Presenteras här är en mild 3D-utskriftsteknik som drivs av alternerande trögflytande tröghetskrafter för att möjliggöra byggandet av hydrogelmikrokarrier. Hemlagade munstycken ger flexibilitet, vilket gör det enkelt att byta ut olika material och diametrar. Cellbindande mikrokarrier med en diameter på 50-500 μm kan erhållas och samlas in för vidare odling.
Mikrokarrier är pärlor med en diameter på 60-250 μm och en stor specifik yta, som vanligtvis används som bärare för storskaliga cellkulturer. Mikrokartmaterials kulturteknik har blivit en av de viktigaste teknikerna inom cytologisk forskning och används ofta inom storskalig cellexpansion. Mikrokarrier har också visat sig spela en allt viktigare roll i in vitro-vävnadsteknik och klinisk läkemedelsscreening. Aktuella metoder för att förbereda mikrokarrier inkluderar mikrofluidiska chips och bläckstråleutskrift, som ofta förlitar sig på komplex flödeskanaldesign, ett inkompatibelt tvåfasgränssnitt och en fast munstyckesform. Dessa metoder står inför utmaningarna med komplex munstycksbearbetning, obekväma munstycksbyten och överdrivna extruderingskrafter när de appliceras på flera biobläck. I denna studie tillämpades en 3D-utskriftsteknik, kallad alternerande viskösa-tröghetskraft jetting, för att möjliggöra byggandet av hydrogelmikrokarrier med en diameter av 100-300 μm. Celler såddes därefter på mikrocarriers för att bilda vävnadsteknik moduler. Jämfört med befintliga metoder erbjuder denna metod en fri munstyckesspetsdiameter, flexibel munstycksbyte, fri kontroll av utskriftsparametrar och milda utskriftsförhållanden för ett brett spektrum av bioaktiva material.
Mikrokarrier är pärlor med en diameter på 60-250 μm och en stor specifik yta och används ofta för storskalig kultur av celler1,2. Deras yttre yta ger rikliga tillväxtplatser för celler, och interiören ger en stödstruktur för rumslig spridning. Den sfäriska strukturen ger också bekvämlighet vid övervakning och kontroll av parametrar, inklusive pH, O2 och koncentration av näringsämnen och metaboliter. När mikrokarrier används i kombination med omrörda tankbioreaktorer kan de uppnå högre celltätheter i en relativt liten volym jämfört med konventionella kulturer, vilket ger ett kostnadseffektivt sätt att uppnå storskaliga kulturer3. Mikrokarrierkulturteknik har blivit en av de viktigaste teknikerna inom cytologisk forskning, och stora framsteg har gjorts inom området storskalig expansion av stamceller, hepatocyter, kondrocyter, fibroblaster och andra strukturer4. De har också visat sig vara idealiska drug delivery fordon och bottom-up enheter, därför tar på sig en allt viktigare roll i klinisk läkemedelsscreening och in vitro vävnadstekniska reparation5.
För att uppfylla mekaniska egenskapskrav i olika scenarier har flera typer av hydrogelmaterial utvecklats för användning vid konstruktion av mikrokarrier6,7,8,9,10,11. Alginat och hyaluronsyra (HA) hydrogeler är två av de mest använda mikrokarriermaterialen på grund av deras goda biokompatibilitet och tvärbindning12,13. Alginat kan enkelt korslänkas av kalciumklorid, och dess mekaniska egenskaper kan moduleras genom att ändra korslänkningstiden. Tyraminkonjugerad HA är korslänkad genom oxidativ koppling av tyraminmoieties katalyseras av väteperoxid och pepparrotsperoxidas14. Kollagen, på grund av sin unika spiralstruktur och korslänkade fibernätverk, används ofta som en adjuvans för att blanda i mikrokarriers för att ytterligare främja cellfäste15,16.
Nuvarande metoder för att förbereda mikrokarrier inkluderar mikrofluidiska chips, bläckstråletryck och elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiska spånor har visat sig vara snabba och effektiva när det gäller att producera mikrokarrier i enhetlig storlek24. Denna teknik förlitar sig dock på en komplex flödeskanaldesign och tillverkningsprocess25. Hög temperatur eller överdrivna extruderingskrafter under bläckstråleutskrift, liksom intensiva elektriska fält i elektrospraymetoden, kan påverka materialets egenskaper negativt, särskilt dess biologiska aktivitet19. Dessutom, när de appliceras på olika biomaterial och diametrar, resulterar de anpassade munstyckena som används i dessa metoder i begränsad bearbetningskomplexitet, hög kostnad och låg flexibilitet.
För att ge en bekväm metod för mikrokarrierberedning har en 3D-utskriftsteknik som kallas alternerande viskösa tröghetskrafter (AVIFJ) tillämpats för att konstruera hydrogelmikrokarrier. Tekniken använder nedåtriktade drivkrafter och statiskt tryck som genereras under vertikala vibrationer för att övervinna munstyckets ytspänning och därmed bilda droppar. Istället för svåra krafter och termiska förhållanden verkar små snabba förskjutningar direkt på munstycket under utskrift, vilket orsakar en mindre effekt på biobläckets fysikalisk-kemiska egenskaper och presenterar stor attraktion för bioaktiva material. Med hjälp av AVIFJ-metoden bildades mikrokarrier av flera biomaterial med diametrar på 100-300 μm framgångsrikt. Dessutom visade sig mikrokartriers ytterligare binda celler väl och ge en lämplig tillväxtmiljö för vidhäftade celler.
Protokollet som beskrivs här ger instruktioner för beredning av multityper av hydrogelmikrokarrier och efterföljande cellsådd. Jämfört med mikrofluidiska chip- och bläckstråletryckmetoder erbjuder AVIFJ:s metod för att konstruera mikrokarrier större flexibilitet och biokompatibilitet. Ett oberoende munstycke gör det möjligt att använda ett brett utbud av lätta munstycken, inklusive mikropipetter av glas, i dessa utskriftssystem. Den mycket kontrollerbara bearbetningen gör det möjligt att fritt justera par…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) och 111 Project (B17026).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Gelatin | SIGMA | G1890 | |
Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
Puller | sutter instrument | P-1000 | |
Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |