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Bioengineering

इन विट्रो हाइड्रोजेल माइक्रोकैरियर्स की 3 डी प्रिंटिंग बारी-बारी से चिपचिपा-जड़त्वीय बल जेटिंग द्वारा

Published: April 21, 2021 doi: 10.3791/62252
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Biomanufacturing Center, Dept. of Mechanical Engineering, Tsinghua University, 2Biomanufacturing and Rapid Forming Technology Key Laboratory of Beijing, 3Department of Mechanical Engineering, Drexel University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत एक हल्के 3 डी प्रिंटिंग तकनीक है जो हाइड्रोजेल माइक्रोकैरियर के निर्माण को सक्षम करने के लिए बारी-बारी से चिपचिपा-जड़त्वीय बलों द्वारा संचालित है। घर का बना नोजल लचीलापन प्रदान करते हैं, जिससे विभिन्न सामग्रियों और व्यास के लिए आसान प्रतिस्थापन की अनुमति मिलती है। 50-500 μm के व्यास के साथ सेल बाइंडिंग माइक्रोकैरियर प्राप्त किए जा सकते हैं और आगे की खेती के लिए एकत्र किए जा सकते हैं।

Abstract

माइक्रोकैरियर 60-250 μm के व्यास और एक बड़े विशिष्ट सतह क्षेत्र के साथ मोती होते हैं, जो आमतौर पर बड़े पैमाने पर सेल संस्कृतियों के लिए वाहक के रूप में उपयोग किए जाते हैं। माइक्रोकैरियर संस्कृति प्रौद्योगिकी साइटोलॉजिकल अनुसंधान में मुख्य तकनीकों में से एक बन गई है और आमतौर पर बड़े पैमाने पर सेल विस्तार के क्षेत्र में उपयोग की जाती है। माइक्रोकैरियर्स को इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग निर्माण और नैदानिक दवा स्क्रीनिंग में तेजी से महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए भी दिखाया गया है। माइक्रोकैरियर तैयार करने के लिए वर्तमान तरीकों में माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स और इंकजेट प्रिंटिंग शामिल हैं, जो अक्सर जटिल प्रवाह चैनल डिजाइन, एक असंगत दो-चरण इंटरफ़ेस और एक निश्चित नोजल आकार पर भरोसा करते हैं। इन तरीकों को जटिल नोजल प्रसंस्करण, असुविधाजनक नोजल परिवर्तन, और अत्यधिक बाहर निकालना बलों की चुनौतियों का सामना करना पड़ता है जब कई बायोइंक पर लागू किया जाता है। इस अध्ययन में, एक 3 डी प्रिंटिंग तकनीक, जिसे वैकल्पिक चिपचिपा-जड़त्वीय बल जेटिंग कहा जाता है, को 100-300 μm के व्यास के साथ हाइड्रोजेल माइक्रोकैरियर के निर्माण को सक्षम करने के लिए लागू किया गया था। कोशिकाओं को बाद में ऊतक इंजीनियरिंग मॉड्यूल बनाने के लिए माइक्रोकैरियर पर बीज दिया गया था। मौजूदा तरीकों की तुलना में, यह विधि एक मुफ्त नोजल टिप व्यास, लचीला नोजल स्विचिंग, प्रिंटिंग पैरामीटर का मुक्त नियंत्रण, और बायोएक्टिव सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए हल्के मुद्रण की स्थिति प्रदान करती है।

Introduction

माइक्रोकैरियर 60-250 μm के व्यास और एक बड़े विशिष्ट सतह क्षेत्र के साथ मोती होते हैं और आमतौर पर कोशिकाओं की बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए उपयोग किए जाते हैं1,2। उनकी बाहरी सतह कोशिकाओं के लिए प्रचुर मात्रा में विकास स्थल प्रदान करती है, और इंटीरियर स्थानिक प्रसार के लिए एक समर्थन संरचना प्रदान करता है। गोलाकार संरचना पीएच, ओ 2, और पोषक तत्वों और चयापचयों की एकाग्रता सहित मापदंडों की निगरानी और नियंत्रण में भी सुविधा प्रदान करती है। जब उत्तेजित टैंक बायोरिएक्टर के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो माइक्रोकैरियर पारंपरिक संस्कृतियों की तुलना में अपेक्षाकृत कम मात्रा में उच्च सेल घनत्व प्राप्त कर सकते हैं, जिससे बड़े पैमाने पर संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका प्रदान किया जा सकता है3। माइक्रोकैरियर संस्कृति प्रौद्योगिकी साइटोलॉजिकल अनुसंधान में मुख्य तकनीकों में से एक बन गई है, और स्टेम कोशिकाओं, हेपेटोसाइट्स, चोंड्रोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स और अन्य संरचनाओं के बड़े पैमाने पर विस्तार के क्षेत्र में बहुत प्रगति हुई है। उन्हें आदर्श दवा वितरण वाहनों और बॉटम-अप इकाइयों के रूप में भी पाया गया है, इसलिए नैदानिक दवा स्क्रीनिंग और इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग मरम्मत 5 में तेजी से महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं।

