Summary
يظهر هنا تقنية طباعة 3D خفيفة مدفوعة بقوى لزجة بالقصور الذاتي بالتناوب لتمكين بناء ناقلات هيدروجيل دقيقة. توفر الفوهات محلية الصنع المرونة ، مما يسمح بسهولة الاستبدال للمواد والأقطار المختلفة. يمكن الحصول على الناقلات الدقيقة المرتبطة بالخلايا التي يبلغ قطرها 50-500 ميكرومتر وجمعها لمزيد من الثقافة.
Abstract
الناقلات الدقيقة هي حبات يبلغ قطرها 60-250 ميكرومتر ومساحة سطح محددة كبيرة ، والتي تستخدم عادة كحاملات لمزارع الخلايا واسعة النطاق. أصبحت تكنولوجيا زراعة الناقلات الدقيقة واحدة من التقنيات الرئيسية في البحوث الخلوية وتستخدم عادة في مجال توسيع الخلايا على نطاق واسع. كما ثبت أن الناقلات الدقيقة تلعب دورا متزايد الأهمية في بناء هندسة الأنسجة في المختبر وفحص الأدوية السريرية. تشمل الطرق الحالية لإعداد الناقلات الدقيقة رقائق الموائع الدقيقة والطباعة النافثة للحبر ، والتي غالبا ما تعتمد على تصميم قناة تدفق معقدة ، وواجهة غير متوافقة من مرحلتين ، وشكل فوهة ثابتة. تواجه هذه الطرق تحديات معالجة الفوهة المعقدة ، وتغييرات الفوهة غير المريحة ، وقوى البثق المفرطة عند تطبيقها على حبر حيوي متعدد. في هذه الدراسة ، تم تطبيق تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد ، والتي تسمى نفث القوة اللزجة بالقصور الذاتي بالتناوب ، لتمكين بناء ناقلات هيدروجيل صغيرة يبلغ قطرها 100-300 ميكرومتر. تم زرع الخلايا في وقت لاحق على الناقلات الدقيقة لتشكيل وحدات هندسة الأنسجة. بالمقارنة مع الطرق الحالية ، توفر هذه الطريقة قطر طرف فوهة مجاني ، وتبديل فوهة مرن ، وتحكم مجاني في معلمات الطباعة ، وظروف طباعة معتدلة لمجموعة واسعة من المواد النشطة بيولوجيا.
Introduction
الناقلات الدقيقة هي خرز يبلغ قطره 60-250 ميكرومتر ومساحة سطح محددة كبيرة وتستخدم عادة لزراعة الخلايا على نطاق واسع1,2. يوفر سطحها الخارجي مواقع نمو وفيرة للخلايا ، ويوفر الجزء الداخلي بنية دعم للانتشار المكاني. يوفر الهيكل الكروي أيضا الراحة في مراقبة المعلمات والتحكم فيها ، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني و O2 وتركيز العناصر الغذائية والأيضات. وعند استخدامها مع المفاعلات الحيوية للخزانات المقلوبة، يمكن للناقلات الدقيقة أن تحقق كثافات خلوية أعلى في حجم صغير نسبيا مقارنة بالثقافات التقليدية، مما يوفر طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحقيق ثقافات واسعة النطاق3. أصبحت تكنولوجيا زراعة الناقلات الدقيقة واحدة من التقنيات الرئيسية في البحوث الخلوية، وتم إحراز تقدم كبير في مجال التوسع على نطاق واسع في الخلايا الجذعية، وخلايا الكبد، والخلايا الغضروفية والخلايا الليفية وغيرها من الهياكل4. كما وجد أنها مركبات مثالية لتوصيل الأدوية ووحدات من أسفل إلى أعلى، وبالتالي تلعب دورا متزايد الأهمية في فحص الأدوية السريرية وإصلاح هندسة الأنسجة في المختبر5.
لتلبية متطلبات الملكية الميكانيكية في سيناريوهات مختلفة ، تم تطوير أنواع متعددة من مواد الهيدروجيل لاستخدامها في بناء الناقلات الصغيرة6،7،8،9،10،11. تعد المواد الهلامية المائية للجينات وحمض الهيالورونيك (HA) من أكثر المواد الحاملة للميكرو استخداما بسبب توافقها الحيوي الجيد وقابليتها للربط المتبادل 12,13. يمكن ربط الجينات بسهولة بواسطة كلوريد الكالسيوم ، ويمكن تعديل خصائصه الميكانيكية عن طريق تغيير وقت الربط المتبادل. يرتبط HA المترافق مع التيرامين عن طريق الاقتران التأكسدي لموييتات التيرامين التي يحفزها بيروكسيد الهيدروجين وبيروكسيديز الفجل14. غالبا ما يستخدم الكولاجين ، بسبب هيكله الحلزوني الفريد وشبكة الألياف المتقاطعة ، كمادة مساعدة للخلط مع الناقلات الدقيقة لزيادة تعزيز ارتباط الخلايا15,16.
تشمل الطرق الحالية لإعداد الناقلات الدقيقة رقائق الموائع الدقيقة ، والطباعة النافثة للحبر ، والرش الكهربائي 17،18،19،20،21،22،23. وقد ثبت أن رقائق الموائع الدقيقة سريعة وفعالة في إنتاج ناقلات دقيقة موحدة الحجم24. ومع ذلك، تعتمد هذه التقنية على تصميم قناة تدفق معقدة وعملية تصنيع25. قد تؤثر درجات الحرارة العالية أو قوى البثق المفرطة أثناء الطباعة النافثة للحبر، فضلا عن المجالات الكهربائية الشديدة في نهج الرش الكهربائي، سلبا على خصائص المادة، وخاصة نشاطها البيولوجي19. إلى جانب ذلك ، عند تطبيقها على مختلف المواد الحيوية والأقطار ، فإن الفوهات المخصصة المستخدمة في هذه الطرق تؤدي إلى تعقيد معالجة محدود وتكلفة عالية ومرونة منخفضة.
لتوفير طريقة مريحة لإعداد microcarrier ، تم تطبيق تقنية طباعة 3D تسمى نفث القوى اللزجة بالقصور الذاتي بالتناوب (AVIFJ) لبناء ناقلات هيدروجيل دقيقة. تستخدم هذه التقنية قوى دافعة لأسفل وضغطا ثابتا يتم توليده أثناء الاهتزاز الرأسي للتغلب على التوتر السطحي لطرف الفوهة وبالتالي تشكيل قطرات. بدلا من القوى الشديدة والظروف الحرارية ، تعمل الإزاحات السريعة الصغيرة مباشرة على الفوهة أثناء الطباعة ، مما يسبب تأثيرا طفيفا على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للحبر الحيوي ويوفر جاذبية كبيرة للمواد النشطة بيولوجيا. باستخدام طريقة AVIFJ ، تم تشكيل ناقلات دقيقة من مواد حيوية متعددة بأقطار تتراوح بين 100 و 300 ميكرومتر بنجاح. إلى جانب ذلك ، ثبت أن الناقلات الدقيقة تربط الخلايا جيدا وتوفر بيئة نمو مناسبة للخلايا الملتصقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة الخلايا
- تكملة الحد الأدنى من الوسط الأساسي المعدل من Dulbecco عالي الجلوكوز (H-DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ محلول حمض أميني غير أساسي (NEAA) ، و 1٪ بنسلين G و streptomycin، و 1٪ ملحق الجلوتامين كوسائط ثقافة لخلايا A549.
- زراعة خلايا A549 في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية ومع 5٪ CO2
- فصل الخلايا للزراعة الفرعية باستخدام التربسين عند التقاء 80٪ تقريبا.
- استخدم 3 مل من التربسين لعلاج الخلايا الموجودة في قارورة ثقافة T75 عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم أضف 6 مل من وسط المزرعة لوقف التربسين.
- ماصة وسط الثقافة لحصاد الخلايا الملتصقة بشكل فضفاض.
- جهاز طرد مركزي عند 72.5 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليقه باستخدام 3 مل من الوسط الطازج.
