Summary
하이드로겔 마이크로캐리어의 시공을 가능하게 하는 점성 관성력을 번갈아 가며 구동되는 온화한 3D 프린팅 기술이 여기에 제시되어 있다. 수제 노즐은 유연성을 제공하므로 다양한 재료와 직경을 쉽게 대체할 수 있습니다. 직경 50-500 μm의 세포 결합 마이크로 캐리어는 추가 배양을 위해 얻어서 수집할 수 있습니다.
Abstract
마이크로 캐리어는 직경 60-250 μm및 대규모 세포 배양을 위한 운반체로 일반적으로 사용되는 큰 특정 표면적을 가진 구슬입니다. 마이크로 캐리어 배양 기술은 세포 학 연구의 주요 기술 중 하나가되었으며 대규모 세포 확장 분야에서 일반적으로 사용됩니다. 마이크로 캐리어는 또한 체외 조직 엔지니어링 건설 및 임상 약물 선별에서 점점 더 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 마이크로 캐리어를 준비하기위한 현재 의 방법은 종종 복잡한 흐름 채널 설계, 호환되지 않는 2 상 인터페이스 및 고정 노즐 모양에 의존하는 미세 유체 칩과 잉크젯 인쇄를 포함한다. 이러한 방법은 여러 바이오잉크에 적용될 때 복잡한 노즐 처리, 불편한 노즐 변경 및 과도한 압출력의 과제에 직면해 있습니다. 이 연구에서는, 번갈아 점성-관성 힘 제팅이라고 불리는 3D 프린팅 기법이 직경 100-300 μm의 하이드로겔 마이크로 캐리어의 건설을 가능하게 하기 위해 적용되었다. 세포는 이후에 조직 공학 모듈을 형성하기 위해 마이크로 캐리어에 시드되었다. 기존 방법에 비해 이 방법은 무료 노즐 팁 직경, 유연한 노즐 스위칭, 인쇄 파라미터의 자유로운 제어, 광범위한 생리활성 재료에 대한 가벼운 인쇄 조건을 제공합니다.
Introduction
마이크로 캐리어는 직경 60-250 μm및 큰 특정 표면적을 가진 구슬이며 일반적으로 세포의 대규모 배양에 사용된다1,2. 그들의 외부 표면은 세포에 대한 풍부한 성장 부위를 제공하고, 내부는 공간 확산을위한 지원 구조를 제공합니다. 구형 구조는 또한 pH, O2 및 영양소와 대사 산물의 농도를 포함한 파라미터를 모니터링하고 제어하는 데 편리함을 제공합니다. 교반탱크 생물반응기와 함께 사용하면 마이크로캐리어는 기존 배양에 비해 상대적으로 적은 부피로 더 높은 세포 밀도를 달성할 수 있어 대규모 배양3를 달성하는 비용 효율적인 방법을 제공한다. 마이크로캐리어 배양 기술은 세포학 연구의 주요 기술 중 하나가 되었으며, 줄기세포, 간세포, 연골세포, 섬유아세포 및 기타 구조물의 대규모 확장 분야에서 많은 진전이 이루어지고 있다. 그(것)들은 또한 이상적인 약 납품 차량 및 상향식 단위로, 그러므로 임상 약 검열 및 체외 조직 공학 수리에 있는 점점 중요한 역할을 취하는 것으로 밝혀졌습니다5.
다양한 시나리오에서 기계적 특성 요구 사항을 충족하기 위해 여러 유형의 하이드로겔 재료가 마이크로 캐리어 6,7,8,9,10,11의 건설에 사용하기 위해 개발되었습니다. 알기네이트와 히알루론산(HA) 하이드로겔은 생체 적합성과 교차 연결성 12,13로 인해 가장 많이 사용되는 마이크로캐리어 물질 중 두 가지입니다. 알기네이트는 염화칼슘에 의해 쉽게 교차 연결될 수 있으며, 그 기계적 특성은 교차 연결 시간을 변경하여 변조될 수 있다. 티라민-공주 HA는 과산화수소와 고추냉이 과산화기 과산화기과 고추냉이 과산화기과 고추냉이에 의해 촉매된 티라민 모에이티의 산화 결합에 의해 교차 연결됩니다. 콜라겐은 독특한 나선형 구조와 교차 연결된 섬유 네트워크로 인해 종종 세포 부착을 촉진하기 위해 마이크로 캐리어에 혼합하는 보조체로 사용됩니다15,16.
