Summary
Presenteras här är en mild 3D-utskriftsteknik som drivs av alternerande trögflytande tröghetskrafter för att möjliggöra byggandet av hydrogelmikrokarrier. Hemlagade munstycken ger flexibilitet, vilket gör det enkelt att byta ut olika material och diametrar. Cellbindande mikrokarrier med en diameter på 50-500 μm kan erhållas och samlas in för vidare odling.
Abstract
Mikrokarrier är pärlor med en diameter på 60-250 μm och en stor specifik yta, som vanligtvis används som bärare för storskaliga cellkulturer. Mikrokartmaterials kulturteknik har blivit en av de viktigaste teknikerna inom cytologisk forskning och används ofta inom storskalig cellexpansion. Mikrokarrier har också visat sig spela en allt viktigare roll i in vitro-vävnadsteknik och klinisk läkemedelsscreening. Aktuella metoder för att förbereda mikrokarrier inkluderar mikrofluidiska chips och bläckstråleutskrift, som ofta förlitar sig på komplex flödeskanaldesign, ett inkompatibelt tvåfasgränssnitt och en fast munstyckesform. Dessa metoder står inför utmaningarna med komplex munstycksbearbetning, obekväma munstycksbyten och överdrivna extruderingskrafter när de appliceras på flera biobläck. I denna studie tillämpades en 3D-utskriftsteknik, kallad alternerande viskösa-tröghetskraft jetting, för att möjliggöra byggandet av hydrogelmikrokarrier med en diameter av 100-300 μm. Celler såddes därefter på mikrocarriers för att bilda vävnadsteknik moduler. Jämfört med befintliga metoder erbjuder denna metod en fri munstyckesspetsdiameter, flexibel munstycksbyte, fri kontroll av utskriftsparametrar och milda utskriftsförhållanden för ett brett spektrum av bioaktiva material.
Introduction
Mikrokarrier är pärlor med en diameter på 60-250 μm och en stor specifik yta och används ofta för storskalig kultur av celler1,2. Deras yttre yta ger rikliga tillväxtplatser för celler, och interiören ger en stödstruktur för rumslig spridning. Den sfäriska strukturen ger också bekvämlighet vid övervakning och kontroll av parametrar, inklusive pH, O2 och koncentration av näringsämnen och metaboliter. När mikrokarrier används i kombination med omrörda tankbioreaktorer kan de uppnå högre celltätheter i en relativt liten volym jämfört med konventionella kulturer, vilket ger ett kostnadseffektivt sätt att uppnå storskaliga kulturer3. Mikrokarrierkulturteknik har blivit en av de viktigaste teknikerna inom cytologisk forskning, och stora framsteg har gjorts inom området storskalig expansion av stamceller, hepatocyter, kondrocyter, fibroblaster och andra strukturer4. De har också visat sig vara idealiska drug delivery fordon och bottom-up enheter, därför tar på sig en allt viktigare roll i klinisk läkemedelsscreening och in vitro vävnadstekniska reparation5.
För att uppfylla mekaniska egenskapskrav i olika scenarier har flera typer av hydrogelmaterial utvecklats för användning vid konstruktion av mikrokarrier6,7,8,9,10,11. Alginat och hyaluronsyra (HA) hydrogeler är två av de mest använda mikrokarriermaterialen på grund av deras goda biokompatibilitet och tvärbindning12,13. Alginat kan enkelt korslänkas av kalciumklorid, och dess mekaniska egenskaper kan moduleras genom att ändra korslänkningstiden. Tyraminkonjugerad HA är korslänkad genom oxidativ koppling av tyraminmoieties katalyseras av väteperoxid och pepparrotsperoxidas14. Kollagen, på grund av sin unika spiralstruktur och korslänkade fibernätverk, används ofta som en adjuvans för att blanda i mikrokarriers för att ytterligare främja cellfäste15,16.
Nuvarande metoder för att förbereda mikrokarrier inkluderar mikrofluidiska chips, bläckstråletryck och elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiska spånor har visat sig vara snabba och effektiva när det gäller att producera mikrokarrier i enhetlig storlek24. Denna teknik förlitar sig dock på en komplex flödeskanaldesign och tillverkningsprocess25. Hög temperatur eller överdrivna extruderingskrafter under bläckstråleutskrift, liksom intensiva elektriska fält i elektrospraymetoden, kan påverka materialets egenskaper negativt, särskilt dess biologiska aktivitet19. Dessutom, när de appliceras på olika biomaterial och diametrar, resulterar de anpassade munstyckena som används i dessa metoder i begränsad bearbetningskomplexitet, hög kostnad och låg flexibilitet.