- انقل 1 مل من تعليق الخلايا إلى قارورة ثقافة T75 جديدة تحتوي على 10 مل من الوسط الطازج. تغيير وسط الثقافة كل 2 أيام.
2. إعداد الفوهات
- قم بتحميل الماصات الزجاجية الدقيقة على المجتذب باتباع تعليمات الشركة المصنعة. القطر الخارجي والقطر الداخلي وطول الأنبوب النفاث الصغير هو 1.5 مم و 1.1 مم و 100 مم على التوالي.
- اضبط معلمات السحب للمسحوب. على وجه التحديد ، يتم تعيين قيم الحرارة والسحب والسرعة والوقت والضغط إلى 560 و 255 و 255 و 150 و 500 بشكل افتراضي ، على التوالي. اسحب الفوهة تحت هذه المعلمات.
تنبيه: الفوهة التي تم الحصول عليها بعد السحب حادة للغاية ، وقد تسبب العملية المهملة إصابات. - اقطع الفوهة الناتجة (الخطوة 2.2) عند القطر المحدد بواسطة جهاز صغير التشكيل باتباع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على قطر طرف محدد. على وجه التحديد ، حدد موقع القطر المحدد للفوهة على سلك البلاتين الساخن. قم بتسخين السلك حتى 60 درجة مئوية لمدة 5 ثوان تقريبا واسحب الفوهة بعيدا.
- اغمر رأس طباعة الفوهة في عامل مسعور لمدة 30 دقيقة ، تليها ثلاث دورات من الشطف بالماء المعقم.
- قبل الطباعة ، قم بتعقيم الفوهة في الكحول لمدة 5 دقائق وشطفها بالماء المعقم ثلاث مرات لإزالة الكحول المتبقي.
3. إعداد الحبر الحيوي هيدروجيل
- قم بإذابة كلوريد الصوديوم (0.45 جم) في 50 مل من الماء المعقم للحصول على محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ (ث / v). يهتز الحل لتعزيز الانحلال. بعد إذابته بالكامل ، قم بتصفية المحلول من خلال غشاء مرشح البولي إيثيلين تيريفثاليت 0.45 ميكرومتر.
- وزن مسحوق ألجينات الصوديوم منخفض اللزوجة (1 جم) وإذابته في 25 مل من محلول كلوريد الصوديوم (الخطوة 3.1) عند درجة حرارة عالية تتراوح بين 60-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها للحصول على محلول مخزون ألجينات الصوديوم بنسبة 4٪ (ث / v). يمكن تخزين محلول المخزون في 4 درجات مئوية لمدة 1 شهر.
- قم بتعقيم محلول مخزون ألجينات الصوديوم (الخطوة 3.2) عن طريق تسخينه ثلاث مرات في فرن (70 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
- تمييع الحجم المناسب لمحلول مخزون ألجينات الصوديوم (الخطوة 3.3) في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ (الخطوة 3.1) بتركيزات 2٪ و 1.5٪ و 0.5٪ (ث / v).
ملاحظة: بالإضافة إلى التسخين في الفرن ، يجب إجراء عمليات تحضير أخرى لمحلول ألجينات الصوديوم في غطاء المحرك. - قم بإذابة 1 غرام من مسحوق الجيلاتين في 25 مل من محلول كلوريد الصوديوم (الخطوة 3.1) عند درجة حرارة عالية تتراوح بين 60-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها للحصول على محلول مخزون الجيلاتين 4٪ (ث / v). يمكن تخزين محلول المخزون في 4 درجات مئوية لمدة 1 شهر.
- قم بتعقيم محلول مخزون الجيلاتين (الخطوة 3.5) عن طريق تسخينه ثلاث مرات في فرن (70 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
- قم بتخفيف الحجم المناسب لمحلول مخزون الجيلاتين (الخطوة 3.6) في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ (الخطوة 3.1) بتركيز 1.5٪ (ث / v).