विभिन्न परिदृश्यों में यांत्रिक संपत्ति आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, माइक्रोकैरियर्स 6,7,8,9,10,11 के निर्माण में उपयोग के लिए कई प्रकार की हाइड्रोजेल सामग्री विकसित की गई है। Alginate और hyaluronic एसिड (एचए) hydrogels उनके अच्छे biocompatibility और crosslinkability12,13 के कारण सबसे अधिक इस्तेमाल किया माइक्रोकैरियर सामग्री में से दो हैं। एल्गिनेट को कैल्शियम क्लोराइड द्वारा आसानी से क्रॉस-लिंक किया जा सकता है, और इसके यांत्रिक गुणों को क्रॉस-लिंकिंग समय को बदलकर संशोधित किया जा सकता है। Tyramine-संयुग्मित HA हाइड्रोजन पेरोक्साइड और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज 14 द्वारा उत्प्रेरित tyramine moieties के ऑक्सीडेटिव युग्मन द्वारा क्रॉस-लिंक किया गया है। कोलेजन, इसकी अद्वितीय सर्पिल संरचना और क्रॉस-लिंक्ड फाइबर नेटवर्क के कारण, अक्सर सेल अनुलग्नक 15,16 को बढ़ावा देने के लिए माइक्रोकैरियर में मिश्रण करने के लिए एक सहायक के रूप में उपयोग किया जाता है।

माइक्रोकैरियर तैयार करने के लिए वर्तमान तरीकों में माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स, इंकजेट प्रिंटिंग और इलेक्ट्रोस्प्रे 17,18,19,20,21,22,23 शामिल हैं। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को समान आकार के माइक्रोकैरियर24 के उत्पादन में तेज और कुशल साबित किया गया है। हालांकि, यह तकनीक एक जटिल प्रवाह चैनल डिजाइन और निर्माण प्रक्रिया 25 पर निर्भर करती है। इंकजेट प्रिंटिंग के दौरान उच्च तापमान या अत्यधिक एक्सट्रूज़न बलों, साथ ही इलेक्ट्रोस्प्रे दृष्टिकोण में तीव्र विद्युत क्षेत्र, सामग्री के गुणों को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकते हैं, विशेष रूप से इसकी जैविक गतिविधि 19। इसके अलावा, जब विभिन्न biomaterials और व्यास के लिए लागू किया जाता है, तो इन तरीकों में उपयोग किए जाने वाले अनुकूलित नलिकाओं के परिणामस्वरूप सीमित प्रसंस्करण जटिलता, उच्च लागत और कम लचीलापन होता है।

माइक्रोकैरियर तैयारी के लिए एक सुविधाजनक विधि प्रदान करने के लिए, हाइड्रोजेल माइक्रोकैरियर के निर्माण के लिए वैकल्पिक चिपचिपा-जड़त्वीय बल जेटिंग (एवीआईएफजे) नामक एक 3 डी प्रिंटिंग तकनीक लागू की गई है। तकनीक नोजल टिप की सतह के तनाव को दूर करने के लिए ऊर्ध्वाधर कंपन के दौरान उत्पन्न नीचे की ओर ड्राइविंग बलों और स्थैतिक दबाव का उपयोग करती है और इस प्रकार बूंदों का निर्माण करती है। गंभीर बलों और थर्मल स्थितियों के बजाय, छोटे तेजी से विस्थापन सीधे मुद्रण के दौरान नोजल पर कार्य करते हैं, जिससे बायोइंक के भौतिक-रासायनिक गुणों पर मामूली प्रभाव पड़ता है और बायोएक्टिव सामग्री के लिए महान आकर्षण प्रस्तुत होता है। AVIFJ विधि का उपयोग करते हुए, 100-300 μm के व्यास के साथ कई biomaterials के microcarriers सफलतापूर्वक गठन किया गया था। इसके अलावा, माइक्रोकैरियर्स को कोशिकाओं को अच्छी तरह से बांधने और पालन की गई कोशिकाओं के लिए एक उपयुक्त विकास वातावरण प्रदान करने के लिए साबित किया गया था।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. पूरक उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एच-DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% nonessential अमीनो एसिड समाधान (NEAA), 1% पेनिसिलिन जी और streptomycin, और A549 कोशिकाओं के लिए संस्कृति मीडिया के रूप में 1% Glutamine पूरक के साथ।
  2. संस्कृति A549 कोशिकाओं में एक CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% CO2 के साथ
  3. लगभग 80% संगम पर ट्रिप्सिन का उपयोग करके उपसंस्कृति के लिए कोशिकाओं को अलग करें।
    1. T75 संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं का इलाज करने के लिए ट्रिप्सिन के 3 मिलीलीटर का उपयोग करें 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, और फिर ट्रिप्सिनाइजेशन को रोकने के लिए 6 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    2. पिपेट संस्कृति माध्यम शिथिल रूप से पालन कोशिकाओं की कटाई के लिए।
    3. 3 मिनट के लिए 72.5 x g पर सेंट्रीफ्यूज। supernatant निकालें और ताजा माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ resuspend.
    4. एक नए T75 संस्कृति फ्लास्क जिसमें 10 मिलीलीटर ताजा माध्यम होता है, में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर स्थानांतरित करें। हर 2 दिनों में संस्कृति माध्यम बदलें।

