 낮은 비등점 가스를 사용하여 균일 한 방울 크기를 생산하는 것은 생체 이미징 및 치료 실험에 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 저등점 데아플루오로부탄(DFB)을 이용한 크기 여과된 지질 안정화 위상 시프트 나노방울의 형성을 위한 간단하고 경제적인 방법을 설명합니다. 지질 마이크로 버블을 생성하는 일반적인 방법은 단일 단계에서 고압 압출로 응축하는 새로운 방법 외에도 설명됩니다. 이 방법은 많은 생물학적 실험실에서 발견되는 일반적인 실험실 장비를 사용하여 다양한 응용 분야에 대해 시간을 절약하고 효율성을 극대화하며 더 많은 양의 마이크로 버블 및 나노 드롭렛 솔루션을 생성하도록 설계되었습니다.
Introduction
초음파 조영제 (UCA)는 이미징 및 치료 응용 프로그램에 대한 인기가 급속히 증가하고 있습니다. 마이크로 버블, 원래 UCA, 현재 임상 진단 응용 프로그램에 사용되는 주류 에이전트입니다. 마이크로버블은 지질, 단백질 또는 폴리머 껍질1로 둘러싸인 직경 1-10 μm의 가스 로 채워진 구체입니다. 그러나 크기와 생체 내 안정성은 많은 응용 프로그램에서 기능을 제한할 수 있습니다. 과열된 액체 코어를 포함하는 위상 이동 나노 방울은 크기가 작고 순환 생활이 향상되어 이러한 제한 사항 중 일부를 극복 할 수 있습니다2. 열 또는 음향 에너지에 노출되면 과열된 액체 코어가 기화하여 가스 마이크로버블2,3,4,5를 형성합니다. 기화 임계값은 액적 크기5,6과 직접 관련이 있기 때문에 균일한 크기로 액적 현탁액을 공식화하는 것이 일관된 활성화 임계값을 달성하는 데 매우 바람직할 것입니다. 균일한 액적 크기를 생성하는 제형 방법은 종종 복잡하고 비용이 많이 드는 반면, 비용 효율적인 접근 방식은 다분산 솔루션7을 초래합니다. 또 다른 제한은 생체 내에서 효율적인 활성화에 매우 중요한 낮은 비등점 퍼플루오로카본(PFC) 가스로 안정적인 위상 시프트 방울을 생성하는 기능입니다. 이 원고에서, 프로토콜은 생체 내 이미징 및 치료 응용 을 위한 안정적인 여과 된 낮은 비등점 기발성 위상 이동 방울을 생성하기 위한 설명이다.
모노분산 서브미칸 위상 시프트 액적7을 생성하는 많은 방법이 있습니다. 크기를 제어하는 가장 강력한 방법 중 하나는 미세 유체 장치의 사용입니다. 이러한 장치는 비용이 많이 들 수 있으며, 물방울 생산 속도가 느려지며(~104-106방울/s)7이 필요하며 광범위한 교육이 필요합니다. 미세 유체 장치는 또한 일반적으로 시스템의 자발적인 기화 및 막힘을 피하기 위해 고비등점 가스가 필요합니다7. 그러나, de Gracia Lux et al.9에 의한 최근 연구는 저등점 decafluorobutane (DFB) 또는 옥타플루오로프로판 (OFP)를 사용하여 저조미크론 위상 시프트 (1010-1012/mL)의 고농도를 생성하는 데 미세 유체제를 냉각하는 방법을 보여줍니다.