마이크로 캐리어를 준비하기위한 현재 의 방법은 미세 유체 칩을 포함, 잉크젯 인쇄, 및 전기 스프레이17,18,19,20,21,22,23. 미세 유체 칩은 균일한 크기의 마이크로 캐리어24를 생산하는 데 빠르고 효율적인 것으로 입증되었습니다. 그러나 이 기술은 복잡한 흐름 채널 설계 및 제조 프로세스25에 의존합니다. 잉크젯 인쇄 시 고온 또는 과도한 압출력뿐만 아니라 전기 스프레이 접근법에서 강렬한 전기장은 재료, 특히 생물학적 활성의 특성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다19. 또한, 다양한 생체 재료와 직경에 적용될 때, 이러한 방법에 사용되는 맞춤형 노즐은 제한된 처리 복잡성, 높은 비용 및 낮은 유연성을 초래합니다.
마이크로캐리어 준비를 위한 편리한 방법을 제공하기 위해, 수레겔 마이크로캐리어를 시공하기 위해 점성-관성력 분사(AVIFJ)를 번갈아 하는 3D 프린팅 기술이 적용되었다. 이 기술은 수직 진동 중에 발생하는 하향 구동력과 정적 압력을 활용하여 노즐 팁의 표면 장력을 극복하고 물방울을 형성합니다. 가혹한 힘 및 열 조건 대신, 작은 급속한 변위는 인쇄 도중 노즐에 직접 작용하여 생잉크의 물리화학적 특성에 사소한 영향을 미치고 생리 활성 물질에 대한 큰 매력을 제시합니다. AVIFJ 방법을 활용하여 직경 100-300 μm의 다중 생체 재료의 마이크로 캐리어가 성공적으로 형성되었습니다. 게다가, 마이크로 캐리어는 세포를 잘 결합하고 부착 된 세포에 적합한 성장 환경을 제공하는 것이 더 입증되었다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 고혈당 덜벡코의 수정된 최소 필수 매체(H-DMEM)를 10% 태아소 혈청(FBS), 1% 비필수 아미노산 용액(NEAA), 1% 페니실린 G 및 연쇄절제술증, 1% 글루타민 보충제를 A549 세포배양매체로 보충한다.
- 37°C에서 CO2 인큐베이터에 있는 배양 A549 세포와 5% CO2
- 약 80%의 합류에서 트립신을 사용하여 하위 배양을 위한 세포를 해리합니다.
- 3mL의 트립신을 사용하여 T75 배양물에서 37°C에서 3분 동안 플라스크를 치료한 다음 배양 배지 6mL을 추가하여 트립시화를 중지합니다.
- 느슨하게 부착 된 세포를 수확하는 배양 배지를 피펫.
- 원심 분리기 는 72.5 x g 에서 3 분 동안. 상체를 제거하고 신선한 매체의 3mL로 다시 중단합니다.
- 1mL의 새로운 T75 배양 플라스크에 1mL의 세포 현탁액을 신선한 배지의 10mL를 함유한다. 2일마다 배양 매체를 변경합니다.
2. 노즐 준비
- 제조업체의 지시에 따라 유리 마이크로 파이프를 풀러에 로드합니다. 마이크로 제트 파이프의 외부 직경, 내부 직경 및 길이는 각각 1.5mm, 1.1mm 및 100mm입니다.
- 풀러에 대한 당기는 매개 변수를 설정합니다. 구체적으로, 열, 당기기, 속도, 시간 및 압력의 값은 기본적으로 각각 560, 255, 255, 150 및 500으로 설정됩니다. 이러한 매개 변수 에서 노즐을 당깁니다.
주의: 이륙 후 얻은 노즐은 매우 날카롭고 부주의한 수술로 인해 부상을 입을 수 있습니다. - 제조업체의 지시에 따라 마이크로 포지 장치에 의해 지정된 직경에서 생성된 노즐(2.2단계)을 잘라 내어 특정 팁 직경을 얻습니다. 구체적으로, 가열 된 백금 와이어에 노즐의 지정된 직경을 찾습니다. 와이어를 약 5s에 대해 60 °C까지 가열하고 노즐을 분리합니다.
- 노즐의 인쇄헤드를 소수성 제제에 30분 동안 담그고, 그 다음에는 멸균된 물로 헹구는 세 사이클을 제공합니다.
- 인쇄하기 전에 노즐을 알코올로 5분 동안 살균하고 살균된 물로 세 번 헹구어 잔류 알코올을 제거합니다.
3. 하이드로겔 바이오잉크 준비
- NaCl(0.45 g)을 멸균수 50mL에 녹여 0.9%(w/v) NaCl 용액을 얻습니다. 용해를 촉진하기 위해 솔루션을 진동합니다. 완전히 용해 된 후 0.45 μm 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필터 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.
- 저점도 나트륨 알기네이트 분말(1g)을 계량하고 NaCl 용액(Step 3.1)의 25mL에 하룻밤 사이에 60-80°C의 고온에서 용해하여 4%(w/v) 나트륨 알기네이트 스톡 용액을 얻습니다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
- 알긴산 나트륨 스톡 용액(3.2단계)을 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 30분 간 살균한다.
- 알기네이트 나트륨 재고 용액(3.3단계)을 0.9% NaCl 용액(3.1단계)으로 희석하여 2%, 1.5%, 0.5%(w/v)로 희석합니다.
참고: 오븐에서 가열하는 것 외에도, 알기네이트 나트륨 용액의 다른 준비 과정은 후드에서 수행되어야 합니다. - 4%(w/v) 젤라틴 스톡 용액을 얻기 위해 하룻밤 사이에 60-80°C의 고온에서 NaCl 용액(Step 3.1)의 25mL에 젤라틴 분말 1g을 녹입니다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
- 젤라틴 스톡 용액(3.5단계)을 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 30분 간 살균한다.
- 젤라틴 주식 용액의 적절한 부피(3.6단계)를 0.9% NaCl 용액(단계 3.1)으로 희석하여 1.5%(w/v)의 농도로 희석합니다.
참고 : 오븐에서 가열하는 것 외에도 젤라틴 용액의 다른 준비 과정이 후드에서 수행되어야합니다. - 마이크로 캐리어에 세포 결합을 촉진하기 위해, 2 % (w /v) 나트륨 알기네이트 용액과 3 :1의 비율로 쥐 꼬리 (4 mg / mL)에서 타입 I 콜라겐 용액을 혼합하여 알지네이트 콜라겐 용액을 준비합니다. 0.1 M NaOH 솔루션으로 pH 7.2로 솔루션을 조정하고 준비 후 즉시 사용하십시오.
- 티로신 변형 HA flocculent 고체인 인산완충식 살린(PBS) 용액을 하룻밤 사이에 60-80°C에서 용해하여 티로신 변형 히알루론산 PBS 용액을 0.8% w/w로 확보한다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
- 30분 동안 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 티로신 변형 HA PBS 용액을 살균한다.
- PBS 용액에 고추냉이 과산화효소 분말(500효소 활성 단위/mg)을 용해하여 8개의 효소 활성 유닛/mg 고추냉이 과산화구체 PBS 용액을 확보한다.
- 디워터에서 4mM로 과산화수소 용액(30%, w/w)을 희석시 희석시켰다.
- 티로신 변형 히알루론산 PBS 용액과 고추냉이 과록시다제 PBS 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 수정된 HA-고추냉이 과록시다제 용액을 준비한다.
참고: 오븐에서 가열하는 것 외에도 HA-고추냉이 과산화제 용액의 다른 준비 과정이 후드에서 수행되어야 합니다.
4. AVIFJ를 기반으로 한 마이크로 드롭렛 형성
- 이전에 보고된 대로 가정용 세포 인쇄 시스템을 사용합니다(그림 1A)26. 파형 발생기의 전기 신호 출력은 먼저 증폭된 다음 압전 세라믹을 구동하여 제어 가능한 변형을 생성합니다. 압전 세라믹에 고정된 노즐은 제어 가능한 진동을 생성합니다.
- 하룻밤 사이에 75%(v/v) 알코올및 자외선(UV)으로 닦아 인쇄 시스템을 살균합니다.
- 일회용 멸균 주사기에 5mL의 바이오잉크(3.1단계)를 적재한다. 주사기 펌프에 주사기를 설치합니다.
- 주사기(4.3단계) 및 노즐(2.5단계)을 내부 직경 1mm의 실리콘 호스와 연결합니다.
- 클램핑 나사의 압박감을 조정하여 인쇄에 사용할 노즐(4.4단계)을 수정합니다. 노즐 의 끝은 손상과 오염을 방지하기 위해 설치 하는 동안 기판에서 멀리 유지.
주의: 설치 중에 노즐이 파손된 경우 두꺼운 장갑을 착용하고 유리 조각과 잔류물을 조심스럽게 청소하십시오. - 주사기 펌프를 빠르게 밀어 노즐(4.5단계)에 바이오잉크(4.3단계)를 적재한다. 유량을 30 μL/분으로 설정합니다. 끝에 여분의 재료를 닦아.
- 신호 발생기 매개 변수를 설정합니다. 500,000개의 샘플링 점을 포함하는 자체 설계 파형을 가져옵니다. 샘플링 속도와 피크-투-피크 전압(Vpp)을 각각 500만 개의 샘플/s 및 10V로 설정합니다.
- 깨끗한 슬라이드 또는 탈온화 된 물로 페트리 요리. 노즐 아래에 인쇄 기판으로 놓습니다.
- 모션 경로를 미리 설정하고 진동 모드를 주문형 드롭으로 트리거합니다.
- 미리 설계된 패턴에 따라 액적을 인쇄합니다.
5. AVIFJ를 기반으로 하는 마이크로 캐리어 형성
- 반복 단계 4.1-4.4, 바이오 잉크를 2% (w/v) 알기네이트 용액(단계 3.4), 알기네이트 콜라겐 용액(Step 3.8) 또는 수정된 HA-고추냉이 과록시다제 용액(step 3.13)으로 변경하는 것을 제외하고는.
- 염화칼슘 3g을 멸균수 100mL에 녹여 3%(w/v) 염화칼슘 용액을 얻습니다. 완전히 용해 된 후 0.45 μm 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필터 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.
- 5mL의 교차 연결 용액(염화칼슘 용액 또는 과산화수소 용액)을 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 노즐 아래에 놓아 기판으로 작동합니다.
- 인쇄 후 마이크로 캐리어를 3 분 동안 교차 연결합니다.
- 원심분리기 튜브에서 마이크로캐리어 서스펜션을 수집하고, 3분 동안 29 x g 의 원심분리로 마이크로캐리어를 풍부하게 합니다. 약 600 마이크로 캐리어 / mL에서 문화 매체에서 마이크로 캐리어를 다시 중단합니다.
6. 마이크로 캐리어의 표면에 세포를 접종
- 세포의 관찰을 용이하게 하기 위해 세포 추적기 녹색 CMFDA를 가진 스테인 A549 세포. 구체적으로, 배양 매체를 제거하고, 10 μM 셀 트래커 염료를 함유한 혈청 없는 배지 5mL를 추가하고, 인큐베이터에서 30분 동안 세포를 배양한다. 그런 다음 염료 용액을 신선한 매체로 대체합니다.
- 1.6 x 106 세포/mL의 밀도로 A549 세포 현탁액을 다시 중단합니다.
- 알기네이트 콜라겐 마이크로캐리어 서스펜션(Step 5.3)과 A549 세포 서스펜션(Step 6.1)의 1mL을 저부착 6웰 배양판에 넣습니다.
- 플레이트를 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에 30rpm에 셰이커에 놓습니다.
- 셰이커에서 접시를 꺼내 마이크로 캐리어가 정착 할 때까지 30 분 기다립니다. 절반은 2일마다 배양 매체를 변경합니다.