2. नलिका की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए खींचने पर ग्लास माइक्रोपिपेट्स लोड करें। माइक्रो-जेट पाइप का बाहरी व्यास, आंतरिक व्यास और लंबाई क्रमशः 1.5 मिमी, 1.1 मिमी और 100 मिमी है।
  2. पुलर के लिए पुलिंग पैरामीटर सेट करें। विशेष रूप से, HEAT, PULL, VELOCITY, TIME और PRESSURE के मान क्रमशः 560, 255, 255, 150 और 500 डिफ़ॉल्ट रूप से सेट किए गए हैं। इन मापदंडों के तहत नोजल को खींचें।
    सावधानी: खींचने के बाद प्राप्त नोजल बहुत तेज है, और लापरवाह ऑपरेशन चोटों का कारण बन सकता है।
  3. एक विशिष्ट टिप व्यास प्राप्त करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक माइक्रो-फोर्ज डिवाइस द्वारा नामित व्यास पर परिणामी नोजल (चरण 2.2) को काट लें। विशेष रूप से, गर्म प्लैटिनम तार पर नोजल के निर्दिष्ट व्यास का पता लगाएं। लगभग 5 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक तार को गर्म करें और नोजल को अलग करें।
  4. 30 मिनट के लिए एक हाइड्रोफोबिक एजेंट में नोजल के प्रिंटहेड को विसर्जित करें, इसके बाद निष्फल पानी के साथ कुल्ला करने के तीन चक्र।
  5. मुद्रण से पहले, 5 मिनट के लिए अल्कोहल में नोजल को निष्फल करें और अवशिष्ट अल्कोहल को हटाने के लिए इसे तीन बार निष्फल पानी से कुल्ला करें।

3. हाइड्रोजेल bioink की तैयारी

  1. एक 0.9% (w / v) NaCl समाधान प्राप्त करने के लिए बाँझ पानी के 50 मिलीलीटर में NaCl (0.45 g) को भंग करें। विघटन को बढ़ावा देने के लिए समाधान कंपन। पूरी तरह से भंग होने के बाद, एक 0.45 μm polyethylene terephthalate फिल्टर झिल्ली के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
  2. कम चिपचिपाहट सोडियम alginate पाउडर (1 ग्राम) वजन और एक 4% (डब्ल्यू / वी) सोडियम alginate स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए रात भर में 60-80 डिग्री सेल्सियस के एक उच्च तापमान पर NaCl समाधान (चरण 3.1) के 25 मिलीलीटर में भंग। स्टॉक समाधान को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. सोडियम एल्जिनेट स्टॉक समाधान (चरण 3.2) को 30 मिनट के लिए ओवन (70 डिग्री सेल्सियस) में तीन बार गर्म करके निष्फल करें।
  4. 0.9% NaCl समाधान (चरण 3.1) में सोडियम एल्गिनेट स्टॉक समाधान (चरण 3.3) की उचित मात्रा को 2%, 1.5%, और 0.5% (w / v) की सांद्रता पर पतला करें।
    नोट: ओवन में हीटिंग के अलावा, सोडियम एल्गिनेट समाधान की अन्य तैयारी प्रक्रियाओं को हुड में किया जाना चाहिए।
  5. 4% (डब्ल्यू / वी) जिलेटिन स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए रात भर में 60-80 डिग्री सेल्सियस के उच्च तापमान पर NaCl समाधान (चरण 3.1) के 25 मिलीलीटर में जिलेटिन पाउडर के 1 ग्राम को भंग करें। स्टॉक समाधान को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. जिलेटिन स्टॉक समाधान (चरण 3.5) को 30 मिनट के लिए ओवन (70 डिग्री सेल्सियस) में तीन बार गर्म करके स्टरलाइज़ करें।
  7. 0.9% NaCl समाधान (चरण 3.1) में जिलेटिन स्टॉक समाधान (चरण 3.6) की उचित मात्रा को 1.5% (w / v) की एकाग्रता पर पतला करें।
    नोट: ओवन में हीटिंग के अलावा, जिलेटिन समाधान की अन्य तैयारी प्रक्रियाओं को हुड में किया जाना चाहिए।
  8. माइक्रोकैरियर्स पर सेल बाइंडिंग को बढ़ावा देने के लिए, 2% (डब्ल्यू / वी) सोडियम एल्जिनेट समाधान और चूहे की पूंछ (4 मिलीग्राम / एमएल) से टाइप I कोलेजन समाधान को 3: 1 के अनुपात में मिलाकर एल्जिनेट-कोलेजन समाधान तैयार करें। 0.1 M NaOH समाधान के साथ पीएच 7.2 के लिए समाधान को समायोजित करें और तैयारी के तुरंत बाद उपयोग करें।
  9. 60-80 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान में tyrosine-संशोधित HA flocculent ठोस को रात भर में भंग करने के लिए एक 0.8% w / w tyrosine-संशोधित hyaluronic एसिड PBS समाधान प्राप्त करने के लिए। स्टॉक समाधान को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  10. 30 मिनट के लिए एक ओवन (70 डिग्री सेल्सियस) में तीन बार गर्म करके टायरोसिन-संशोधित एचए पीबीएस समाधान को निष्फल करें।
  11. 8 एंजाइम गतिविधि इकाई / मिलीग्राम हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज पीबीएस समाधान प्राप्त करने के लिए पीबीएस समाधान में हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज पाउडर (500 एंजाइम गतिविधि इकाई / मिलीग्राम) को भंग करें।
  12. डीआई पानी द्वारा हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान (30%, डब्ल्यू / डब्ल्यू) को 4 एमएम तक पतला करें।
  13. 1: 1 के अनुपात में tyrosine-संशोधित hyaluronic एसिड PBS समाधान और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज PBS समाधान मिश्रण द्वारा संशोधित HA-horseradish पेरोक्सीडेज समाधान तैयार करें।
    नोट: ओवन में हीटिंग के अलावा, एचए-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज समाधान की अन्य तैयारी प्रक्रियाओं को हुड में किया जाना चाहिए।