ملاحظة: بالإضافة إلى التسخين في الفرن ، يجب إجراء عمليات تحضير أخرى لمحلول الجيلاتين في غطاء المحرك. - لتعزيز ارتباط الخلايا على الناقلات الدقيقة ، قم بإعداد محلول الجينات والكولاجين عن طريق خلط محلول ألجينات الصوديوم 2٪ (ث / v) ومحلول الكولاجين من النوع الأول من ذيل الفئران (4 ملغ / مل) بنسبة 3: 1. اضبط المحلول على الرقم الهيدروجيني 7.2 باستخدام محلول 0.1 M NaOH واستخدمه مباشرة بعد التحضير.
- قم بإذابة مادة HA الصلبة النضرة المعدلة بالتيروزين في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) عند 60-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها للحصول على محلول PBS لحمض الهيالورونيك المعدل بالتيروزين بنسبة 0.8٪ w/w. يمكن تخزين محلول المخزون في 4 درجات مئوية لمدة 1 شهر.
- قم بتعقيم محلول HA PBS المعدل بالتيروزين عن طريق تسخينه ثلاث مرات في فرن (70 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
- قم بإذابة مسحوق بيروكسيديز الفجل (500 وحدة نشاط إنزيم / ملغ) في محلول PBS للحصول على 8 وحدة نشاط إنزيم / محلول بيروكسيديز PBS الفجل.
- تمييع محلول بيروكسيد الهيدروجين (30٪ ، ث / ث) بواسطة ماء DI إلى 4 mM.
- قم بإعداد محلول البيروكسيديز المعدل بالفجل HA-horseard عن طريق خلط محلول PBS لحمض الهيالورونيك المعدل بالتيروزين ومحلول PBS البيروكسيديز بالفجل بنسبة 1: 1.
ملاحظة: بالإضافة إلى التسخين في الفرن ، يجب إجراء عمليات تحضير أخرى لمحلول بيروكسيديز الفجل HA في غطاء المحرك.
4. تشكيل القطرات الدقيقة على أساس AVIFJ
- استخدم نظام طباعة خلوية تم إنشاؤه في المنزل كما تم الإبلاغ عنه سابقا (الشكل 1A)26. يتم تضخيم خرج الإشارة الكهربائية بواسطة مولد الشكل الموجي أولا ثم يدفع السيراميك الكهرضغطي لتوليد تشوه يمكن التحكم فيه. وبالتالي فإن الفوهة المثبتة على السيراميك الكهرضغطي تنتج اهتزازات يمكن التحكم فيها.
- قم بتعقيم نظام الطباعة عن طريق المسح بالتعرض للكحول (v/v) بنسبة 75٪ والأشعة فوق البنفسجية (UV) طوال الليل.
- قم بتحميل 5 مل من الحبر الحيوي (الخطوة 3.1) في حقنة معقمة يمكن التخلص منها. قم بتثبيت المحقنة على مضخة المحقنة.
- قم بتوصيل المحقنة (الخطوة 4.3) والفوهة (الخطوة 2.5) بخرطوم سيليكون قطره الداخلي 1 مم.
- قم بإصلاح الفوهة (الخطوة 4.4) لاستخدامها في الطباعة عن طريق ضبط ضيق برغي اللقط. حافظ على طرف الفوهة بعيدا عن الركيزة أثناء التثبيت لتجنب التلف والتلوث.
تنبيه: إذا كانت الفوهة مكسورة أثناء التركيب، يرجى ارتداء قفازات أكثر سمكا وتنظيف شظايا الزجاج والمخلفات بعناية. - ادفع مضخة المحقنة بسرعة وقم بتحميل الحبر الحيوي (الخطوة 4.3) إلى الفوهة (الخطوة 4.5). اضبط معدل التدفق على 30 ميكرولتر/دقيقة. امسح المواد الزائدة عند الطرف.
- تعيين معلمات مولد الإشارة. استيراد شكل موجي مصمم ذاتيا يحتوي على 500,000 نقطة أخذ عينات. اضبط معدل أخذ العينات والجهد من الذروة إلى الذروة (Vpp) على أنه 5 ملايين عينة / ثانية و 10 فولت ، على التوالي.
