Summary
Hier wordt een milde 3D-printtechniek gepresenteerd die wordt aangedreven door afwisselend viskeuze-traagheidskrachten om de constructie van hydrogel-microdragers mogelijk te maken. Zelfgemaakte nozzles bieden flexibiliteit, waardoor eenvoudige vervanging voor verschillende materialen en diameters mogelijk is. Celbindende microdragers met een diameter van 50-500 μm kunnen worden verkregen en verzameld voor verdere kweek.
Abstract
Microdragers zijn kralen met een diameter van 60-250 μm en een groot specifiek oppervlak, die vaak worden gebruikt als dragers voor grootschalige celculturen. Microcarrier-cultuurtechnologie is uitgegroeid tot een van de belangrijkste technieken in cytologisch onderzoek en wordt vaak gebruikt op het gebied van grootschalige celexpansie. Van microdragers is ook aangetoond dat ze een steeds belangrijkere rol spelen bij de bouw van in vitro weefselmanipulatie en klinische screening van geneesmiddelen. Huidige methoden voor het voorbereiden van microcarriers omvatten microfluïdische chips en inkjetprinten, die vaak afhankelijk zijn van een complex stroomkanaalontwerp, een incompatibele tweefasige interface en een vaste nozzle-vorm. Deze methoden worden geconfronteerd met de uitdagingen van complexe nozzleverwerking, ongemakkelijke nozzle-veranderingen en overmatige extrusiekrachten wanneer toegepast op meerdere bioink. In deze studie werd een 3D-printtechniek, alternating viscous-inertial force jetting genoemd, toegepast om de constructie van hydrogel microcarriers met een diameter van 100-300 μm mogelijk te maken. Cellen werden vervolgens gezaaid op microdragers om tissue engineering modules te vormen. In vergelijking met bestaande methoden biedt deze methode een vrije diameter van de spuitmondpunt, flexibele nozzle-omschakeling, vrije controle van afdrukparameters en milde afdrukomstandigheden voor een breed scala aan bioactieve materialen.
Introduction
Microdragers zijn kralen met een diameter van 60-250 μm en een groot specifiek oppervlak en worden vaak gebruikt voor grootschalige kweek van cellen1,2. Hun buitenoppervlak biedt overvloedige groeiplaatsen voor cellen en het binnenste biedt een ondersteunende structuur voor ruimtelijke proliferatie. De bolvormige structuur biedt ook gemak bij het bewaken en regelen van parameters, waaronder pH, O2 en concentratie van voedingsstoffen en metabolieten. Bij gebruik in combinatie met bioreactoren met geroerde tanks kunnen microdragers hogere celdichtheden bereiken in een relatief klein volume in vergelijking met conventionele culturen, waardoor een kosteneffectieve manier wordt geboden om grootschalige culturen te bereiken3. Microcarrier-cultuurtechnologie is een van de belangrijkste technieken in cytologisch onderzoek geworden en er is veel vooruitgang geboekt op het gebied van grootschalige uitbreiding van stamcellen, hepatocyten, chondrocyten, fibroblasten en andere structuren4. Ze zijn ook ideale voertuigen voor medicijnafgifte en bottom-upeenheden gebleken, waardoor ze een steeds belangrijkere rol spelen bij klinische geneesmiddelenscreening en in vitro weefselmanipulatie5.
Om te voldoen aan de mechanische eigenschapseisen in verschillende scenario's, zijn meerdere soorten hydrogelmaterialen ontwikkeld voor gebruik bij de constructie van microdragers6,7,8,9,10,11. Hydrogels voor alginaat en hyaluronzuur (HA) zijn twee van de meest gebruikte microcarriermaterialen vanwege hun goede biocompatibiliteit en crosslinkbaarheid12,13. Alginaat kan gemakkelijk worden verknoopt door calciumchloride en de mechanische eigenschappen kunnen worden gemoduleerd door de cross-linking tijd te veranderen. Tyramine-geconjugeerde HA is verknoopt door de oxidatieve koppeling van tyraminemoieties gekatalyseerd door waterstofperoxide en mierikswortelperoxidase14. Collageen, vanwege zijn unieke spiraalstructuur en verknoopt vezelnetwerk, wordt vaak gebruikt als een adjuvans om zich in de microdragers te mengen om celaanhechting verder te bevorderen15,16.