4. AVIFJ पर आधारित Microdroplets गठन

  1. पहले रिपोर्ट किए गए (चित्र 1A)26 के अनुसार एक घर-स्थापित कक्ष मुद्रण प्रणाली का उपयोग करें. तरंग जनरेटर द्वारा विद्युत संकेत उत्पादन पहले प्रवर्धित है और फिर नियंत्रणीय विरूपण उत्पन्न करने के लिए piezoelectric सिरेमिक ड्राइव. इस प्रकार पीजोइलेक्ट्रिक सिरेमिक पर तय नोजल नियंत्रणीय कंपन पैदा करता है।
  2. रात भर 75% (वी / वी) अल्कोहल और पराबैंगनी (यूवी) एक्सपोजर के साथ पोंछकर प्रिंटिंग सिस्टम को निष्फल करें।
  3. एक डिस्पोजेबल बाँझ सिरिंज में bioink (चरण 3.1) के 5 mL लोड करें। सिरिंज पंप पर सिरिंज स्थापित करें।
  4. सिरिंज (चरण 4.3) और नोजल (चरण 2.5) को 1 मिमी आंतरिक व्यास के सिलिकॉन नली के साथ कनेक्ट करें।
  5. क्लैंपिंग पेंच की जकड़न को समायोजित करके मुद्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले नोजल (चरण 4.4) को ठीक करें। क्षति और संदूषण से बचने के लिए स्थापना के दौरान नोजल की नोक को सब्सट्रेट से दूर रखें।
    चेतावनी: यदि नोजल स्थापना के दौरान टूट गया है, तो कृपया मोटे दस्ताने पहनें और कांच के टुकड़ों और अवशेषों को सावधानीपूर्वक साफ करें।
  6. तेजी से सिरिंज पंप धक्का और नोजल (चरण 4.5) के लिए bioink (चरण 4.3) लोड. 30 μL/min पर प्रवाह दर सेट करें. टिप पर अतिरिक्त सामग्री को पोंछ लें।
  7. सिग्नल जनरेटर पैरामीटर सेट करें. आयात स्व डिजाइन तरंग 500,000 नमूना अंक युक्त. नमूना दर और पीक-टू-पीक वोल्टेज (वीपीपी) को क्रमशः 5 मिलियन नमूनों / एस और 10 वी के रूप में सेट करें।
  8. विआयनीकृत पानी के साथ स्लाइड या पेट्री व्यंजन साफ करें। उन्हें मुद्रण सब्सट्रेट के रूप में नोजल के नीचे रखें।
  9. गति पथ और ड्रॉप-ऑन-डिमांड के रूप में कंपन के ट्रिगर मोड को प्रीसेट करें।
  10. पूर्व-डिज़ाइन किए गए पैटर्न के बाद बूंदों को मुद्रित करें।