- تنظيف الشرائح أو أطباق بتري بالماء منزوع الأيونات. ضعها تحت الفوهة كركيزة الطباعة.
- قم بضبط مسار الحركة مسبقا ووضع الاهتزاز عند الطلب.
- اطبع القطرات باتباع الأنماط المصممة مسبقا.
5. تشكيل الناقلات الدقيقة على أساس AVIFJ
- كرر الخطوات 4.1-4.4، باستثناء تغيير الحبر الحيوي إلى محلول ألجينات 2٪ (w/v) (الخطوة 3.4)، أو محلول الكولاجين (الخطوة 3.8)، أو محلول بيروكسيديز الفجل المعدل HA-horseard (الخطوة 3.13).
- قم بإذابة 3 جم من كلوريد الكالسيوم في 100 مل من الماء المعقم للحصول على محلول كلوريد الكالسيوم بنسبة 3٪ (ث / v). بعد إذابته بالكامل ، قم بتصفية المحلول من خلال غشاء مرشح البولي إيثيلين تيريفثاليت 0.45 ميكرومتر.
- أضف 5 مل من محلول الربط المتقاطع (محلول كلوريد الكالسيوم أو محلول بيروكسيد الهيدروجين) إلى طبق بتري. ضع طبق بتري تحت الفوهة للعمل كركيزة.
- بعد الطباعة ، قم بربط الناقلات الصغيرة لمدة 3 دقائق.
- جمع تعليق microcarrier في أنبوب جهاز طرد مركزي ، وإثراء microcarriers عن طريق الطرد المركزي في 29 × g لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق الناقلات الصغيرة في وسائط الاستزراع عند حوالي 600 ناقل صغير/مل.
6. تطعيم الخلايا على سطح الناقلات الدقيقة
- بقع A549 الخلايا مع خلية تعقب الأخضر CMFDA لتسهيل مراقبة الخلايا. على وجه التحديد ، قم بإزالة وسائط الزراعة ، وإضافة 5 مل من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على صبغة 10 μM Cell Tracker ، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في حاضنة. ثم ، استبدل محلول الصبغة بوسط طازج.
- أعد تعليق الخلية A549 بكثافة 1.6 × 106 خلايا/مل.
- أضف 1 مل من تعليق الناقل الدقيق للجينات والكولاجين (الخطوة 5.3) و 1 مل من تعليق الخلايا A549 (الخطوة 6.1) إلى لوحة استزراع منخفضة الالتصاق من 6 آبار.
- ضع اللوحة على شاكر عند 30 دورة في الدقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- انزع الصفيحة عن الخلاط وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للناقلات الصغيرة بالاستقرار. نصف تغيير الثقافة المتوسطة كل 2 أيام.
7. تحليل تكوين القطرات الدقيقة / الناقلات الدقيقة
- راقب وقياس الفوهة (الخطوة 2.2) ، وأطباق بتري (الخطوة 4.10 والخطوة 5.4) ، والخلايا ذات الناقلات الدقيقة (الخطوة 6.5) تحت مجهر ميداني ساطع أو مجهر بؤري. على وجه التحديد ، التكبير الموضوعي هو 4x أو 10x أو 20x وتكبير العدسة هو 10x.