Huidige methoden voor het voorbereiden van microdragers omvatten microfluïdische chips, inkjetprinten en elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Het is bewezen dat microfluïdische chips snel en efficiënt zijn in het produceren van microdragers van uniforme grootte24. Deze technologie is echter afhankelijk van een complex ontwerp- en fabricageproces van stroomkanalen25. Hoge temperatuur of overmatige extrusiekrachten tijdens inkjetprinten, evenals intense elektrische velden in de elektrospraybenadering, kunnen de eigenschappen van het materiaal, met name de biologische activiteit ervan, nadelig beïnvloeden19. Bovendien, wanneer toegepast op verschillende biomaterialen en diameters, resulteren de aangepaste nozzles die in deze methoden worden gebruikt in beperkte verwerkingscomplexiteit, hoge kosten en lage flexibiliteit.
Om een handige methode voor de voorbereiding van microcarriers te bieden, is een 3D-printtechniek genaamd alternating viscous-inertial forces jetting (AVIFJ) toegepast om hydrogel-microcarriers te bouwen. De techniek maakt gebruik van neerwaartse aandrijfkrachten en statische druk die wordt gegenereerd tijdens verticale trillingen om de oppervlaktespanning van de mondstukpunt te overwinnen en zo druppels te vormen. In plaats van zware krachten en thermische omstandigheden, werken kleine snelle verplaatsingen direct op het mondstuk tijdens het printen, waardoor een klein effect op de fysisch-chemische eigenschappen van de bioink wordt veroorzaakt en een grote aantrekkingskracht wordt uitgeoefend op bioactieve materialen. Met behulp van de AVIFJ-methode werden met succes microdragers van meerdere biomaterialen met diameters van 100-300 μm gevormd. Bovendien is verder bewezen dat de microdragers cellen goed binden en een geschikte groeiomgeving bieden voor gehechte cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek
- Supplement hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde Minimum Essential Medium (H-DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% niet-essentiële aminozuuroplossing (NEAA), 1% penicilline G en streptomycine, en 1% glutaminesupplement als kweekmedium voor A549-cellen.
- Kweek A549-cellen in een CO2-incubator bij 37 °C en met 5% CO2
- Dissocieer cellen voor subcultuur met behulp van trypsine bij ongeveer 80% confluentie.
- Gebruik 3 ml trypsine om de cellen in de T75-kweekkolf gedurende 3 minuten bij 37 °C te behandelen en voeg vervolgens 6 ml kweekmedium toe om de trypsinisatie te stoppen.
- Pipetteer het kweekmedium om losjes gehechte cellen te oogsten.
- Centrifugeer bij 72,5 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant en resuspend met 3 ml vers medium.
- Breng 1 ml celsuspensie over in een nieuwe T75-kweekkolf met 10 ml vers medium. Verander het cultuurmedium om de 2 dagen.
2. Voorbereiding van nozzles
- Plaats glazen micropipettes op de trekker volgens de instructies van de fabrikant. De buitendiameter, binnendiameter en lengte van de microstraalpijp zijn respectievelijk 1,5 mm, 1,1 mm en 100 mm.
- Stel de trekparameters voor de trekker in. Concreet zijn de waarden van HEAT, PULL, VELOCITY, TIME en PRESSURE standaard ingesteld op respectievelijk 560, 255, 255, 150 en 500. Trek het mondstuk onder deze parameters af.