För att ge en bekväm metod för mikrokarrierberedning har en 3D-utskriftsteknik som kallas alternerande viskösa tröghetskrafter (AVIFJ) tillämpats för att konstruera hydrogelmikrokarrier. Tekniken använder nedåtriktade drivkrafter och statiskt tryck som genereras under vertikala vibrationer för att övervinna munstyckets ytspänning och därmed bilda droppar. Istället för svåra krafter och termiska förhållanden verkar små snabba förskjutningar direkt på munstycket under utskrift, vilket orsakar en mindre effekt på biobläckets fysikalisk-kemiska egenskaper och presenterar stor attraktion för bioaktiva material. Med hjälp av AVIFJ-metoden bildades mikrokarrier av flera biomaterial med diametrar på 100-300 μm framgångsrikt. Dessutom visade sig mikrokartriers ytterligare binda celler väl och ge en lämplig tillväxtmiljö för vidhäftade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellkultur
- Komplettera högglukos Dulbeccos modifierade minimum essential medium (H-DMEM) med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% icke-nödvändig aminosyralösning (NEAA), 1% penicillin G och streptomycin, och 1% Glutamin tillägg som odlingsmedia för A549 celler.
- Kultur A549 celler i en CO2 inkubator vid 37 °C och med 5% CO2
- Separera celler för subkultur med trypsin vid cirka 80% sammanflöde.
- Använd 3 ml trypsin för att behandla cellerna i T75-odlingskolven vid 37 °C i 3 minuter och tillsätt sedan 6 ml odlingsmedium för att stoppa trypsiniseringen.
- Pipettera odlingsmediet för att skörda löst klibbade celler.
- Centrifug vid 72,5 x g i 3 min. Ta bort supernatanten och återanvänd med 3 ml färskt medium.
- Överför 1 ml cellfjädring till en ny T75-odlingskolv som innehåller 10 ml färskt medium. Byt kulturmedium varannan dag.
2. Beredning av munstycken
- Lasta in mikropipetter av glas på dragaren enligt tillverkarens anvisningar. Mikrostrålerörets ytterdiameter, innerdiameter och längd är 1,5 mm, 1,1 mm respektive 100 mm.
- Ställ in dragparametrarna för dragaren. Specifikt är värdena för VÄRME, PULL, HASTIGHET, TID och TRYCK inställda på 560, 255, 255, 150 respektive 500 som standard. Dra av munstycket under dessa parametrar.
VARNING: Munstycket som erhålls efter avdragning är mycket vasst och vårdslös användning kan orsaka skador. - Skär av det resulterande munstycket (steg 2.2) vid den angivna diametern med en mikrosmedja som följer tillverkarens instruktioner för att erhålla en viss spetsdiameter. Placera specifikt munstyckets angivna diameter på den uppvärmda platinatråden. Värm tråden upp till 60 °C i ca 5 s och dra isär munstycket.
- Sänk ned munstyckets skrivhuvud i ett hydrofobiskt medel i 30 minuter, följt av tre sköljcykler med steriliserat vatten.
- Innan du skriver ut, sterilisera munstycket i alkohol i 5 minuter och skölj det med steriliserat vatten tre gånger för att ta bort restalkoholen.
3. Beredning av hydrogelbioink
- Lös upp NaCl (0,45 g) i 50 ml sterilt vatten för att erhålla en 0,9% (w/v) NaCl-lösning. Vibrera lösningen för att främja upplösning. Efter att ha lösts upp helt filtrerar du lösningen genom ett 0,45 μm polyetentereftalatfiltermembran.
- Väg natriumalginatpulver med låg viskositet (1 g) och lös upp det i 25 ml NaCl-lösning (steg 3.1) vid en hög temperatur av 60-80 °C över natten för att erhålla en 4% (w/v) natriumalginatbuljonglösning. Lagerlösningen kan förvaras vid 4 °C i 1 månad.
- Sterilisera natriumalginatbuljonglösningen (steg 3.2) genom att värma den tre gånger i en ugn (70 °C) i 30 minuter.