5. AVIFJ पर आधारित माइक्रोकैरियर्स गठन

  1. चरण 4.1-4.4 को दोहराएं, सिवाय बायोइंक को 2% (डब्ल्यू / वी) एल्गिनेट समाधान (चरण 3.4), एल्गिनेट-कोलेजन समाधान (चरण 3.8), या संशोधित एचए-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज समाधान (चरण 3.13) में बदलने के अलावा।
  2. 3 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड को 3% (डब्ल्यू / वी) कैल्शियम क्लोराइड समाधान प्राप्त करने के लिए बाँझ पानी के 100 मिलीलीटर में भंग करें। पूरी तरह से भंग होने के बाद, एक 0.45 μm polyethylene terephthalate फिल्टर झिल्ली के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
  3. एक पेट्री डिश में क्रॉस-लिंकिंग समाधान (कैल्शियम क्लोराइड समाधान या हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान) के 5 मिलीलीटर जोड़ें। एक सब्सट्रेट के रूप में काम करने के लिए नोजल के नीचे पेट्री डिश रखें।
  4. प्रिंटिंग के बाद, 3 मिनट के लिए माइक्रोकैरियर्स को क्रॉस-लिंक करें।
  5. एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में माइक्रोकैरियर निलंबन ले लीजिए, और 3 मिनट के लिए 29 x g पर centrifugation द्वारा microcarriers समृद्ध। लगभग 600 माइक्रोकैरियर / एमएल पर संस्कृति मीडिया में माइक्रोकैरियर्स को फिर से निलंबित कर दिया।

6. माइक्रोकैरियर की सतह पर कोशिकाओं को संक्रमित करना

  1. कोशिकाओं के अवलोकन की सुविधा के लिए सेल ट्रैकर ग्रीन CMFDA के साथ A549 कोशिकाओं दाग. विशेष रूप से, संस्कृति मीडिया को हटा दें, सीरम-मुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें जिसमें 10 μM सेल ट्रैकर डाई शामिल है, और एक इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर, ताजा माध्यम के साथ डाई समाधान को बदलें।
  2. 1.6 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर A549 सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें।
  3. Alginate-कोलेजन माइक्रोकैरियर निलंबन (चरण 5.3) और A549 सेल निलंबन (चरण 6.1) के 1 मिलीलीटर के 1 मिलीलीटर को कम-अनुयायी 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में जोड़ें।
  4. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर में 30 आरपीएम पर एक शेकर पर रखें।
  5. शेकर से प्लेट लें और माइक्रोकैरियर्स को बसने देने के लिए 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें। आधे हर 2 दिनों में संस्कृति माध्यम बदलते हैं।

7. माइक्रोड्रॉपलेट्स / माइक्रोकैरियर गठन का विश्लेषण

  1. नोजल (चरण 2.2), पेट्री व्यंजन (चरण 4.10 और चरण 5.4) का निरीक्षण और मापें, और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोकैरियर (चरण 6.5) के साथ कोशिकाएं। विशेष रूप से, उद्देश्य आवर्धन 4x, 10x, या 20x है और आईपीस आवर्धन 10x है।
  2. ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा microcarriers के व्यास को मापने. चित्र में शूटिंग करते समय माइक्रोस्कोप के साथ आने वाले स्केल बार के अनुसार, इमेजजे में पैमाने का वास्तविक आकार सेट करें, और माइक्रोकैरियर्स की त्रिज्या या अर्ध-प्रमुख अक्ष की 10 रेखाएं खींचें। ImageJ इन लाइन खंडों का औसत आकार और मानक विचलन प्राप्त कर सकता है।

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Representative Results

विभिन्न अभिसरण दरों और व्यास के प्रिंटहेड्स को कई प्रकार की सामग्रियों के मुद्रण को प्राप्त करने के लिए गढ़ा गया था। पुल की ताकत बढ़ाने के साथ प्राप्त नलिकाओं को चित्र 1B में दिखाया गया है। नोजल को तीन क्षेत्रों में विभाजित किया गया था: जलाशय (III), संकुचन (II), और प्रिंटहेड (I)। जलाशय नोजल का असंसाधित हिस्सा था, जिसमें तरल ने मुद्रण के लिए स्थैतिक दबाव और बायोइंक इनपुट प्रदान किया था। संकुचन क्षेत्र नीचे की ओर ड्राइविंग बलों को उत्पन्न करने के लिए मुख्य हिस्सा था। पुल की ताकत का प्रिंटहेड पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा, जो विस्तारित पुल ताकत के साथ कम अभिसरण दर का प्रदर्शन करता है। संकीर्ण और लंबे समय तक प्रिंटहेड ने मुद्रण के दौरान सतह के तनाव को बढ़ा दिया, जिससे असतत माइक्रोड्रॉपलेट्स का गठन अधिक कठिन हो गया, लेकिन बाद के संचालन में छोटे व्यास के सुझावों को काटने की सुविधा मिली। बाद में, सुई फोर्जिंग इंस्ट्रूमेंट के साथ, प्रिंटहेड को निर्दिष्ट व्यास (चित्रा 1 सी) पर काट दिया गया था। 100, 120, 150, और 200 μm सहित विभिन्न व्यास के साथ युक्तियाँ, विभिन्न आकारों के माइक्रोकैरियर उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध थीं, जो विभिन्न इन विट्रो माइक्रोटिस्यू की आवश्यकताओं को पूरा करती थीं।

