Summary
Здесь представлена мягкая техника 3D-печати, управляемая чередующимися вязко-инерционными силами, позволяющая строить гидрогелевые микроносители. Самодельные насадки обеспечивают гибкость, что позволяет легко заменять различные материалы и диаметры. Микроносители клеточного связывания диаметром 50-500 мкм могут быть получены и собраны для дальнейшего культивирования.
Abstract
Микроносители представляют собой шарики диаметром 60-250 мкм и большой удельной площадью поверхности, которые обычно используются в качестве носителей для крупномасштабных клеточных культур. Технология микронесущих культур стала одним из основных методов в цитологических исследованиях и широко используется в области крупномасштабного расширения клеток. Было также показано, что микроносители играют все более важную роль в построении тканевой инженерии in vitro и клиническом скрининге лекарств. Современные методы подготовки микронесущих включают микрофлюидные чипы и струйную печать, которые часто полагаются на сложную конструкцию канала потока, несовместимый двухфазный интерфейс и фиксированную форму сопла. Эти методы сталкиваются с проблемами сложной обработки сопла, неудобными изменениями сопла и чрезмерными экструзионными силами при применении к нескольким биочернам. В этом исследовании был применен метод 3D-печати, называемый чередующимся вязко-инерционным струйным действием, чтобы позволить построить гидрогелевые микроносители диаметром 100-300 мкм. Впоследствии клетки были посеяны на микроносителях для формирования тканевых инженерных модулей. По сравнению с существующими методами, этот метод предлагает свободный диаметр наконечника сопла, гибкое переключение сопел, свободное управление параметрами печати и мягкие условия печати для широкого спектра биологически активных материалов.
Introduction
Микроносители представляют собой шарики диаметром 60-250 мкм и большой удельной площадью поверхности и обычно используются для крупномасштабной культивирования клеток1,2. Их внешняя поверхность обеспечивает обильные участки роста для клеток, а внутренняя обеспечивает опорную структуру для пространственной пролиферации. Сферическая структура также обеспечивает удобство в мониторинге и контроле параметров, включая pH, O2 и концентрацию питательных веществ и метаболитов. При использовании в сочетании с биореакторами с перемешиваемым резервуаром микроносители могут достигать более высокой плотности клеток в относительно небольшом объеме по сравнению с обычными культурами, тем самым обеспечивая экономически эффективный способ получения крупномасштабных культур3. Технология культивирования микроносителей стала одним из основных методов в цитологических исследованиях, и большой прогресс был достигнут в области масштабного расширения стволовых клеток, гепатоцитов, хондроцитов, фибробластов и других структур4. Было также установлено, что они являются идеальными средствами доставки лекарств и блоками снизу вверх, поэтому они играют все более важную роль в клиническом скрининге лекарств и восстановлении тканевой инженерии in vitro5.
Для удовлетворения требований к механическим свойствам в различных сценариях было разработано несколько типов гидрогелевых материалов для использования в строительстве микронесущих6,7,8,9,10,11. Гидрогели альгината и гиалуроновой кислоты (ГК) являются двумя наиболее часто используемыми микронесущими материалами благодаря их хорошей биосовместимости и сшиваемости12,13. Альгинат может быть легко сшит хлористым кальцием, а его механические свойства могут модулироваться путем изменения времени сшивания. Тирамино-конъюгированная ГК сшита окислительной связью фрагментов тирамина, катализируемых перекисью водорода и пероксидазой хрена14. Коллаген, благодаря своей уникальной спиральной структуре и сшитой волоконной сети, часто используется в качестве адъюванта для смешивания с микроносителями для дальнейшего содействия прикреплению клеток15,16.
Современные методы подготовки микроносителей включают микрофлюидные чипы, струйную печать и электрораспыление17,18,19,20,21,22,23. Было доказано, что микрофлюидные чипы быстро и эффективно производят микроносители однородного размера24. Однако эта технология опирается на сложный процесс проектирования и изготовления каналов потока25. Высокая температура или чрезмерные экструзионные силы при струйной печати, а также интенсивные электрические поля при электрораспылительном подходе могут негативно сказаться на свойствах материала, особенно на его биологической активности19. Кроме того, при применении к различным биоматериалам и диаметрам индивидуальные сопла, используемые в этих методах, приводят к ограниченной сложности обработки, высокой стоимости и низкой гибкости.
Чтобы обеспечить удобный метод подготовки микроносителей, для построения гидрогелевых микроносителей был применен метод 3D-печати, называемый струйной обработкой переменных вязко-инерционных сил (AVIFJ). Техника использует нисходящие движущие силы и статическое давление, создаваемое во время вертикальной вибрации, чтобы преодолеть поверхностное натяжение наконечника сопла и, таким образом, сформировать капли. Вместо сильных сил и тепловых условий небольшие быстрые смещения действуют непосредственно на сопло во время печати, оказывая незначительное влияние на физико-химические свойства биочернила и представляя большую привлекательность для биологически активных материалов. С помощью метода AVIFJ были успешно сформированы микроносители из нескольких биоматериалов диаметром 100-300 мкм. Кроме того, было доказано, что микроносители хорошо связывают клетки и обеспечивают подходящую среду роста для прилипших клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточная культура
- Дополните модифицированную минимальную незаменимую среду Dulbecco с высоким содержанием глюкозы (H-DMEM) 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1% заменимым раствором аминокислот (NEAA), 1% пенициллином G и стрептомицином и 1% добавкой глутамина в качестве культуральной среды для клеток A549.
- Культивирование клеток A549 в CO2-инкубаторе при 37 °C и 5% CO2
- Диссоциировать клетки для субкультуры с использованием трипсина примерно при 80% слиянии.
- Используйте 3 мл трипсина для обработки клеток в колбе для культуры T75 при 37 °C в течение 3 мин, а затем добавьте 6 мл питательной среды, чтобы остановить трипсинизацию.
- Пипетка питательной среды для сбора слабо прилипших клеток.
- Центрифуга при 72,5 х г в течение 3 мин. Удалить надодержание и повторно суспендировать 3 мл свежей среды.
- Переложите 1 мл клеточной суспензии в новую колбу для культивирования Т75, содержащую 10 мл свежей среды. Меняйте культуральную среду каждые 2 дня.
2. Подготовка форсунок
- Загрузите стеклянные микропипетки на съемник в соответствии с инструкциями производителя. Наружный диаметр, внутренний диаметр и длина микроструйной трубы составляют 1,5 мм, 1,1 мм и 100 мм соответственно.
- Задайте параметры вытягивания для съемника. В частности, значения ТЕПЛА, ПРИТЯЖЕНИЯ, СКОРОСТИ, ВРЕМЕНИ и ДАВЛЕНИЯ по умолчанию установлены равными 560, 255, 255, 150 и 500 соответственно. Снимите сопло под эти параметры.
ВНИМАНИЕ: Сопло, полученное после отрыва, очень острое, и неосторожная операция может привести к травмам. - Отрежьте полученное сопло (этап 2.2) на заданный диаметр с помощью микрокузнечного устройства в соответствии с инструкциями завода-изготовителя для получения определенного диаметра наконечника. В частности, найдите указанный диаметр сопла на нагретой платиновой проволоке. Нагрейте провод до 60 °C в течение примерно 5 с и раздвиньте сопло.
- Погрузить печатающую головку сопла в гидрофобное средство на 30 мин с последующим тремя циклами промывки стерилизованной водой.
- Перед печатью стерилизуйте насадку в спирте в течение 5 мин и трижды промойте ее стерилизованной водой, чтобы удалить остаточный спирт.
3. Приготовление гидрогелевого биочернила
- Растворить NaCl (0,45 г) в 50 мл стерильной воды для получения 0,9% (мас./об.) раствора NaCl. Вибрируйте раствор, чтобы способствовать растворению. После полного растворения процедите раствор через фильтрующую мембрану полиэтилентерефталата толщиной 0,45 мкм.
- Взвесили порошок альгината натрия низкой вязкости (1 г) и растворили его в 25 мл раствора NaCl (стадия 3.1) при высокой температуре 60-80 °C на ночь для получения 4% (мас./об.) раствора альгината натрия. Запасной раствор можно хранить при 4 °C в течение 1 месяца.