- Späd ut korrekt volym natriumalginatbuljonglösning (steg 3.3) i 0,9% NaCl-lösning (steg 3.1) vid koncentrationer på 2%, 1,5% och 0,5% (w/v).
OBS: Förutom uppvärmning i ugnen bör andra beredningsprocesser av natriumalginatlösning utföras i huven. - Lös upp 1 g gelatinpulver i 25 ml NaCl-lösning (steg 3.1) vid en hög temperatur på 60-80 °C över natten för att få en 4% (w/v) gelatinbuljonglösning. Lagerlösningen kan förvaras vid 4 °C i 1 månad.
- Sterilisera gelatinbuljonglösningen (steg 3.5) genom att värma den tre gånger i en ugn (70 °C) i 30 min.
- Späd ut rätt volym gelatinbuljonglösning (steg 3,6) i 0,9% NaCl-lösning (steg 3.1) vid en koncentration av 1,5% (w/v).
OBS: Förutom uppvärmning i ugnen bör andra beredningsprocesser av gelatinlösning utföras i huven. - För att främja cellbindning på mikrokarriererna, förbered alginat-kollagenlösningen genom att blanda 2% (w/v) natriumalginatlösningen och typ I-kollagenlösningen från råttsvans (4 mg/ml) i ett förhållande av 3:1. Justera lösningen till pH 7.2 med 0,1 M NaOH-lösning och använd omedelbart efter beredningen.
- Lös upp det tyrosinmodifierade HA-flocculentfasta i fosfatbuffertsaltlösning (PBS) vid 60-80 °C över natten för att erhålla en 0,8% w/w tyrosinmodifierad hyaluronsyra PBS-lösning. Lagerlösningen kan förvaras vid 4 °C i 1 månad.
- Sterilisera den tyrosinmodifierade HA PBS-lösningen genom att värma den tre gånger i en ugn (70 °C) i 30 minuter.
- Lös upp pepparrotsperoxidaspulver (500 enzymaktivitetsenhet/mg) i PBS-lösningen för att erhålla 8 enzymaktivitetsenhet/mg pepparrotperoxidas PBS-lösning.
- Späd väteperoxidlösning (30%, w/w) med DI-vatten till 4 mM.
- Förbered den modifierade HA-pepparrotsperoxidaslösningen genom att blanda tyrosinmodifierad hyaluronsyra PBS-lösning och pepparrotsperoxidas PBS-lösning i ett förhållande av 1:1.
OBS: Förutom uppvärmning i ugnen bör andra beredningsprocesser av HA-pepparrotperoxidaslösning utföras i huven.
4. Mikrodroppar bildas baserat på AVIFJ
- Använd ett hemmaetablerat cellutskriftssystem som tidigare rapporterats (bild 1A)26. Vågformsgeneratorns elektriska signalutgång förstärks först och driver sedan piezoelektrisk keramik för att generera kontrollerbar deformation. Munstycket som är fastsatt på den piezoelektriska keramiken ger därmed kontrollerbara vibrationer.
- Sterilisera trycksystemet genom att torka av med 75% (v/v) alkohol och ultraviolett (UV) exponering över natten.
- Ladda 5 ml biobläck (steg 3.1) i en steril engångsspruta. Installera sprutan på sprutpumpen.
- Anslut sprutan (steg 4.3) och munstycket (steg 2.5) med en silikonslang med en innerdiameter på 1 mm.
- Fixera munstycket (steg 4.4) som ska användas för utskrift genom att justera klämskruvens täthet. Håll munstyckets spets borta från substratet under installationen för att undvika skador och föroreningar.
VARNING: Om munstycket är trasigt under installationen, använd tjockare handskar och rengör försiktigt glasfragment och rester. - Tryck snabbt på sprutpumpen och ladda biobläcket (steg 4.3) till munstycket (steg 4.5). Ställ in flödeshastigheten på 30 μL/min. Torka av överflödigt material vid spetsen.
- Ställ in signalgeneratorparametrar. Importera egendesignad vågform som innehåller 500 000 provtagningspunkter. Ställ in provtagningshastigheten och topp-till-topp-spänningen (Vpp) som 5 miljoner prover/s respektive 10 V.