मुद्रण प्रक्रिया की स्थिरता और नियंत्रण क्षमता को पहले पेट्री व्यंजनों पर बूंदों को मुद्रित करके सत्यापित किया गया था। एक 30 μm टिप नोजल के साथ, पीबीएस, 1.5% एल्गिनेट, और 1.5% जिलेटिन सहित कई बायोइंक को स्थिर रूप से मुद्रित किया गया था (चित्रा 2 ए, बी)। एक निश्चित बायोइंक को मुद्रित करने की कठिनाई नमूना दर और मुद्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले वीपीपी में परिलक्षित होती थी। NaCl समाधान जैसे कम चिपचिपाहट बायोइंक को छोटे मापदंडों पर मुद्रित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप छोटे बूंद व्यास होते थे। बढ़ती चिपचिपाहट के साथ, मुद्रण प्रक्रिया तदनुसार अधिक कठिन हो गई, क्योंकि अधिक ड्राइव बलों की आवश्यकता थी और बड़ी बूंदें प्राप्त होंगी (चित्रा 2 बी)। इस तंत्र के साथ, किसी दिए गए बायोइंक के लिए पैरामीटर और ड्राइव बलों के समायोजन का उपयोग विभिन्न बूंद आकारों को समायोजित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 2 सी में दिखाया गया है। चित्र 2D एक सपाट सतह पर विशिष्ट अक्षर "THU" बनाने वाली बूंदों की व्यवस्था को दर्शाता है। इसके अलावा, माइक्रोस्कोपिक टिप्पणियों के संयोजन ने 100 μm के भीतर छोटे पैमाने पर माइक्रोड्रॉपलेट्स के स्थानीयकरण के लिए अनुमति दी।

Alginate माइक्रोकैरियर (चित्रा 3A) और एचए माइक्रोकैरियर (चित्रा 3 C) को विभिन्न व्यासों के सुझावों के साथ मुद्रित किया गया था। alginate माइक्रोकैरियर व्यास पर टिप व्यास के प्रभाव चित्र 3B में दिखाए गए हैं। समाधान के वाष्पीकरण के कारण रुकावट द्वारा सीमित जब आकार बहुत छोटा होता है, तो मुद्रित एल्जिनेट माइक्रोकैरियर का सबसे छोटा व्यास लगभग 100 μm था। जबकि सबसे बड़ा व्यास 300 μm तक पहुंच सकता है। मुद्रित माइक्रोकैरियर का व्यास टिप व्यास के अनुरूप बढ़ता है और हमेशा बाद की तुलना में बड़ा होता है। जब टिप का व्यास 250 μm से बड़ा होता है, तो बायोइंक को मुद्रित नहीं किया जा सकता है। मुद्रित संशोधित एचए माइक्रोकैरियर्स का व्यास 76.7 ± 1.8 μm था जिसमें 75 μm (चित्रा 3C) के टिप व्यास थे।

A549 कोशिकाओं और alginate-कोलेजन microcarriers एक प्लेट में seeded थे और इनक्यूबेटर में एक शेकर पर रखा गया था। कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए मिश्रण के बाद एल्गिनेट-कोलेजन माइक्रोकैरियर का पालन करने के लिए देखा गया था। कोशिकाएं उत्तरोत्तर प्रसार द्वारा माइक्रोकैरियर की बड़ी सतह को कवर करती हैं। 6 दिनों के लिए खेती के बाद, A549 कोशिकाओं ने लगभग पूरी तरह से माइक्रोकैरियर सतहों को कवर किया। यह परिणाम इस बात की पुष्टि करता है कि विकसित माइक्रोकैरियर कोशिकाओं को अच्छी तरह से बांध सकते हैं और कोशिकाओं के लिए एक उपयुक्त विकास वातावरण प्रदान कर सकते हैं। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों और A549 कोशिकाओं के confocal छवियों का पालन और microcarriers की सतह पर proliferating चित्र4 में दिखाया गया है.