LET OP: Het mondstuk dat wordt verkregen na het aftrekken is zeer scherp en een onzorgvuldige bediening kan verwondingen veroorzaken. - Snijd het resulterende mondstuk (stap 2.2) met de aangegeven diameter af met een microsmederijapparaat volgens de instructies van de fabrikant om een specifieke tipdiameter te verkrijgen. Zoek specifiek de opgegeven diameter van het mondstuk op de verwarmde platinadraad. Verwarm de draad tot 60 °C gedurende ongeveer 5 s en trek het mondstuk uit elkaar.
- Dompel de printkop van het mondstuk gedurende 30 minuten onder in een hydrofoob middel, gevolgd door drie spoelcycli met gesteriliseerd water.
- Steriliseer het mondstuk voor het afdrukken gedurende 5 minuten in alcohol en spoel het drie keer met gesteriliseerd water om de resterende alcohol te verwijderen.
3. Bereiding van hydrogel bioink
- Los NaCl (0,45 g) op in 50 ml steriel water om een NaCl-oplossing van 0,9% (met v) te verkrijgen. Tril de oplossing om ontbinding te bevorderen. Nadat de oplossing volledig is opgelost, filtert u de oplossing door een polyethyleentereftalaatfiltermembraan van 0,45 μm.
- Weeg natriumalginaatpoeder met lage viscositeit (1 g) af en los het 's nachts op in 25 ml NaCl-oplossing (stap 3.1) bij een hoge temperatuur van 60-80 °C om een 4% (w/v) natriumalginaatvoorraadoplossing te verkrijgen. De stamoplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Steriliseer de natriumalginaat-stamoplossing (stap 3.2) door deze driemaal gedurende 30 minuten in een oven (70 °C) te verwarmen.
- Verdun het juiste volume natriumalginaat-stamoplossing (stap 3.3) in 0,9% NaCl-oplossing (stap 3.1) in concentraties van 2%, 1,5% en 0,5% (w/v).
OPMERKING: Naast verwarming in de oven moeten andere bereidingsprocessen van natriumalginaatoplossing in de kap worden uitgevoerd. - Los 1 g gelatinepoeder op in 25 ml NaCl-oplossing (stap 3.1) bij een hoge temperatuur van 60-80 °C gedurende de nacht om een gelatinebouillonoplossing van 4% (g/v) te verkrijgen. De stamoplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Steriliseer de gelatine-stamoplossing (stap 3.5) door deze gedurende 30 minuten driemaal in een oven (70 °C) te verwarmen.
- Verdun het juiste volume gelatine-bouillonoplossing (stap 3.6) in 0,9% NaCl-oplossing (stap 3.1) in een concentratie van 1,5% (w/v).
OPMERKING: Naast verwarming in de oven moeten andere bereidingsprocessen van gelatine-oplossing in de kap worden uitgevoerd. - Om de celbinding op de microdragers te bevorderen, bereidt u de alginaat-collageenoplossing door de 2% (w / v) natriumalginaatoplossing en de type I collageenoplossing van rattenstaart (4 mg / ml) te mengen in een verhouding van 3: 1. Stel de oplossing in op pH 7,2 met 0,1 M NaOH-oplossing en gebruik deze onmiddellijk na bereiding.
- Los de met tyrosine gemodificeerde HA-flocculent vaste stof 's nachts op in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) bij 60-80 °C om een 0,8% m/w tyrosine-gemodificeerde hyaluronzuur PBS-oplossing te verkrijgen. De stamoplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Steriliseer de tyrosine-gemodificeerde HA PBS-oplossing door deze driemaal gedurende 30 minuten in een oven (70 °C) te verwarmen.
- Los mierikswortelperoxidasepoeder (500 enzymactiviteitseenheid/mg) op in PBS-oplossing om 8 enzymactiviteitseenheid/mg mierikswortelperoxidase PBS-oplossing te verkrijgen.
- Verdun waterstofperoxideoplossing (30%, g/m) met DI-water tot 4 mM.
- Bereid de gemodificeerde HA-mierikswortelperoxidaseoplossing door tyrosine-gemodificeerde hyaluronzuur PBS-oplossing en mierikswortelperoxidase PBS-oplossing te mengen in een verhouding van 1:1.