- Rengör rutschkanorna eller Petri-disken med avjoniserat vatten. Placera dem under munstycket som trycksubstrat.
- Förinställ rörelsebanan och utlösarläget för vibrationer som drop-on-demand.
- Skriv ut dropparna enligt de fördesignade mönstren.
5. Mikrocarriers bildning baserad på AVIFJ
- Upprepa steg 4.1-4.4, förutom att byta biobläck till 2% (w/v) alginatlösning (steg 3.4), alginat-kollagenlösning (steg 3.8) eller modifierad HA-pepparrotsperoxidaslösning (steg 3.13).
- Lös upp 3 g kalciumklorid i 100 ml sterilt vatten för att erhålla 3% (w/v) kalciumkloridlösning. Efter att ha lösts upp helt filtrerar du lösningen genom ett 0,45 μm polyetentereftalatfiltermembran.
- Tillsätt 5 ml korslänkningslösning (kalciumkloridlösning eller väteperoxidlösning) i en Petriskål. Placera Petri-skålen under munstycket för att fungera som ett substrat.
- Efter utskrift, korslänka mikrokartraren i 3 minuter.
- Samla mikrokartrarfjädring i ett centrifugrör och berika mikrokarrier genom centrifugering vid 29 x g i 3 min. Resuspend microcarriersna i kulturmedia på ungefärligt 600 microcarriers/mL.
6. Inokulat celler på ytan av mikrokarrier
- FläckA A549 celler med Cell Tracker Green CMFDA för att underlätta observation av celler. Ta specifikt bort odlingsmedier, tillsätt 5 ml serumfritt medium som innehåller 10 μM Cell Tracker-färgämne och inkubera celler i 30 minuter i en inkubator. Byt sedan ut färglösningen med färskt medium.
- Återanvänd A549-cellsuspensionen med densiteten 1,6 x 106 celler/ml.
- Tillsätt 1 ml alginat-kollagen mikrokartör suspension (steg 5.3) och 1 ml A549 cell suspension (steg 6.1) i en låg vidhäftande 6-väl odlingsplatta.
- Placera plattan på en skakapparat vid 30 varv/min i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Ta bort plattan från skakapparaten och vänta i 30 minuter för att låta mikrokartarna slå sig ner. Hälften byter kulturmedium varannan dag.
7. Analys av mikrodroppar/mikrokarrierbildning
- Observera och mät munstycket (steg 2.2), Petri-disken (steg 4.10 och steg 5.4) och celler med mikrokarrier (steg 6.5) under ett ljust fältmikroskop eller konfokalmikroskop. Specifikt är den objektiva förstoringen 4x, 10x eller 20x och okularförstoringen är 10x.
- Mät diametern på mikrokarriers med ImageJ programvara. Enligt skalstrecket som medföljer mikroskopet när du fotograferar på bilden ställer du in den faktiska storleken på skalan i ImageJ och ritar 10 linjer av mikrokartrarens radie eller halvstora axel. ImageJ kan få den genomsnittliga storleken och standardavvikelsen för dessa linjesegment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skrivhuvuden med varierande konvergenshastigheter och diametrar tillverkades för att uppnå utskrift av flera typer av material. De munstycken som erhålls med ökande dragstyrka visas i figur 1B. Munstyckena var indelade i tre områden: reservoar (III), sammandragning (II) och skrivhuvud (I). Behållaren var den obearbetade delen av munstycket, där vätskan gav statiskt tryck och biobläcking för utskrift. Sammandragningsområdet var den viktigaste delen för att generera nedåtgående drivkrafter. Dragstyrkan hade en betydande effekt på skrivhuvudet, vilket visade en lägre konvergenshastighet med förlängd dragstyrka. Det smalare och längre skrivhuvudet ökade ytspänningen under utskriften, vilket försvårade bildandet av diskreta mikrodroppar, men underlättade skärning av spetsar med mindre diameter i efterföljande operationer. Efteråt, med nålsmedänginstrumentet, skars skrivhuvudet av vid den angivna diametern (figur 1C). Tips med olika diametrar, inklusive 100, 120, 150 och 200 μm, fanns tillgängliga för att generera mikrokarrier av olika storlekar, som uppfyller kraven för olika in vitro-mikrotissuer .