Figure 1
चित्र 1: AVIFJ प्रिंटिंग सिस्टम और विभिन्न व्यास के नलिका की तैयारी। (A) AVIFJ नोजल की स्थापना। (बी) विशिष्ट पुल मापदंडों के तहत, नोजल के प्रिंटहेड को विभिन्न दरों पर अभिसरण करने के लिए आकार दिया गया था। स्केल बार: 200 μm. (सी) सुई फोर्जिंग उपकरण के साथ, टिप को निर्दिष्ट पदों पर काट दिया गया था। स्केल बार: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: AVIFJ द्वारा विभिन्न सांद्रता में कई प्रकार के biomaterials की छपाई. (A) परिणामों के इस अनुभाग में उपयोग किया जाने वाला नोजल। टिप का व्यास 30 μm था। स्केल बार: 100 μm. (बी) पीबीएस, 1.5% एल्जिनेट और 1.5% जिलेटिन सहित कई प्रकार के हाइड्रोजेल सामग्रियों का विभिन्न मापदंडों पर मुद्रण। एम: प्रति सेकंड एक लाख नमूने, एक एकल कंपन की अवधि को दर्शाते हैं। वी: पीक-टू-पीक वोल्टेज, एक एकल कंपन के स्ट्रोक को दर्शाता है। स्केल बार: 100 μm. (ग) विभिन्न पैरामीटरों पर 05% एल्गिनेट की छपाई। स्केल बार: 100 μm. (d) 2D व्यवस्था और बूंदों की क्लोज पोजिशनिंग। स्केल बार: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नोजल टिप के विभिन्न व्यासों के साथ मुद्रित माइक्रोकैरियर्स। (ए) 2% एल्जिनेट माइक्रोकैरियर, क्रमशः 70, 100, 130, 160, 210 और 250 μm पर नोजल टिप व्यास के साथ मुद्रित। स्केल बार: 100 μm. (बी) माइक्रोकैरियर के आकार पर नोजल टिप व्यास का प्रभाव। विभिन्न व्यास के नलिका के साथ मुद्रित माइक्रोकैरियर के आकार को इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक नोजल के लिए दस माइक्रोकैरियर का चयन और गणना की गई थी। डेटा को माध्य ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (सी) मुद्रित संशोधित एचए माइक्रोकैरियर्स 75 μm पर टिप व्यास के साथ। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एल्गिनेट-कोलेजन माइक्रोकैरियर्स पर सीडिंग कोशिकाएं। (ए) ए 54 9 कोशिकाओं की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां माइक्रोकैरियर की सतह पर पालन और प्रसार करती हैं। स्केल बार: 100 μm. (बी) ए 549 कोशिकाओं की कॉन्फोकल छवियां माइक्रोकैरियर्स की सतह पर पालन और प्रसार करती हैं। स्केल बार: 100 μm. सूक्ष्मवाहकों की सीमा को उजागर करने के लिए बिंदीदार दीर्घवृत्तों का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल हाइड्रोजेल माइक्रोकैरियर के बहु-प्रकार और बाद के सेल सीडिंग की तैयारी के लिए निर्देश प्रदान करता है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप और इंकजेट प्रिंटिंग विधियों की तुलना में, माइक्रोकैरियर के निर्माण के लिए AVIFJ दृष्टिकोण अधिक लचीलापन और जैव संगतता प्रदान करता है। एक स्वतंत्र नोजल इन प्रिंटिंग सिस्टम में उपयोग किए जाने वाले ग्लास माइक्रोपिपेट्स सहित हल्के नोजल की एक विस्तृत श्रृंखला को सक्षम बनाता है। अत्यधिक नियंत्रणीय प्रसंस्करण जलाशय की मात्रा, आंतरिक व्यास, और प्रिंटहेड के आकार को स्वतंत्र रूप से समायोजित करने के लिए सहित मापदंडों को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, डिस्पोजेबल नोजल कई सामग्रियों के बीच स्विच करने के लिए नसबंदी की सुविधा प्रदान करता है, जो बार-बार उपयोग से संभावित संदूषण से बचाता है। अंत में, छोटे और तेजी से विस्थापन, गंभीर बलों और थर्मल स्थितियों के बजाय, मुद्रण प्रक्रिया के दौरान सीधे नोजल पर कार्य करते हैं, मुद्रित बायोइंक के मूल भौतिक और रासायनिक गुणों को अधिकतम सीमा तक बनाए रखते हैं; इस सुविधा biomaterial अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक आकर्षक है.