OPMERKING: Naast verwarming in de oven moeten andere bereidingsprocessen van HA-mierikswortelperoxidase-oplossing in de kap worden uitgevoerd.
4. Vorming van microdruppels op basis van AVIFJ
- Gebruik een thuis gevestigd celafdruksysteem zoals eerder gerapporteerd (figuur 1A)26. Het elektrische signaal dat door de golfvormgenerator wordt uitgevoerd, wordt eerst versterkt en drijft vervolgens piëzo-elektrisch keramiek aan om controleerbare vervorming te genereren. Het mondstuk dat op het piëzo-elektrische keramiek is bevestigd, produceert dus controleerbare trillingen.
- Steriliseer het printsysteem door 's nachts af te vegen met 75% (v/v) alcohol en ultraviolette (UV) blootstelling.
- Laad 5 ml bioink (stap 3.1) in een steriele wegwerpspuit. Installeer de spuit op de spuitpomp.
- Sluit de spuit (stap 4.3) en het mondstuk (stap 2.5) aan op een siliconenslang met een binnendiameter van 1 mm.
- Bevestig het voor het afdrukken te gebruiken mondstuk (stap 4.4) door de dichtheid van de klemschroef aan te passen. Houd de punt van het mondstuk tijdens de installatie uit de buurt van het substraat om schade en verontreiniging te voorkomen.
LET OP: Als het mondstuk tijdens de installatie kapot is, draag dan dikkere handschoenen en ruim glasfragmenten en resten zorgvuldig op. - Duw snel op de spuitpomp en laad de bioink (stap 4.3) in het mondstuk (stap 4.5). Stel het debiet in op 30 μL/min. Veeg het overtollige materiaal aan de punt af.
- Stel signaalgeneratorparameters in. Importeer zelfontworpen golfvorm met 500.000 bemonsteringspunten. Stel de bemonsteringsfrequentie en piek-tot-piekspanning (Vpp) in op respectievelijk 5 miljoen monsters/s en 10 V.
- Reinig dia's of petrischalen met gedeïoniseerd water. Plaats ze onder het mondstuk als afdruksubstraat.
- Stel het bewegingspad en de triggermodus van trillingen in als drop-on-demand.
- Print de druppels volgens de vooraf ontworpen patronen.
5. Vorming van microdragers op basis van AVIFJ
- Herhaal stap 4.1-4.4, behalve verander de bioink in 2% (w/v) alginaatoplossing (stap 3.4), alginaat-collageenoplossing (stap 3.8) of gemodificeerde HA-mierikswortelperoxidaseoplossing (stap 3.13).
- Los 3 g calciumchloride op in 100 ml steriel water om 3% (met v) calciumchlorideoplossing te verkrijgen. Nadat de oplossing volledig is opgelost, filtert u de oplossing door een polyethyleentereftalaatfiltermembraan van 0,45 μm.
- Voeg 5 ml crosslinking-oplossing (calciumchlorideoplossing of waterstofperoxideoplossing) toe aan een petrischaaltje. Plaats de petrischaal onder het mondstuk om als substraat te werken.
- Na het printen cross-link de microcarriers gedurende 3 min.
- Verzamel microcarrier suspensie in een centrifugebuis en verrijk microdragers door centrifugeren met 29 x g gedurende 3 minuten. Resuspend de microdragers in kweekmedia bij ongeveer 600 microdragers/ml.
6. Inenting van cellen op het oppervlak van microdragers
- Kleur A549-cellen met Cell Tracker Green CMFDA om de observatie van cellen te vergemakkelijken. Verwijder specifiek kweekmedia, voeg 5 ml serumvrij medium toe met 10 μM Cell Tracker-kleurstof en incubeer cellen gedurende 30 minuten in een incubator. Vervang vervolgens de verfoplossing door vers medium.
- Resuspend de A549-celsuspensie met een dichtheid van 1,6 x 106 cellen / ml.