- Стерилизуют раствор альгината натрия (стадия 3.2), нагревая его три раза в духовке (70 °C) в течение 30 мин.
- Разбавляют собственный объем раствора альгината натрия (стадия 3.3) в 0,9% растворе NaCl (стадия 3.1) в концентрациях 2%, 1,5% и 0,5% (мас./об.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо нагревания в духовке, в вытяжке следует проводить другие процессы приготовления раствора альгината натрия. - Растворить 1 г желатинового порошка в 25 мл раствора NaCl (стадия 3.1) при высокой температуре 60-80 °C в течение ночи до получения 4% (мас./об.) раствора желатина. Запасной раствор можно хранить при 4 °C в течение 1 месяца.
- Стерилизуйте желатиновый бульоновый раствор (стадия 3.5), нагревая его три раза в духовке (70 °C) в течение 30 мин.
- Разбавляют надлежащий объем раствора желатина (стадия 3.6) в 0,9% растворе NaCl (стадия 3.1) в концентрации 1,5% (мас./об.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо нагрева в духовке, в вытяжке следует проводить другие процессы приготовления желатинового раствора. - Чтобы способствовать связыванию клеток на микроносителях, готовят альгинат-коллагеновый раствор путем смешивания 2% (мас./об.) раствора альгината натрия и раствора коллагена типа I из крысиного хвоста (4 мг/мл) в соотношении 3:1. Отрегулируйте раствор до рН 7,2 с 0,1 М раствора NaOH и используйте сразу после приготовления.
- Растворяют модифицированное тирозином твердое вещество ГК-флокулянта в растворе фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) при 60-80 °C в течение ночи для получения 0,8% мас./мас.,е. раствора PBS, модифицированного тирозином. Запасной раствор можно хранить при 4 °C в течение 1 месяца.
- Стерилизуйте модифицированный тирозином раствор HA PBS, нагревая его три раза в духовке (70 °C) в течение 30 мин.
- Растворить порошок пероксидазы хрена (500 единиц активности фермента/мг) в растворе PBS для получения 8 единиц активности фермента/мг раствора PBS пероксидазы хрена.
- Раствор перекиси водорода разбавляют (30%, мас./мас.) водой DI до 4 мМ.
- Готовят модифицированный раствор ГК-пероксидазы хрена путем смешивания тирозина-модифицированного раствора гиалуроновой кислоты PBS и раствора пероксидазы хрена PBS в соотношении 1:1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо нагревания в духовке, в вытяжке следует проводить другие процессы приготовления раствора ГК-пероксидазы ГК-хрена.
4. Образование микрокапель на основе AVIFJ
- Используйте домашнюю систему печати ячеек, как сообщалось ранее (рисунок 1A)26. Электрический сигнал, выходной сигнал генератором формы сигнала, сначала усиливается, а затем приводит пьезоэлектрическую керамику для создания контролируемой деформации. Таким образом, сопло, закрепленное на пьезоэлектрической керамике, производит контролируемые вибрации.
- Стерилизуйте систему печати, протирая 75% (v/v) спиртом и ультрафиолетовым (УФ) воздействием в течение ночи.
- Загрузите 5 мл биочернила (шаг 3.1) в одноразовый стерильный шприц. Установите шприц на шприцевой насос.
- Соедините шприц (шаг 4.3) и сопло (шаг 2.5) силиконовым шлангом внутреннего диаметра 1 мм.
- Зафиксируйте сопло (шаг 4.4), которое будет использоваться для печати, регулируя герметичность зажимного винта. Держите наконечник сопла подальше от подложки во время установки, чтобы избежать повреждений и загрязнения.
ВНИМАНИЕ: Если сопло сломалось во время установки, наденьте более толстые перчатки и тщательно очистите фрагменты стекла и остатки. - Быстро толкните шприцевой насос и загрузите биочернило (шаг 4.3) в сопло (шаг 4.5). Установите скорость потока на уровне 30 мкл/мин. Вытрите лишний материал на кончике.
- Установка параметров генератора сигналов. Импорт самопроектированной формы сигнала, содержащей 500 000 точек отбора проб. Установите частоту дискретизации и пик-пиковое напряжение (Vpp) как 5 миллионов выборок/с и 10 В соответственно.
- Очистите горки или чашки Петри деионизированной водой. Поместите их под сопло в качестве печатной подложки.
- Предустановите траекторию движения и режим вибрации триггера как падение по требованию.
- Распечатайте капли по заранее разработанным шаблонам.
5. Формирование микронесущих на основе AVIFJ
- Повторите шаги 4.1-4.4, за исключением изменения биочернила на 2% (мас./об.) раствор альгината (этап 3.4), альгинат-коллагеновый раствор (этап 3.8) или модифицированный раствор ГК-пероксидазы хрена (этап 3.13).
- Растворить 3 г хлорида кальция в 100 мл стерильной воды до получения 3% (мас./об.) раствора хлористого кальция. После полного растворения процедите раствор через фильтрующую мембрану полиэтилентерефталата толщиной 0,45 мкм.
- Добавьте 5 мл сшивающего раствора (раствор хлорида кальция или раствор перекиси водорода) в чашку Петри. Поместите чашку Петри под сопло для работы в качестве субстрата.
- После печати сшивайте микроносители в течение 3 мин.
- Соберите суспензию микроносителя в трубку центрифуги и обогатите микроносители центрифугированием при 29 х г в течение 3 мин. Повторное суспендирование микроносителей в питательных средах при приблизительно 600 микроносителях/мл.
6. Инокуляция клеток на поверхности микроносителей
- Окрашивание клеток A549 с помощью Cell Tracker Green CMFDA для облегчения наблюдения за клетками. В частности, удаляют культуральную среду, добавляют 5 мл безсыворочной среды, содержащей краситель Cell Tracker 10 мкМ, и инкубируют клетки в течение 30 минут в инкубаторе. Затем замените раствор красителя свежей средой.
- Повторное суспендирование суспензии ячейки A549 при плотности 1,6 x 106 ячеек/мл.
- Добавьте 1 мл альгинат-коллагеновой суспензии микроносителя (стадия 5.3) и 1 мл клеточной суспензии A549 (стадия 6.1) в низкоадгезивную 6-луночную культуральную пластину.
- Поместите пластину на шейкер со скоростью вращения 30 об/мин в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
- Снимите тарелку с шейкера и подождите 30 минут, чтобы микроносители осели. Половину меняют культуральную среду каждые 2 дня.
7. Анализ образования микрокапель/микроносителей
- Наблюдайте и измеряйте сопло (шаг 2.2), чашки Петри (шаг 4.10 и шаг 5.4) и клетки с микронесущими (шаг 6.5) под ярким полевым микроскопом или конфокальным микроскопом. В частности, объективное увеличение составляет 4x, 10x или 20x, а увеличение окуляра - 10x.
- Измерьте диаметр микронесущих с помощью программного обеспечения ImageJ. В соответствии с шкалой, которая поставляется с микроскопом при съемке на снимке, установите фактический размер шкалы в ImageJ, и нарисуйте 10 линий радиуса или большой полуоси микроносителей. ImageJ может получить средний размер и стандартное отклонение этих сегментов линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Печатающие головки с различной скоростью конвергенции и диаметром были изготовлены для достижения печати нескольких типов материалов. Сопла, полученные с увеличением силы натяжения, показаны на рисунке 1В. Сопла были разделены на три области: резервуар (III), сокращение (II) и печатающая головка (I). Резервуар представлял собой необработанную часть сопла, в которой жидкость обеспечивала статическое давление и ввод биочернила для печати. Зона сжатия была основной частью для генерации нисходящих движущих сил. Сила натягивания оказала значительное влияние на печатающую головку, демонстрируя более низкую скорость сходимости с увеличенной силой натягивание. Более узкая и длинная печатающая головка увеличивала поверхностное натяжение во время печати, затрудняя формирование дискретных микрокапель, но облегчала резку наконечников меньшего диаметра в последующих операциях. После этого с помощью инструмента для ковки иглы печатающая головка была отрезана на заданный диаметр (рисунок 1С). Наконечники с различными диаметрами, в том числе 100, 120, 150 и 200 мкм, были доступны для создания микронесущих различных размеров, отвечающих требованиям различных микротюсов in vitro .
Стабильность и управляемость процесса печати были впервые проверены путем печати капель на чашках Петри. С соплом наконечника 30 мкм были стабильно напечатаны несколько биочернил, включая PBS, 1,5% альгината и 1,5% желатина (рисунок 2A, B). Сложность печати определенного биочернила отразилась на частоте дискретизации и Vpp, используемой для печати. Биочернила с низкой вязкостью, такие как раствор NaCl, печатались при меньших параметрах, что приводило к уменьшению диаметров капель. С увеличением вязкости процесс печати стал соответственно более сложным, так как требовались большие усилия привода и получались более крупные капли (рисунок 2B). С помощью этого механизма регулировка параметров и движущих сил для данного биочернила может быть использована для регулировки различных размеров капель, как показано на рисунке 2C. На рисунке 2D показано расположение капель, образующих специфические буквы «THU» на плоской поверхности. Кроме того, сочетание микроскопических наблюдений позволило локализовать микрокапли в меньших масштабах в пределах 100 мкм.
Альгинатные микроносители (рисунок 3А) и микроносители ГК (рисунок 3С) печатались с наконечниками разного диаметра. Влияние диаметра наконечника на диаметр альгинатной микронесущей показано на рисунке 3B. Ограниченная закупоркой, вызванной испарением раствора, когда размер слишком мал, наименьший диаметр напечатанных альгинатных микроносителей составлял примерно 100 мкм. При этом наибольший диаметр мог достигать до 300 мкм. Диаметр печатаемых микронесущих увеличивается в соответствии с диаметром наконечника и всегда больше последнего. Когда диаметр наконечника превышает 250 мкм, биочернила не может быть распечатана. Диаметр напечатанных модифицированных микронесущих ГК составлял 76,7 ± 1,8 мкм с диаметром наконечника 75 мкм (рисунок 3С).
Клетки A549 и альгинат-коллагеновые микроносители были посеяны в пластину и помещены на шейкер в инкубаторе. Наблюдалось, что клетки прилипают к альгинат-коллагеновым микроносителям после смешивания в течение 2 дней. Клетки постепенно покрывают большую поверхность микроносителей путем пролиферации. После культивирования в течение 6 дней клетки А549 почти полностью покрывали поверхности микронесущих. Этот результат подтверждает, что разработанные микроносители могут хорошо связывать клетки и обеспечивать подходящую среду роста для клеток. Яркие полевые изображения и конфокальные изображения клеток A549, прилипших и размножающихся на поверхности микронесущих, показаны на рисунке 4.
Рисунок 1: Система печати AVIFJ и подготовка форсунок различного диаметра. (A) Установка сопла AVIFJ. (B) При определенных параметрах PULL печатающая головка сопла была сформирована таким образом, чтобы сходиться с различной скоростью. Шкала: 200 мкм. (C) С помощью инструмента для ковки иглой наконечник отрезался в установленных положениях. Шкала: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Печать нескольких типов биоматериалов в различных концентрациях avIFJ. (A) Сопло, используемое в этом разделе результатов. Диаметр наконечника составлял 30 мкм. Шкала: 100 мкм. (B) Печать нескольких типов гидрогелевых материалов, включая PBS, 1,5% альгината и 1,5% желатина при различных параметрах. M: миллион образцов в секунду, отражающих продолжительность одной вибрации. V: напряжение от пика до пика, отражающее ход одной вибрации. Шкала: 100 мкм. (C) Печать 0,5% альгината при различных параметрах. Шкала: 100 мкм. (D) 2D-компоновка и близкое расположение капель. Шкала: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Микроносители напечатаны с различными диаметрами наконечника сопла. (A) 2% альгинатные микроносители, напечатанные с диаметрами наконечника сопла 70, 100, 130, 160, 210 и 250 мкм соответственно. Шкала: 100 мкм. (B) Влияние диаметра наконечника сопла на размер микронесущих. Размеры микронесущих, напечатанных с соплами разного диаметра, были статистически проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ. Было выбрано и рассчитано десять микронесущих для каждого сопла. Данные представлены в виде средней ± s.d. (C) Печатные модифицированные микроносители HA с диаметром наконечника 75 мкм. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Посев клеток на альгинат-коллагеновые микроносители. (A) Яркие полевые изображения клеток A549, прилипших и размножающихся на поверхности микроносителей. Шкала: 100 мкм. (B) Конфокальные изображения клеток A549, прилипших и размножающихся на поверхности микроносителей. Шкала: 100 мкм. Пунктирные эллипсы используются для выделения границы микронесущих. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, содержит инструкции по приготовлению многотипных микроносителей гидрогеля и последующему посеву клеток. По сравнению с методами микрофлюидной чиповой и струйной печати, подход AVIFJ к созданию микронесущих обеспечивает большую гибкость и биосовместимость. Независимое сопло позволяет использовать в этих системах печати широкий спектр легких сопел, включая стеклянные микропипетты. Высококонтролируемая обработка позволяет свободно регулировать параметры, включая объем резервуара, внутренний диаметр и форму печатающей головки. Кроме того, одноразовое сопло облегчает стерилизацию для переключения между несколькими материалами, что позволяет избежать потенциального загрязнения при повторном использовании. Наконец, небольшие и быстрые смещения, вместо сильных сил и тепловых условий, действуют непосредственно на сопло в процессе печати, сохраняя в максимальной степени первоначальные физико-химические свойства печатного биочернила; эта особенность очень привлекательна для применения биоматериалов.
Наиболее важными шагами для успешного производства микронесущих правильного размера являются: 1) Подготовка форсунок с наконечниками соответствующих диаметров и 2) адаптация подходящей частоты отбора проб и Vpp в соответствии с вязкостью печатного биочернила. Стабильность конструкции микронесущих дополнительно достигается за счет удаления сателлитных капель и применения внешних движущих сил. Повышенные параметры облегчают формирование микронесущих, но чрезмерные движущие силы являются ключевой причиной формирования спутниковых микроносителей, что приводит к неоднородному размеру микронесущих. Таким образом, для улучшения однородности размеров микронесущей рекомендуется использовать соответствующие (не чрезмерные) частоты дискретизации и Vpp. Другим аспектом повышения устойчивости микронесущих является применение внешних движущих сил. Внешние движущие силы дополняют статическое давление и нисходящие движущие силы, работая вместе, чтобы преодолеть поверхностное натяжение на кончике. Было опробовано толкание шприцевого насоса для подачи сопла и дополнительных толкающих усилий. В частности, сопло было соединено со шприцем, скорость толкания которого регулировалась прецизионным шприцевым насосом. Этот метод позволил одинаковой концентрации раствора гидрогеля образовывать микрокапли при ограниченных параметрах, что выгодно для уменьшения размеров микроносителей. В других исследованиях сообщалось об использовании электростатических полей или сжимающих резервуаров для содействия микрокаплетной печати27,28.
Хотя ожидается, что применение внешних движущих сил расширит диапазон типов и концентраций печатаемых красок, используемая здесь техника печати по-прежнему сталкивается с проблемой ограниченных движущих сил и по-прежнему неэффективна для чернил с высокой вязкостью.
Предварительно проверена целесообразность подготовки микронесущих и адгезии клеток с помощью 3D-принтера AVIFJ. Последующая работа будет сосредоточена на потенциальном применении микроносителей при построении биологических моделей. В будущих исследованиях процесс клеточной адгезии будет оптимизирован таким образом, что количество и типы клеток будут дополнительно увеличены и обогащены, что, как ожидается, сформирует функциональную ткань или сосудистую сеть. Кроме того, биочернила будет дополнительно совместно печататься с клетками для формирования функциональных гетерогенных структурных единиц. Микрокапсулы, микрочастицы и другие структуры также могут быть загружены внутрь микроносителей для формирования модели замедленного высвобождения лекарств для клинического использования. Таким образом, был разработан метод построения тканевых микро-единиц, которые, как ожидается, будут масштабированы для формирования функциональных микроткань in vitro .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Пекинским фондом естественных наук (3212007), Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20197050024), Фондом весеннего бриза Университета Цинхуа (20201080760), Национальным фондом естественных наук Китая (51805294), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0703004) и Проектом 111 (B17026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
