Summary

3D-utskrift av In Vitro Hydrogel Microcarriers genom alternerande viskös-tröghetskraft jetting

Published: April 21, 2021
doi:

Summary

Presenteras här är en mild 3D-utskriftsteknik som drivs av alternerande trögflytande tröghetskrafter för att möjliggöra byggandet av hydrogelmikrokarrier. Hemlagade munstycken ger flexibilitet, vilket gör det enkelt att byta ut olika material och diametrar. Cellbindande mikrokarrier med en diameter på 50-500 μm kan erhållas och samlas in för vidare odling.

Abstract

Mikrokarrier är pärlor med en diameter på 60-250 μm och en stor specifik yta, som vanligtvis används som bärare för storskaliga cellkulturer. Mikrokartmaterials kulturteknik har blivit en av de viktigaste teknikerna inom cytologisk forskning och används ofta inom storskalig cellexpansion. Mikrokarrier har också visat sig spela en allt viktigare roll i in vitro-vävnadsteknik och klinisk läkemedelsscreening. Aktuella metoder för att förbereda mikrokarrier inkluderar mikrofluidiska chips och bläckstråleutskrift, som ofta förlitar sig på komplex flödeskanaldesign, ett inkompatibelt tvåfasgränssnitt och en fast munstyckesform. Dessa metoder står inför utmaningarna med komplex munstycksbearbetning, obekväma munstycksbyten och överdrivna extruderingskrafter när de appliceras på flera biobläck. I denna studie tillämpades en 3D-utskriftsteknik, kallad alternerande viskösa-tröghetskraft jetting, för att möjliggöra byggandet av hydrogelmikrokarrier med en diameter av 100-300 μm. Celler såddes därefter på mikrocarriers för att bilda vävnadsteknik moduler. Jämfört med befintliga metoder erbjuder denna metod en fri munstyckesspetsdiameter, flexibel munstycksbyte, fri kontroll av utskriftsparametrar och milda utskriftsförhållanden för ett brett spektrum av bioaktiva material.

Introduction

Mikrokarrier är pärlor med en diameter på 60-250 μm och en stor specifik yta och används ofta för storskalig kultur av celler1,2. Deras yttre yta ger rikliga tillväxtplatser för celler, och interiören ger en stödstruktur för rumslig spridning. Den sfäriska strukturen ger också bekvämlighet vid övervakning och kontroll av parametrar, inklusive pH, O2 och koncentration av näringsämnen och metaboliter. När mikrokarrier används i kombination med omrörda tankbioreaktorer kan de uppnå högre celltätheter i en relativt liten volym jämfört med konventionella kulturer, vilket ger ett kostnadseffektivt sätt att uppnå storskaliga kulturer3. Mikrokarrierkulturteknik har blivit en av de viktigaste teknikerna inom cytologisk forskning, och stora framsteg har gjorts inom området storskalig expansion av stamceller, hepatocyter, kondrocyter, fibroblaster och andra strukturer4. De har också visat sig vara idealiska drug delivery fordon och bottom-up enheter, därför tar på sig en allt viktigare roll i klinisk läkemedelsscreening och in vitro vävnadstekniska reparation5.

För att uppfylla mekaniska egenskapskrav i olika scenarier har flera typer av hydrogelmaterial utvecklats för användning vid konstruktion av mikrokarrier6,7,8,9,10,11. Alginat och hyaluronsyra (HA) hydrogeler är två av de mest använda mikrokarriermaterialen på grund av deras goda biokompatibilitet och tvärbindning12,13. Alginat kan enkelt korslänkas av kalciumklorid, och dess mekaniska egenskaper kan moduleras genom att ändra korslänkningstiden. Tyraminkonjugerad HA är korslänkad genom oxidativ koppling av tyraminmoieties katalyseras av väteperoxid och pepparrotsperoxidas14. Kollagen, på grund av sin unika spiralstruktur och korslänkade fibernätverk, används ofta som en adjuvans för att blanda i mikrokarriers för att ytterligare främja cellfäste15,16.