- Voeg 1 ml alginaat-collageen microcarrier suspensie (stap 5.3) en 1 ml A549-celsuspensie (stap 6.1) toe aan een laagklevende 6-well kweekplaat.
- Plaats de plaat op een shaker bij 30 rpm in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Haal de plaat van de shaker en wacht 30 minuten om de microdragers te laten bezinken. De helft verandert het kweekmedium om de 2 dagen.
7. Analyse van de vorming van microdruppels/microdragers
- Observeer en meet het mondstuk (stap 2.2), de petrischalen (stap 4.10 en stap 5.4) en cellen met microdragers (stap 6.5) onder een heldere veldmicroscoop of confocale microscoop. Concreet is de objectieve vergroting 4x, 10x of 20x en de oculairvergroting is 10x.
- Meet de diameter van de microdragers met de ImageJ-software. Volgens de schaalbalk die bij de microscoop wordt geleverd bij het fotograferen, stelt u de werkelijke grootte van de schaal in ImageJ in en tekent u 10 lijnen van de straal of semi-grote as van de microdragers. ImageJ kan de gemiddelde grootte en standaarddeviatie van deze lijnsegmenten krijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Printkoppen met verschillende convergentiesnelheden en diameters werden vervaardigd om het afdrukken van meerdere soorten materialen te bereiken. De nozzles verkregen met toenemende trekkracht zijn weergegeven in figuur 1B. De nozzles waren verdeeld in drie gebieden: reservoir (III), contractie (II) en printkop (I). Het reservoir was het onbewerkte deel van het mondstuk, waarin de vloeistof statische druk en bioink-input leverde voor het afdrukken. Het krimpgebied was het belangrijkste onderdeel voor het genereren van neerwaartse drijvende krachten. De treksterkte had een significant effect op de printkop en toonde een lagere convergentiesnelheid met verlengde trekkracht. De smallere en langere printkop verhoogde de oppervlaktespanning tijdens het afdrukken, waardoor de vorming van discrete microdruppels moeilijker werd, maar vergemakkelijkte het snijden van tips met een kleinere diameter bij volgende bewerkingen. Daarna werd met het naaldsmeedinstrument de printkop afgesneden met de aangegeven diameter (figuur 1C). Tips met verschillende diameters, waaronder 100, 120, 150 en 200 μm, waren beschikbaar om microdragers van verschillende groottes te genereren, die voldoen aan de vereisten van verschillende in vitro microtissues.
De stabiliteit en controleerbaarheid van het drukproces werden eerst gecontroleerd door druppels op petrischalen te printen. Met een tipmondstuk van 30 μm werden meerdere bioink, waaronder PBS, 1,5% alginaat en 1,5% gelatine stabiel afgedrukt (figuur 2A,B). De moeilijkheid om een bepaalde bioink te printen kwam tot uiting in de bemonsteringsfrequentie en Vpp die voor het printen werd gebruikt. Bioink met een lage viscositeit zoals NaCl-oplossing werden geprint op kleinere parameters, wat resulteerde in kleinere druppeldiameters. Met toenemende viscositeit werd het drukproces navenant moeilijker, omdat de grotere aandrijfkrachten nodig waren en grotere druppels zouden verkrijgen (figuur 2B). Met dit mechanisme kan de aanpassing van parameters en aandrijfkrachten voor een bepaalde bioink worden gebruikt om verschillende druppelgroottes aan te passen, zoals weergegeven in figuur 2C. Figuur 2D toont de rangschikking van druppels die de specifieke letters "THU" vormen op een plat oppervlak. Bovendien maakte de combinatie van microscopische waarnemingen de lokalisatie van microdruppeltjes op kleinere schalen binnen 100 μm mogelijk.