- قم بقياس قطر الناقلات الدقيقة بواسطة برنامج ImageJ. وفقا لشريط المقياس الذي يأتي مع المجهر عند التصوير في الصورة ، اضبط الحجم الفعلي للمقياس في ImageJ ، وارسم 10 خطوط من نصف القطر أو المحور شبه الرئيسي للناقلات الدقيقة. يمكن ل ImageJ الحصول على متوسط الحجم والانحراف المعياري لمقاطع الخط هذه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تصنيع رؤوس طباعة ذات معدلات تقارب وأقطار متنوعة لتحقيق طباعة أنواع متعددة من المواد. يتم عرض الفوهات التي تم الحصول عليها مع زيادة قوة السحب في الشكل 1B. تم تقسيم الفوهات إلى ثلاثة مجالات: الخزان (III) ، والانكماش (II) ، ورأس الطباعة (I). كان الخزان هو الجزء غير المعالج من الفوهة ، حيث وفر السائل ضغطا ثابتا ومدخلات الحبر الحيوي للطباعة. كانت منطقة الانكماش هي الجزء الرئيسي لتوليد القوى الدافعة الهبوطية. كان لقوة السحب تأثير كبير على رأس الطباعة ، مما يدل على انخفاض معدل التقارب مع قوة السحب الممتدة. زاد رأس الطباعة الأضيق والأطول من التوتر السطحي أثناء الطباعة ، مما جعل تكوين قطرات صغيرة منفصلة أكثر صعوبة ، ولكنه سهل قطع الأطراف ذات القطر الأصغر في العمليات اللاحقة. بعد ذلك ، باستخدام أداة تزوير الإبرة ، تم قطع رأس الطباعة عند القطر المحدد (الشكل 1C). كانت النصائح ذات الأقطار المختلفة ، بما في ذلك 100 و 120 و 150 و 200 ميكرومتر ، متاحة لتوليد ناقلات دقيقة من أحجام مختلفة ، تلبي متطلبات الأنسجة الدقيقة المختلفة في المختبر .
تم التحقق من استقرار عملية الطباعة وإمكانية التحكم فيها لأول مرة عن طريق طباعة قطرات على أطباق Petri. مع فوهة طرف 30 ميكرومتر ، تمت طباعة العديد من الحبر الحيوي ، بما في ذلك PBS ، و 1.5٪ من الجينات ، و 1.5٪ من الجيلاتين بشكل ثابت (الشكل 2A ، B). انعكست صعوبة طباعة حبر حيوي معين في معدل أخذ العينات و Vpp المستخدم في الطباعة. تمت طباعة الحبر الحيوي منخفض اللزوجة مثل محلول كلوريد الصوديوم بمعلمات أصغر ، مما أدى إلى أقطار قطرات أصغر. ومع زيادة اللزوجة، أصبحت عملية الطباعة أكثر صعوبة في المقابل، حيث كانت هناك حاجة إلى قوى دفع أكبر وستحصل قطرات أكبر (الشكل 2 ب). باستخدام هذه الآلية ، يمكن استخدام ضبط المعلمات وقوى الدفع لحبر حيوي معين لضبط أحجام قطرات مختلفة ، كما هو موضح في الشكل 2C. يوضح الشكل 2D ترتيب القطرات التي تشكل الحروف المحددة "THU" على سطح مستو. إلى جانب ذلك ، سمح الجمع بين الملاحظات المجهرية بتوطين القطرات الدقيقة على نطاقات أصغر في حدود 100 ميكرومتر.
تمت طباعة الناقلات الدقيقة للجينات (الشكل 3A) والناقلات الدقيقة HA (الشكل 3C) بأطراف بأقطار مختلفة. ويبين الشكل 3 باء آثار قطر الطرف على قطر الناقل الدقيق للجينات. محدودة بسبب الانسداد الناجم عن تطاير المحلول عندما يكون الحجم صغيرا جدا ، كان أصغر قطر للناقلات الدقيقة المطبوعة للجينات المطبوعة حوالي 100 ميكرومتر. في حين أن أكبر قطر يمكن أن يصل إلى 300 ميكرومتر. يزداد قطر الناقلات الدقيقة المطبوعة بما يتماشى مع قطر الطرف ويكون دائما أكبر من الأخير. عندما يكون قطر الطرف أكبر من 250 ميكرومتر ، لا يمكن طباعة الحبر الحيوي. كان قطر الناقلات الدقيقة HA المعدلة المطبوعة 76.7 ± 1.8 ميكرومتر مع أقطار طرف 75 ميكرومتر (الشكل 3C).
تم زرع خلايا A549 والناقلات الدقيقة للجينات والكولاجين في طبق ووضعها على شاكر في الحاضنة. وقد لوحظت الخلايا للالتصاق بالناقلات الدقيقة للجينات والكولاجين بعد الخلط لمدة 2 أيام. تغطي الخلايا تدريجيا سطحا أكبر من الناقلات الدقيقة عن طريق الانتشار. بعد الزراعة لمدة 6 أيام ، غطت خلايا A549 بالكامل تقريبا الأسطح الحاملة للصغر. تؤكد هذه النتيجة أن الناقلات الدقيقة المتقدمة يمكنها ربط الخلايا بشكل جيد وتوفير بيئة نمو مناسبة للخلايا. ويبين الشكل 4 صورا ميدانية ساطعة وصورا متحدة البؤرة لخلايا A549 الملتصقة والمنتشرة على سطح الناقلات الدقيقة.
الشكل 1: نظام طباعة AVIFJ وإعداد فوهات بأقطار مختلفة . (أ) تركيب فوهة AVIFJ. (ب) في إطار بارامترات PULL محددة، تم تشكيل رأس الطباعة للفوهة بحيث يتقارب بمعدلات مختلفة. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. (ج) باستخدام أداة تزوير الإبرة ، تم قطع الطرف في مواضع محددة. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: طباعة أنواع متعددة من المواد الحيوية بتركيزات مختلفة بواسطة AVIFJ . (أ) الفوهة المستخدمة في هذا القسم من النتائج. كان قطر الطرف 30 ميكرومتر. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (ب) طباعة أنواع متعددة من مواد الهيدروجيل بما في ذلك PBS و 1.5٪ ألجينات و 1.5٪ جيلاتين في معلمات مختلفة. M: مليون عينة في الثانية الواحدة، تعكس مدة اهتزاز واحد. V: الجهد من الذروة إلى الذروة ، مما يعكس شوط اهتزاز واحد. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (ج) طباعة 0.5٪ من الجينات في معلمات مختلفة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (د) ترتيبات ثنائية الأبعاد وتحديد المواقع القريبة من القطرات. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الناقلات الدقيقة المطبوعة بأقطار مختلفة من طرف الفوهة. (A) 2٪ من الناقلات الدقيقة للجينات ، المطبوعة بأقطار طرف الفوهة عند 70 و 100 و 130 و 160 و 210 و 250 ميكرومتر ، على التوالي. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (ب) تأثير قطر طرف الفوهة على حجم الناقلات الدقيقة. تم تحليل أحجام الناقلات الدقيقة المطبوعة بفوهات بأقطار مختلفة إحصائيا باستخدام برنامج ImageJ. تم اختيار وحساب عشرة ناقلات صغيرة لكل فوهة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± s.d. (C) الناقلات الدقيقة HA المعدلة المطبوعة بأقطار طرفية عند 75 ميكرومتر. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: خلايا البذر على الناقلات الدقيقة للجينات والكولاجين . (أ) صور ميدانية ساطعة لخلايا A549 الملتصقة والمنتشرة على سطح الناقلات الدقيقة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (ب) صور متحدة البؤرة لخلايا A549 الملتصقة والمنتشرة على سطح الناقلات الدقيقة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. تستخدم القطع الناقص المنقط لتسليط الضوء على حدود الناقلات الصغيرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر البروتوكول الموضح هنا تعليمات لإعداد أنواع متعددة من ناقلات الهيدروجيل الدقيقة وبذر الخلايا اللاحقة. بالمقارنة مع رقاقة الموائع الدقيقة وطرق الطباعة النافثة للحبر ، يوفر نهج AVIFJ لبناء الناقلات الدقيقة مرونة أكبر وتوافقا حيويا. تتيح الفوهة المستقلة استخدام مجموعة واسعة من الفوهات خفيفة الوزن، بما في ذلك الماصات الزجاجية الدقيقة، في أنظمة الطباعة هذه. تتيح المعالجة التي يمكن التحكم فيها بشكل كبير ضبط المعلمات بما في ذلك حجم الخزان والقطر الداخلي وشكل رأس الطباعة بحرية. علاوة على ذلك ، تسهل الفوهة التي يمكن التخلص منها التعقيم للتبديل بين مواد متعددة ، مما يتجنب التلوث المحتمل من الاستخدام المتكرر. وأخيرا، تعمل الإزاحات الصغيرة والسريعة، بدلا من القوى الشديدة والظروف الحرارية، مباشرة على الفوهة أثناء عملية الطباعة، مع الحفاظ على الخصائص الفيزيائية والكيميائية الأصلية للحبر الحيوي المطبوع إلى أقصى حد؛ هذه الميزة جذابة للغاية لتطبيقات المواد الحيوية.