Nuvarande metoder för att förbereda mikrokarrier inkluderar mikrofluidiska chips, bläckstråletryck och elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiska spånor har visat sig vara snabba och effektiva när det gäller att producera mikrokarrier i enhetlig storlek24. Denna teknik förlitar sig dock på en komplex flödeskanaldesign och tillverkningsprocess25. Hög temperatur eller överdrivna extruderingskrafter under bläckstråleutskrift, liksom intensiva elektriska fält i elektrospraymetoden, kan påverka materialets egenskaper negativt, särskilt dess biologiska aktivitet19. Dessutom, när de appliceras på olika biomaterial och diametrar, resulterar de anpassade munstyckena som används i dessa metoder i begränsad bearbetningskomplexitet, hög kostnad och låg flexibilitet.

För att ge en bekväm metod för mikrokarrierberedning har en 3D-utskriftsteknik som kallas alternerande viskösa tröghetskrafter (AVIFJ) tillämpats för att konstruera hydrogelmikrokarrier. Tekniken använder nedåtriktade drivkrafter och statiskt tryck som genereras under vertikala vibrationer för att övervinna munstyckets ytspänning och därmed bilda droppar. Istället för svåra krafter och termiska förhållanden verkar små snabba förskjutningar direkt på munstycket under utskrift, vilket orsakar en mindre effekt på biobläckets fysikalisk-kemiska egenskaper och presenterar stor attraktion för bioaktiva material. Med hjälp av AVIFJ-metoden bildades mikrokarrier av flera biomaterial med diametrar på 100-300 μm framgångsrikt. Dessutom visade sig mikrokartriers ytterligare binda celler väl och ge en lämplig tillväxtmiljö för vidhäftade celler.

Protocol

1. Cellkultur Komplettera högglukos Dulbeccos modifierade minimum essential medium (H-DMEM) med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% icke-nödvändig aminosyralösning (NEAA), 1% penicillin G och streptomycin, och 1% Glutamin tillägg som odlingsmedia för A549 celler. Kultur A549 celler i en CO2 inkubator vid 37 °C och med 5% CO2 Separera celler för subkultur med trypsin vid cirka 80% sammanflöde. Använd 3 ml trypsin för att behandla cellerna i T75-odl…

Representative Results

Skrivhuvuden med varierande konvergenshastigheter och diametrar tillverkades för att uppnå utskrift av flera typer av material. De munstycken som erhålls med ökande dragstyrka visas i figur 1B. Munstyckena var indelade i tre områden: reservoar (III), sammandragning (II) och skrivhuvud (I). Behållaren var den obearbetade delen av munstycket, där vätskan gav statiskt tryck och biobläcking för utskrift. Sammandragningsområdet var den viktigaste delen för att generera nedåtgående d…

Discussion

Protokollet som beskrivs här ger instruktioner för beredning av multityper av hydrogelmikrokarrier och efterföljande cellsådd. Jämfört med mikrofluidiska chip- och bläckstråletryckmetoder erbjuder AVIFJ:s metod för att konstruera mikrokarrier större flexibilitet och biokompatibilitet. Ett oberoende munstycke gör det möjligt att använda ett brett utbud av lätta munstycken, inklusive mikropipetter av glas, i dessa utskriftssystem. Den mycket kontrollerbara bearbetningen gör det möjligt att fritt justera par…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) och 111 Project (B17026).

Materials

A549 cells ATCC CCL-185 Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope Olympus DP70
Confocal microscope Nikon TI-FL
Fetal bovine serum, FBS BI 04-001-1ACS
Gelatin SIGMA G1890
Glass micropipettes sutter instrument b150-110-10
GlutaMAX GIBCO 35050-061
H-DMEM GIBCO 11960-044 Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder SIGMA P6782
Hydrophobic agent 3M PN7026 Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device narishige MF-900
Non-essential amino acids, NEAA GIBCO 11140-050 non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin GIBCO 15140-122
Petri dish SIGMA P5731-500EA
Puller sutter instrument P-1000
Sodium alginate SIGMA A0682
Trypsin GIBCO 25200-056
Type I collagen solution from rat tail SIGMA C3867

References

  1. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
  2. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
  3. Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
  4. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  5. Naqvi, S. M., et al. Living cell factories – electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
  6. Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
  7. Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
  8. Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
  9. Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
  10. Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
  11. Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
  12. Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
  13. Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
  14. Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
  15. Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
  16. Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
  17. Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
  18. Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
  19. Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
  20. Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
  21. Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
  22. Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
  23. Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
  24. Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
  25. Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
  26. Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
  27. Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
  28. Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).

Play Video

Cite This Article
Liu, T., Shao, Y., Wang, Z., Chen, Y., Pang, Y., Weng, D., Sun, W. 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting. J. Vis. Exp. (170), e62252, doi:10.3791/62252 (2021).

View Video