일반적으로 DFB 또는 OFP와 같은 저등점 가스는 미리 형성된 가스 기포를 사용하여 취급하기가 더 쉽습니다. 증발성 물방울은 저온 및 고압5,10을 사용하여 가스를 응축시킴으로써 전구체 지질 안정화 기포로부터 생성될 수 있다. 이 방법을 사용하여 생산된 액적의 농도는 전구체 마이크로 버블 농도 및 방울로 의 기포 변환의 효율에 따라 달라집니다. 농축 마이크로 버블은 1010 MB /mL11 >에 접근하는 팁 초음파 처리에서 보고되었으며, 별도의 연구는 응축 된 OFP 및 DFP 거품12에서 ~ 1-3 x1011 방울 / mL에 이르는 방울 농도를보고했습니다. 단일 분산 된 액적문제가 우려되지 않는 경우 응축 방법은 낮은 비등점 PFC를 사용하여 지질 안정화 위상 시프트 액적을 생성하는 가장 간단하고 저렴한 방법입니다. 그러나, 단일분산 전구체 기포를 생성하는 것도 어렵기 때문에 미세유체또는 반복된 차동 원심분리기와 같은 비용이 많이 드는 접근법이 필요하다11. DFB와 OFB 나노방울을 생산하는 대체 접근법은 최근 리포솜13에 있는 물방울의 자발적인 핵을 사용하여 간행되었습니다. 이 방법은 “Ouzo” 효과를 활용하여 거품을 응축할 필요 없이 낮은 비등점 PFC 방울을 생성하는 간단한 방법입니다. PFC 액적의 크기 분포는 액적의 핵을 시작하는 데 사용되는 PFC, 지질 및 에탄올 성분을 섬세한 적정 및 혼합하여 제어할 수 있습니다. 또한 퍼플루오로카본의 혼합은 나노방울14,15의 안정성 과 활성화 임계값을 제어하는 데 사용될 수 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다. Shakya 외.에 의한 최신 연구는 탄화수소 내골격 내에서 높은 비등점 PFC를 유화하여 나노 방울 활성화가 다른 형태의 액적 크기 여과와 함께 고려될 수 있는 접근법인 액적 코어16 내에서 이종성 핵화를 용이하게 함으로써 어떻게 조정할 수 있는지를 보여줍니다.
일단 형성되면, 위상 이동 액적더는 더 많은 단일 분산 인구를 만들기 위해 형성 후 압출 될 수있다. 실제로, 여기서 설명된 방법과 유사한 프로토콜은 코모펙 외.17 에 의해 이전에 공표되어 높은 비등점 도데코플루오펜타네(DDFP)를 액적 코어로 사용하였다. 높은 비등점 퍼플루오로카본 (실온에서 안정)과 위상 시프트 방울을 사용하고자하는 독자는 대신 위의 기사를 참조해야합니다. DFB 및 OFP와 같이 낮은 비등점 가스로 물방울을 생성하고 압출하는 것이 더 복잡하며 미리 형성된 가스 기포를 응축하여 접근하는 것이 가장 좋습니다.
본 프로토콜에서, 프로브 팁 초음파 처리를 사용하여 DFB 가스 코어로 미리 형성된 지질 마이크로버블을 생성하는 일반적인 방법이 설명된다. 다음으로, 상업용 압출기는 전형 마이크로버블을 서브미칸 위상 시프트 나노방울로 응축하는 데 사용된다(도 1). 결과 물방울은 열과 초음파에 의해 활성화됩니다. 이 방법은 고가의 미세 유체 장치 없이는 크기 분포가 좁은 기존 응축 방법보다 더 많은 양의 나노 드롭렛 솔루션을 생성할 수 있습니다. 크기 분포가 좁은 나노 드롭렛 솔루션의 생산은 더 균일한 기화 임계값을 생성할 수 있습니다. 이것은 화상 진찰, 절제, 약 납품 및 색전화1,3,4,6와 같은 수많은 응용에 대한 그들의 잠재력을 최대화할 것입니다.
그림 1: 전형성 마이크로버블을 위상 시프트 나노방울로 응축하기 위한 고압 압출 설정의 회로도. 마이크로버블 용액은 압출기 챔버에 첨가되고 함유되고, 질소 탱크로부터 250psi가 챔버 입구 밸브를 통해 가적용됩니다. 질소 가스는 챔버의 기저에 있는 필터를 통해 마이크로버블 용액을 밀어 내고 샘플을 나노방울로 응축합니다. 용액은 마침내 샘플 콘센트 튜브를 통해 압출기에서 밀려 나서 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 내 이미징 및 치료를 위한 마이크로 버블 및 위상 시프트 물방울의 제형, 물리학 및 잠재적인 응용 분야에 대해 설명하는 포괄적인 문헌 본문이 있습니다. 이 토론은 지질 마이크로 버블을 생성하고 낮은 비등점 DFB 가스 및 고압 압출을 사용하여 하위 미크로른 위상 이동 방울로 변환하는 데 명시적으로 관련됩니다. 여기에 설명된 방법은 이전 마이크로버블 응축 방법을 한 단계로 결합하여 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 vaporizable 위상 시프트 나노 방울의 TRSP 분석을 제공하는 박사 켄 호이트의 실험실에서 도미니크 제임스에게 감사드립니다
Materials
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | – | – | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | – | – | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | – | – | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | – | – | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
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