सही आकार के माइक्रोकैरियर के सफल उत्पादन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) उपयुक्त व्यास की युक्तियों के साथ नोजल तैयार करना, और 2) मुद्रित बायोइंक की चिपचिपाहट के अनुसार उपयुक्त नमूना दर और वीपीपी को अनुकूलित करना। माइक्रोकैरियर निर्माण की स्थिरता उपग्रह बूंदों को हटाने और बाहरी ड्राइविंग बलों को लागू करके आगे हासिल की जाती है। बढ़े हुए पैरामीटर माइक्रोकैरियर के गठन की सुविधा प्रदान करते हैं, लेकिन अत्यधिक ड्राइविंग बल उपग्रह माइक्रोकैरियर गठन का प्रमुख कारण हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक असमान माइक्रोकैरियर आकार होता है। इस प्रकार, माइक्रोकैरियर आकार की एकरूपता में सुधार करने के लिए, उपयुक्त (अत्यधिक नहीं) नमूना दरों और वीपीपी का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। माइक्रोकैरियर स्थिरता में सुधार के लिए एक और पहलू बाहरी ड्राइविंग बलों का आवेदन है। बाहरी ड्राइविंग बल स्थैतिक दबाव और नीचे की ओर ड्राइविंग बलों के पूरक हैं, जो टिप पर सतह के तनाव को दूर करने के लिए एक साथ काम कर रहे हैं। नोजल और पूरक अतिरिक्त धक्का बलों को खिलाने के लिए एक सिरिंज पंप पुशिंग का प्रयोग किया गया था। विशेष रूप से, नोजल एक सिरिंज से जुड़ा हुआ था, जिसकी धक्का देने की गति को एक सटीक सिरिंज पंप द्वारा समायोजित किया गया था। इस विधि ने सीमित मापदंडों पर माइक्रोड्रोप्लेट्स बनाने के लिए हाइड्रोजेल समाधान की समान एकाग्रता की अनुमति दी, जो माइक्रोकैरियर के आकार को कम करने के लिए फायदेमंद है। अन्य अध्ययनों ने माइक्रोड्रॉपलेट प्रिंटिंग 27,28 को बढ़ावा देने के लिए इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षेत्रों या निचोड़ने वाले जलाशयों के उपयोग की सूचना दी है।

यद्यपि बाहरी ड्राइविंग बलों को लागू करने से मुद्रण योग्य स्याही के प्रकारों और सांद्रता की सीमा को व्यापक बनाने की उम्मीद है, यहां उपयोग की जाने वाली मुद्रण तकनीक अभी भी सीमित ड्राइविंग बलों की चुनौती का सामना करती है और अभी भी उच्च चिपचिपाहट स्याही के लिए अप्रभावी है।

एक AVIFJ 3D प्रिंटर का उपयोग कर माइक्रोकैरियर तैयारी और सेल आसंजन की व्यवहार्यता को प्राथमिक रूप से सत्यापित किया गया था। बाद का काम जैविक मॉडल के निर्माण में माइक्रोकैरियर के संभावित अनुप्रयोगों पर ध्यान केंद्रित करेगा। भविष्य के शोध में, सेल आसंजन प्रक्रिया को अनुकूलित किया जाएगा ताकि कोशिकाओं की संख्या और प्रकार को और बढ़ाया और समृद्ध किया जा सके, जिससे एक कार्यात्मक ऊतक या संवहनी नेटवर्क बनाने की उम्मीद है। इसके अलावा, बायोइंक को कार्यात्मक विषम संरचनात्मक इकाइयों को बनाने के लिए कोशिकाओं के साथ सह-मुद्रित किया जाएगा। माइक्रोकैप्सूल, सूक्ष्म कणों और अन्य संरचनाओं को भी नैदानिक उपयोग के लिए एक निरंतर दवा रिलीज मॉडल बनाने के लिए माइक्रोकैरियर के अंदर लोड किया जा सकता है। संक्षेप में, ऊतक सूक्ष्म इकाइयों के निर्माण के लिए एक विधि विकसित की गई है, जिसे इन विट्रो कार्यात्मक सूक्ष्म ऊतकों के रूप में स्केल किए जाने की उम्मीद है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (3212007), सिंघुआ विश्वविद्यालय पहल वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यक्रम (20197050024), सिंघुआ विश्वविद्यालय स्प्रिंग ब्रीज फंड (20201080760), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (51805294), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2018YFA0703004), और 111 परियोजना (B17026) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CCL-185 Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope Olympus DP70
Confocal microscope Nikon TI-FL
Fetal bovine serum, FBS BI 04-001-1ACS
Gelatin SIGMA G1890
Glass micropipettes sutter instrument b150-110-10
GlutaMAX GIBCO 35050-061
H-DMEM GIBCO 11960-044 Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder SIGMA P6782
Hydrophobic agent 3M PN7026 Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device narishige MF-900
Non-essential amino acids, NEAA GIBCO 11140-050 non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin GIBCO 15140-122
Petri dish SIGMA P5731-500EA
Puller sutter instrument P-1000
Sodium alginate SIGMA A0682
Trypsin GIBCO 25200-056
Type I collagen solution from rat tail SIGMA C3867

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References

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Bioengineering मुद्दा 170 3 डी मुद्रण नीचे ऊपर हाइड्रोजेल माइक्रोकैरियर microtissue
इन <em>विट्रो</em> हाइड्रोजेल माइक्रोकैरियर्स की 3 डी प्रिंटिंग बारी-बारी से चिपचिपा-जड़त्वीय बल जेटिंग द्वारा
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Liu, T., Shao, Y., Wang, Z., Chen, Y., Pang, Y., Weng, D., Sun, W. 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting. J. Vis. Exp. (170), e62252, doi:10.3791/62252 (2021).

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