Tryckprocessens stabilitet och kontrollerbarhet verifierades först genom att dukar ut droppar på Petri-diskar. Med ett 30 μm spetsmunstycke trycktes flera biobläck, inklusive PBS, 1,5% alginat och 1,5% gelatin stabilt (figur 2A,B). Svårigheten att skriva ut en viss biobläckning återspeglades i provtagningshastigheten och Vpp användes för utskrift. Biobläck med låg viskositet som NaCl-lösningen trycktes vid mindre parametrar, vilket resulterade i mindre droppdiametrar. Med ökande viskositet blev tryckprocessen på motsvarande sätt svårare, eftersom de större drivkrafterna behövdes och större droppar skulle få (figur 2B). Med denna mekanism kan justeringen av parametrar och drivkrafter för en viss biobläck användas för att justera olika droppstorlekar, som visas i figur 2C. Figur 2D visar arrangemanget av droppar som bildar de specifika bokstäverna "THU" på en plan yta. Dessutom tillät kombinationen av mikroskopiska observationer lokalisering av mikrodroppar i mindre skalor inom 100 μm.
Alginatmikrokarrier (figur 3A) och HA-mikrokarrier (figur 3C) trycktes med spetsar med olika diametrar. Spetsdiameterns effekter på alginatmikrokardiametern visas i figur 3B. Begränsad av blockeringen orsakad av avmattiliseringen av lösningen när storleken är för liten, var den minsta diametern på de tryckta alginatmikrokarna cirka 100 μm. Medan den största diametern kan nå upp till 300 μm. Diametern på de tryckta mikrokartrarna ökar i linje med spetsdiametern och är alltid större än den senare. När spetsens diameter är större än 250 μm kan biobläcket inte skrivas ut. Diametern på tryckta modifierade HA-mikrokartrier var 76,7 ± 1,8 μm med spetsdiametrar på 75 μm (figur 3C).
A549 celler och alginat-kollagen mikrocarriers såddes i en tallrik och placerades på en shaker i inkubatorn. Cellerna observerades för att hålla sig till alginat-kollagen mikrokarriers efter blandning i 2 dagar. Celler täcker gradvis större yta av mikrocarriers genom spridning. Efter odling i 6 dagar täckte A549-cellerna nästan helt mikrokarrierytorna. Detta resultat bekräftar att de utvecklade mikrokarriers kan binda celler väl och ge en lämplig tillväxtmiljö för cellerna. Ljusa fältbilder och konfokala bilder av A549-celler som sitter fast och förökar sig på mikrokartrarens yta visas i figur 4.
Bild 1: AVIFJ-trycksystemet och beredning av munstycken med olika diametrar. (B) Under specifika PULL-parametrar formades munstyckets skrivhuvud för att konvergera i olika hastigheter. Skalstång: 200 μm. (C) Med nålssystinstrumentet skars spetsen av på bestämda positioner. Skalstång: 200 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Tryckning av flera typer av biomaterial i olika koncentrationer av AVIFJ. (A) Munstycket som används i detta avsnitt av resultaten. Spetsens diameter var 30 μm. Skalstång: 100 μm. (B) Tryckning av flera typer av hydrogelmaterial, inklusive PBS, 1,5% alginat och 1,5% gelatin vid olika parametrar. M: en miljon prover per sekund, vilket återspeglar varaktigheten av en enda vibration. V: topp-till-topp-spänning, vilket återspeglar slaget vid en enda vibration. Skalstång: 100 μm. C) Utskrift av 0,5 % alginat vid olika parametrar. Skalstång: 100 μm. D) 2D-arrangemang och nära placering av droppar. Skalstång: 200 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Mikrokarier tryckta med olika diametrar på munstycksspetsen. (A) 2 % alginatmikrokarier, tryckta med munstycksspetsdiametrar på 70, 100, 130, 160, 210 respektive 250 μm. Skalstång: 100 μm. B) Effekten av munstyckets spetsdiameter på mikrokartrarnas storlek. Storleken på mikrokartrarna tryckta med munstycken med olika diametrar analyserades statistiskt med hjälp av ImageJ-programvara. Tio mikrokarrier för varje munstycke valdes och beräknades. Data presenteras som medelvärde ± s.d. (C) Tryckta modifierade HA-mikrokartrarna med spetsdiametrar vid 75 μm. Skalstång: 100 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Såddceller på alginat-kollagenmikrokar. (A) Ljusa fältbilder av A549-celler som håller sig och förökar sig på mikrokarriers yta. Skalstång: 100 μm. (B) Konfokala bilder av A549-celler som håller sig och förökar sig på mikrokartrarens yta. Skalstång: 100 μm. Prickade ellipser används för att markera gränsen för mikrokarrier. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger instruktioner för beredning av multityper av hydrogelmikrokarrier och efterföljande cellsådd. Jämfört med mikrofluidiska chip- och bläckstråletryckmetoder erbjuder AVIFJ:s metod för att konstruera mikrokarrier större flexibilitet och biokompatibilitet. Ett oberoende munstycke gör det möjligt att använda ett brett utbud av lätta munstycken, inklusive mikropipetter av glas, i dessa utskriftssystem. Den mycket kontrollerbara bearbetningen gör det möjligt att fritt justera parametrar, inklusive behållarens volym, den inre diametern och skrivhuvudets form fritt. Dessutom underlättar engångsmunstycket sterilisering för växling mellan flera material, vilket undviker potentiell förorening från upprepad användning. Slutligen verkar små och snabba förskjutningar, i stället för svåra krafter och termiska förhållanden, direkt på munstycket under tryckprocessen och bibehåller de ursprungliga fysiska och kemiska egenskaperna hos den tryckta biobläcket i största möjliga utsträckning. denna funktion är mycket attraktiv för biomaterialapplikationer.
De mest kritiska stegen för framgångsrik produktion av mikrokarrier av rätt storlek är: 1) Förberedelse av munstycken med spetsar med lämpliga diametrar och 2) anpassning av lämplig provtagningshastighet och Vpp beroende på den tryckta bioinkens viskositet. Stabiliteten i mikrokarrierkonstruktionen uppnås ytterligare genom att ta bort satellitdroppar och tillämpa externa drivkrafter. De ökade parametrarna underlättar bildandet av mikrokarrier, men överdrivna drivkrafter är den främsta orsaken till satellitmikrokartbildning, vilket resulterar i en inhomogen mikrokartörstorlek. För att förbättra mikrokartärstorlekens enhetlighet rekommenderas därför att lämpliga (inte överdrivna) provtagningshastigheter och Vpp används. En annan aspekt för att förbättra mikrokartets stabilitet är tillämpningen av externa drivkrafter. De yttre drivkrafterna kompletterar det statiska trycket och nedåtgående drivkrafter och arbetar tillsammans för att övervinna ytspänningen vid spetsen. En sprutpump som tryckte på experimenterades med för att mata munstycket och komplettera ytterligare tryckkrafter. Specifikt var munstycket anslutet till en spruta, vars tryckhastighet justerades av en precisionssprutpump. Denna metod tillät samma koncentration av hydrogellösning att bilda mikrodroppar vid begränsade parametrar, vilket är fördelaktigt för att minska mikrokartrarens storlek. Andra studier har rapporterat användning av elektrostatiska fält eller klämningsreservoarer för att främja mikrodroplettryck27,28.
Även om tillämpningen av externa drivkrafter förväntas bredda utbudet av typer och koncentrationer av utskrivbara bläck, står trycktekniken som används här fortfarande inför utmaningen med begränsade drivkrafter och är fortfarande ineffektiv för högvisopsitetsfärger.
Genomförbarheten av microcarrier förberedelse och cell vidhäftning med hjälp av en AVIFJ 3D skrivare var preliminärt verifieras. Efterföljande arbete kommer att fokusera på mikrokarriers potentiella tillämpningar vid konstruktion av biologiska modeller. I framtida forskning kommer cell vidhäftningsprocessen att optimeras så att antalet och typerna av celler kommer att ökas ytterligare och berikas, vilket förväntas bilda ett funktionellt vävnads- eller kärlnätverk. Dessutom kommer bioink att skrivas ut ytterligare med celler för att bilda funktionella heterogena strukturella enheter. Mikrokapslar, mikropartiklar och andra strukturer kan också laddas inuti mikrokarriers för att bilda en hållbar läkemedelsfrisättningsmodell för klinisk användning. Sammanfattningsvis har en metod utvecklats för att konstruera vävnadsmikroenheter, som förväntas skalas upp för att bilda in vitro-funktionella mikrovävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) och 111 Project (B17026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