Alginaat microdragers (figuur 3A) en HA microdragers (figuur 3C) werden geprint met uiteinden van verschillende diameters. De effecten van de tipdiameter op de diameter van de microdrager van het alginaat zijn weergegeven in figuur 3B. Beperkt door de verstopping veroorzaakt door de vervluchtiging van de oplossing wanneer de grootte te klein is, was de kleinste diameter van de geprinte alginaatmicrodragers ongeveer 100 μm. Terwijl de grootste diameter tot 300 μm kan oplopen. De diameter van de geprinte microdragers neemt toe in overeenstemming met de tipdiameter en is altijd groter dan de laatste. Wanneer de diameter van de tip groter is dan 250 μm, kan de bioink niet worden afgedrukt. De diameter van geprinte gemodificeerde HA-microdragers was 76,7 ± 1,8 μm met tipdiameters van 75 μm (figuur 3C).
A549-cellen en alginaat-collageen microdragers werden in een plaat gezaaid en op een shaker in de couveuse geplaatst. De cellen bleken zich te hechten aan de microdragers van alginaat-collageen na 2 dagen mengen. Cellen bedekken geleidelijk een groter oppervlak van microdragers door proliferatie. Na het kweken gedurende 6 dagen bedekten A549-cellen bijna volledig de microcarrieroppervlakken. Dit resultaat bevestigt dat de ontwikkelde microdragers cellen goed kunnen binden en een geschikte groeiomgeving voor de cellen kunnen bieden. Heldere veldbeelden en confocale beelden van A549-cellen die zich hechten en vermenigvuldigen op het oppervlak van de microdragers zijn weergegeven in figuur 4.
Figuur 1: Het AVIFJ-printsysteem en de voorbereiding van nozzles van verschillende diameters. (A) De installatie van AVIFJ-nozzle. (B) Onder specifieke PULL-parameters werd de printkop van het mondstuk gevormd om met verschillende snelheden te convergeren. Schaalbalk: 200 μm. (C) Met het naaldsmeedinstrument werd de punt op aangewezen posities afgesneden. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afdrukken van meerdere soorten biomaterialen in verschillende concentraties door AVIFJ. (A) Het mondstuk dat in dit gedeelte van de resultaten wordt gebruikt. De diameter van de tip was 30 μm. Schaalbalk: 100 μm. (B) Afdrukken van meerdere soorten hydrogelmaterialen, waaronder PBS, 1,5% alginaat en 1,5% gelatine bij verschillende parameters. M: een miljoen monsters per seconde, die de duur van een enkele trilling weergeven. V: piek-tot-piekspanning, die de slag van een enkele trilling weergeeft. Schaalbalk: 100 μm. (C) Het afdrukken van 0,5% alginaat bij verschillende parameters. Schaalbalk: 100 μm. D) 2D-opstellingen en nauwe plaatsing van druppels. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Microdragers bedrukt met verschillende diameters van de mondstukpunt. (A) 2% alginaat microdragers, bedrukt met nozzle tip diameters op respectievelijk 70, 100, 130, 160, 210 en 250 μm. Schaalbalk: 100 μm. (B) Effect van de diameter van de spuitmondpunt op de grootte van microdragers. De afmetingen van de microdragers geprint met nozzles van verschillende diameters werden statistisch geanalyseerd met behulp van ImageJ-software. Voor elk mondstuk werden tien microdragers geselecteerd en berekend. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± s.d. (C) Geprinte gemodificeerde HA-microdragers met tipdiameters bij 75 μm. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Zaaicellen op alginaat-collageen microdragers. (A) Heldere veldbeelden van A549-cellen die zich hechten en vermenigvuldigen op het oppervlak van de microdragers. Schaalbalk: 100 μm. (B) Confocale beelden van A549-cellen die zich hechten en vermenigvuldigen op het oppervlak van de microdragers. Schaalbalk: 100 μm. Gestippelde ellipsen worden gebruikt om de rand van microdragers te markeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol geeft instructies voor de bereiding van multi-types hydrogel microcarriers en daaropvolgende celzaaien. In vergelijking met microfluïdische chip- en inkjetprintmethoden biedt de AVIFJ-benadering voor het bouwen van microdragers meer flexibiliteit en biocompatibiliteit. Een onafhankelijk mondstuk maakt het mogelijk om een breed scala aan lichtgewicht nozzles, waaronder glazen micropipettes, te gebruiken in deze printsystemen. De zeer controleerbare verwerking maakt het mogelijk om parameters zoals het volume van het reservoir, de binnendiameter en de vorm van de printkop vrij aan te passen. Bovendien vergemakkelijkt het wegwerpmondstuk sterilisatie voor het schakelen tussen meerdere materialen, wat mogelijke verontreiniging door herhaald gebruik voorkomt. Ten slotte werken kleine en snelle verplaatsingen, in plaats van zware krachten en thermische omstandigheden, direct op het mondstuk tijdens het drukproces, waarbij de oorspronkelijke fysische en chemische eigenschappen van de geprinte bioink maximaal behouden blijven; deze functie is zeer aantrekkelijk voor biomateriaaltoepassingen.
De meest kritieke stappen voor een succesvolle productie van microdragers van de juiste grootte zijn: 1) Het voorbereiden van nozzles met tips met de juiste diameters en 2) het aanpassen van de geschikte bemonsteringssnelheid en Vpp aan de viscositeit van de geprinte bioink. De stabiliteit van de microcarrierconstructie wordt verder bereikt door satellietdruppels te verwijderen en externe aandrijfkrachten toe te passen. De verhoogde parameters vergemakkelijken de vorming van microdragers, maar overmatige drijvende krachten zijn de belangrijkste reden voor de vorming van satellietmicrocarriers, wat resulteert in een inhomogene microdragergrootte. Om de uniformiteit van de grootte van de microdrager te verbeteren, wordt daarom aanbevolen om geschikte (niet buitensporige) bemonsteringsfrequenties en Vpp te gebruiken. Een ander aspect voor het verbeteren van de stabiliteit van microcarriers is de toepassing van externe aandrijfkrachten. De externe aandrijfkrachten vullen de statische druk en neerwaartse drijvende krachten aan en werken samen om de oppervlaktespanning aan de punt te overwinnen. Er werd geëxperimenteerd met het duwen van een spuitpomp om het mondstuk en extra extra duwkrachten te voeden. In het bijzonder was het mondstuk verbonden met een spuit, waarvan de druksnelheid werd aangepast door een precisiespuitpomp. Met deze methode kon dezelfde concentratie hydrogeloplossing microdruppels vormen met beperkte parameters, wat gunstig is voor het verminderen van de grootte van de microdragers. Andere studies hebben het gebruik van elektrostatische velden of knijpreservoirs gemeld om het afdrukken van microdruppels te bevorderen27,28.
Hoewel het toepassen van externe aandrijfkrachten naar verwachting het bereik van soorten en concentraties van bedrukbare inkten zal verbreden, wordt de druktechniek die hier wordt gebruikt nog steeds geconfronteerd met de uitdaging van beperkte drijvende krachten en is deze nog steeds niet effectief voor inkten met een hoge viscositeit.
De haalbaarheid van microcarriervoorbereiding en celhechting met behulp van een AVIFJ 3D-printer werd voorlopig geverifieerd. Het volgende werk zal zich richten op de mogelijke toepassingen van de microdragers bij de constructie van biologische modellen. In toekomstig onderzoek zal het celadhesieproces worden geoptimaliseerd, zodat het aantal en de soorten cellen verder worden verhoogd en verrijkt, wat naar verwachting een functioneel weefsel of vasculair netwerk zal vormen. Daarnaast zal bioink verder worden geco-geprint met cellen om functionele heterogene structurele eenheden te vormen. Microcapsules, microdeeltjes en andere structuren kunnen ook in de microdragers worden geladen om een model voor langdurige medicijnafgifte te vormen voor klinisch gebruik. Samenvattend is er een methode ontwikkeld voor het construeren van weefselmicro-eenheden, die naar verwachting zullen worden opgeschaald om in vitro functionele microweefsels te vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), de National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) en het 111 Project (B17026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