7. 마이크로 드롭렛 /마이크로 캐리어 형성의 분석
- 노즐(2.2단계), 페트리 접시(4.10 단계 및 단계 5.4), 미세 운반체(6.5단계)를 가진 세포를 관찰하고 측정하여 밝은 필드 현미경 또는 공초점 현미경으로 측정한다. 구체적으로, 객관적배율은 4배, 10배, 20배이고 접안의 배율은 10배이다.
- ImageJ 소프트웨어로 마이크로 캐리어의 직경을 측정합니다. 사진에서 촬영할 때 현미경과 함께 제공되는 스케일 바에 따르면 ImageJ에서 스케일의 실제 크기를 설정하고 마이크로 캐리어의 반경 또는 반경 또는 반주요 축의 10 줄을 그립니다. ImageJ는 이러한 선 세그먼트의 평균 크기와 표준 편차를 얻을 수 있습니다.
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Representative Results
다양한 수렴속도와 직경의 인쇄헤드는 여러 유형의 재료의 인쇄를 달성하기 위해 제작되었습니다. 당김 강도가 증가하여 얻은 노즐은 도 1B에 도시된다. 노즐은 저수지(III), 수축(II), 프린트헤드(I)의 세 가지 영역으로 나뉘었다. 저수지는 노즐의 처리되지 않은 부분으로, 액체가 인쇄를 위한 정적 압력 및 생체 잉크 입력을 제공했습니다. 수축 지역은 하향 구동력을 생성하는 주요 부분이었다. 당김 강도는 프린트헤드에 큰 영향을 미쳤으며, 확장된 풀 강도로 낮은 수렴률을 보여 줬다. 인쇄 중 표면 장력을 높이고 이산 마이크로드롭렛형성이 더 어려워졌지만, 후속 작업에서 직경이 작은 팁을 절단하는 것이 촉진되었습니다. 그 후, 바늘 위조 기구와 함께, 인쇄헤드는 지정된 직경(도 1C)에서 차단되었다. 100, 120, 150 및 200 μm을 포함한 다양한 직경의 팁은 다양한 체외 미세 조직의 요구 사항을 충족하여 다양한 크기의 마이크로 캐리어를 생성할 수 있었습니다.
인쇄 공정의 안정성과 제어성은 먼저 페트리 접시에 방울을 인쇄하여 검증되었습니다. 30 μm 팁 노즐, PBS를 포함한 여러 바이오잉크, 1.5% 알자네이트, 1.5% 젤라틴이 안정적으로 인쇄되었다(그림 2A, B). 특정 바이오잉크인쇄의 어려움은 인쇄에 사용되는 샘플링 속도와 Vpp에 반영되었다. NaCl 솔루션과 같은 낮은 점도 바이오잉크를 더 작은 파라미터로 인쇄하여 물방울 직경이 작아졌습니다. 점도가 증가함에 따라 더 큰 드라이브 힘이 필요하고 더 큰 물방울이 얻을 수 있기 때문에 인쇄 과정이 더욱 어려워졌습니다(그림 2B). 이 메커니즘을 사용하면, 주어진 바이오잉크에 대한 파라미터 및 구동력의 조정을 사용하여 도 2C에 나와 같이 다른 액적 크기를 조정할 수 있다. 도 2D 는 평평한 표면에 특정 문자 "THU"를 형성하는 물방울의 배열을 나타낸다. 게다가, 현미경 관측의 조합은 100 μm 내의 작은 비늘에서 마이크로 방울의 국소화를 허용했습니다.
알기네이트 마이크로 캐리어 (그림 3A) 및 HA 마이크로 캐리어 (그림 3C)는 서로 다른 직경의 팁으로 인쇄되었다. 알지네이트 마이크로캐리어 직경에 대한 팁 직경의 효과는 도 3B에 도시된다. 크기가 너무 작을 때 용액의 휘발화에 의한 막힘에 의해 제한되고, 인쇄된 알지네이트 마이크로캐리어의 가장 작은 직경은 약 100μm이었다. 가장 큰 직경은 최대 300 μm에 도달 할 수 있지만. 인쇄된 마이크로캐리어의 직경은 팁 직경에 따라 증가하며 항상 후자보다 큽습니다. 팁의 직경이 250 μm보다 크면 바이오잉크를 인쇄할 수 없습니다. 인쇄된 HA 마이크로캐리어의 직경은 76.7± 1.8 μm이고 팁 직경은 75μm(도 3C)였다.