الخطوات الأكثر أهمية للإنتاج الناجح للناقلات الدقيقة ذات الحجم الصحيح هي: 1) إعداد فوهات بأطراف ذات أقطار مناسبة ، و 2) تكييف معدل أخذ العينات المناسب و Vpp وفقا لزوجة الحبر الحيوي المطبوع. يتم تحقيق استقرار بناء الناقلات الصغيرة عن طريق إزالة قطرات الأقمار الصناعية وتطبيق القوى الدافعة الخارجية. وتيسر البارامترات المتزايدة تكوين الناقلات الصغرى، ولكن القوى الدافعة المفرطة هي السبب الرئيسي لتكوين الناقلات الصغيرة الساتلية، مما يؤدي إلى حجم غير متجانس للناقلات الصغيرة. وبالتالي ، لتحسين توحيد حجم الناقل الصغير ، يوصى باستخدام معدلات أخذ العينات المناسبة (غير المفرطة) و Vpp. جانب آخر لتحسين استقرار الناقل الصغير هو تطبيق القوى الدافعة الخارجية. تكمل القوى الدافعة الخارجية الضغط الثابت والقوى الدافعة الهبوطية ، وتعمل معا للتغلب على التوتر السطحي عند الطرف. تم تجربة دفع مضخة حقنة لتغذية الفوهة وقوى دفع إضافية إضافية. على وجه التحديد ، تم توصيل الفوهة بحقنة ، تم ضبط سرعة دفعها بواسطة مضخة حقنة دقيقة. سمحت هذه الطريقة لنفس تركيز محلول الهيدروجيل بتكوين قطرات صغيرة عند معلمات محدودة ، وهو أمر مفيد لتقليل حجم الناقلات الدقيقة. وقد أبلغت دراسات أخرى عن استخدام الحقول الكهروستاتيكية أو خزانات الضغط لتعزيز طباعة القطرات الدقيقة27,28.
على الرغم من أنه من المتوقع أن يؤدي تطبيق القوى الدافعة الخارجية إلى توسيع نطاق أنواع وتركيزات الأحبار القابلة للطباعة ، إلا أن تقنية الطباعة المستخدمة هنا لا تزال تواجه تحدي القوى الدافعة المحدودة ولا تزال غير فعالة بالنسبة للأحبار عالية اللزوجة.
تم التحقق مبدئيا من جدوى إعداد الناقل الدقيق والتصاق الخلايا باستخدام طابعة AVIFJ 3D. وسيركز العمل اللاحق على التطبيقات المحتملة للناقلات الدقيقة في بناء النماذج البيولوجية. في الأبحاث المستقبلية ، سيتم تحسين عملية التصاق الخلايا بحيث يتم زيادة عدد الخلايا وأنواعها وإثرائها ، والتي من المتوقع أن تشكل نسيجا وظيفيا أو شبكة وعائية. إلى جانب ذلك ، سيتم طباعة الحبر الحيوي بشكل مشترك مع الخلايا لتشكيل وحدات هيكلية وظيفية غير متجانسة. يمكن أيضا تحميل الكبسولات الدقيقة والجسيمات الدقيقة وغيرها من الهياكل داخل الناقلات الدقيقة لتشكيل نموذج إطلاق دواء مستدام للاستخدام السريري. باختصار ، تم تطوير طريقة لبناء وحدات دقيقة للأنسجة ، والتي من المتوقع أن يتم توسيع نطاقها لتشكيل أنسجة دقيقة وظيفية في المختبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (3212007) ، وبرنامج البحث العلمي لمبادرة جامعة تسينغهوا (20197050024) ، وصندوق نسيم الربيع بجامعة تسينغهوا (20201080760) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (51805294) ، والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2018YFA0703004) ، ومشروع 111 (B17026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