A549 세포와 알기네이트 콜라겐 마이크로 캐리어는 접시에 씨를 뿌리고 인큐베이터의 셰이커에 배치되었다. 상기 세포는 2일 동안 혼합한 후 알지네이트 콜라겐 마이크로캐리어를 부착하는 것으로 관찰되었다. 세포는 점진적으로 증식에 의해 마이크로 캐리어의 더 큰 표면을 커버. 6 일 동안 재배 한 후, A549 세포는 거의 완전히 마이크로 캐리어 표면을 덮었다. 이러한 결과는 개발된 마이크로캐리어가 세포를 잘 결합하고 세포에 적합한 성장 환경을 제공할 수 있음을 확인한다. 마이크로캐리어의 표면에서 고동및 확산되는 A549 세포의 밝은 필드 영상 및 공초점 이미지가 도 4에 도시된다.
그림 1: AVIFJ 인쇄 시스템 및 다양한 직경의 노즐 준비. (A) AVIFJ 노즐 설치. (B) 특정 PULL 매개 변수하에서 노즐의 인쇄헤드는 서로 다른 속도로 수렴하도록 형성되었다. 스케일 바: 200 μm. (C) 바늘 단조 기구와 함께, 팁은 지정된 위치에서 차단되었다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: AVIFJ. (A)에 의해 다양한 농도에서 여러 유형의 생체 재료의 인쇄는 결과의이 섹션에 사용되는 노즐. 팁의 직경은 30 μm이었습니다. 스케일 바: 100 μm. (B) PBS, 1.5% 알자네이트, 1.5% 젤라틴을 포함한 여러 종류의 하이드로겔 재료의 인쇄 M: 초당 백만 개의 샘플이 단일 진동의 지속 시간을 반영합니다. V: 단일 진동의 스트로크를 반영하는 피크 투 피크 전압입니다. 스케일 바: 100 μm. (C) 다양한 매개 변수에서 0.5 % 알자네이트의 인쇄. 스케일 바: 100 μm. (D) 2D 배열 및 물방울의 가까운 위치. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 노즐 팁의 직경이 다른 마이크로캐리어 (A) 2% 알기네이트 마이크로캐리어로 인쇄된 마이크로캐리어는 각각 70, 100, 130, 160, 210 및 250 μm의 노즐 팁 직경으로 인쇄됩니다. 스케일 바: 100 μm. (B) 마이크로 캐리어의 크기에 노즐 팁 직경의 효과. 서로 다른 직경의 노즐로 인쇄된 마이크로캐리어의 크기는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석되었다. 각 노즐에 대해 10개의 마이크로캐리어를 선택하고 계산했습니다. 데이터는 평균 ± s.d. (C) 75 μm에서 팁 직경을 가진 변형 된 HA 마이크로 캐리어로 표시됩니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 알지네이트 콜라겐 마이크로 캐리어에 파종 세포. (A) 마이크로 캐리어의 표면에 준수 및 확산 A549 세포의 밝은 필드 이미지. 스케일 바: 100 μm. (B) 마이크로 캐리어의 표면에 준수하고 확산 A549 세포의 공초점 이미지. 스케일 바: 100 μm. 점선 타원은 마이크로 캐리어의 경계를 강조하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 다중 유형의 하이드로겔 마이크로 캐리어 및 후속 세포 파종의 제조를 위한 지침을 제공합니다. 미세 유체 칩 및 잉크젯 인쇄 방법에 비해 마이크로 캐리어를 구축하는 AVIFJ 접근 방식은 더 큰 유연성과 생체 적합성을 제공합니다. 독립적인 노즐은 유리 마이크로파이프를 포함한 다양한 경량 노즐을 이러한 인쇄 시스템에 사용할 수 있습니다. 제어성이 높은 처리는 저수지의 부피, 내부 직경 및 인쇄헤드의 모양을 포함한 파라미터를 자유롭게 조정할 수 있게 합니다. 또한 일회용 노즐은 여러 물질 중전환을 위한 살균을 용이하게 하여 반복적인 사용으로 인한 잠재적 오염을 방지합니다. 마지막으로, 작고 빠른 변위는, 대신 심한 힘과 열 조건, 인쇄 공정 동안 노즐에 직접 작용하여 인쇄된 바이오잉크의 원래 물리적 및 화학적 특성을 최대 범위까지 유지한다. 이 기능은 생체 재료 응용 분야에 매우 매력적입니다.
올바른 크기의 마이크로 캐리어의 성공적인 생산을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 적절한 직경의 팁노즐을 준비하고, 2) 인쇄 된 바이오 잉크의 점도에 따라 적절한 샘플링 속도와 Vpp를 적응. 마이크로 캐리어 건설의 안정성은 위성 물방울을 제거하고 외부 동력을 적용하여 더욱 달성된다. 증가된 파라미터는 마이크로캐리어의 형성을 용이하게 하지만 과도한 구동력은 위성 마이크로캐리어 형성의 주요 원인으로, 그 결과 불균성 마이크로캐리어 크기가 있다. 따라서, 마이크로 캐리어 크기의 균일성을 향상시키기 위해, 적절한 (과도하지 않음) 샘플링 속도와 Vpp를 사용하는 것이 좋습니다. 마이크로 캐리어 안정성을 개선하기위한 또 다른 측면은 외부 구동력의 적용입니다. 외부 구동력은 정압과 하방 구동력을 보완하여 끝의 표면 장력을 극복하기 위해 함께 작업합니다. 주사기 펌프 를 밀어 노즐과 추가 추진 힘을 공급하기 위해 실험했다. 특히 노즐은 주사기에 연결되었으며, 정밀 주사기 펌프로 푸시 속도가 조정되었습니다. 이 방법은 하이드로겔 용액의 동일한 농도가 제한된 파라미터에서 마이크로드롭렛을 형성할 수 있도록 허용했으며, 이는 마이크로 캐리어의 크기를 줄이는 데 도움이 됩니다. 다른 연구는 마이크로 드롭렛 인쇄를 촉진하기 위해 정전기 장 또는 압착 저수지의 사용을보고했다27,28.
외부 동력을 적용하면 인쇄 가능한 잉크의 종류와 농도의 범위가 넓어질 것으로 예상되지만, 여기서 사용되는 인쇄 기술은 여전히 제한된 구동력의 과제에 직면하고 있으며 점도가 높은 잉크에는 여전히 효과가 없습니다.
AVIFJ 3D 프린터를 이용한 마이크로캐리어 제제 및 세포 접착의 타당성은 예비적으로 검증되었다. 후속 작업은 생물학적 모델의 건설에 마이크로 캐리어의 잠재적 인 응용 프로그램에 초점을 맞출 것이다. 향후 연구에서는 세포 접착 과정이 최적화되어 세포의 수와 유형이 더욱 증가하고 풍부해질 것이며, 이는 기능성 조직 또는 혈관 네트워크를 형성할 것으로 예상된다. 게다가, 바이오크는 기능성 이기종 구조 단위를 형성하기 위해 세포와 더 공동 인쇄 될 것입니다. 마이크로 캡슐, 미세 입자 및 기타 구조는 또한 임상 사용을 위한 지속적인 약물 방출 모형을 형성하기 위하여 마이크로 캐리어 안쪽에 적재될 수 있습니다. 요약하자면, 시험 관 내 기능성 마이크로 조직을 형성하기 위해 확장될 것으로 예상되는 조직 마이크로 유닛을 구성하는 방법이 개발되었다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 베이징 자연과학 재단(3212007), 칭화대학교 이니셔티브 과학 연구 프로그램(20197050024), 칭화대학교 봄바람기금(20201080760), 중국 국립자연과학재단(51805294), 중국 국립지질과학재단(2018YFA0703004), 111개 프로젝트(B17026)가 후원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
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