Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדפסה תלת-ממדית של מיקרוקארים הידרוג'ל במבחנה על ידי סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין

Published: April 21, 2021 doi: 10.3791/62252
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Biomanufacturing Center, Dept. of Mechanical Engineering, Tsinghua University, 2Biomanufacturing and Rapid Forming Technology Key Laboratory of Beijing, 3Department of Mechanical Engineering, Drexel University
* These authors contributed equally

Summary

מוצג כאן היא טכניקת הדפסה 3D מתון מונע על ידי כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין כדי לאפשר את הבנייה של מיקרוקארים הידרוג'ל. חרירים תוצרת בית מציעים גמישות, ומאפשרים החלפה קלה לחומרים וקטרים שונים. מיקרוקארים מחייבים תא בקוטר של 50-500 מיקרומטר ניתן להשיג ולאסוף עבור culturing נוסף.

Abstract

Microcarriers הם חרוזים עם קוטר של 60-250 מיקרומטר ושטח פנים ספציפי גדול, אשר משמשים בדרך כלל כנשאים עבור תרביות תאים בקנה מידה גדול. טכנולוגיית תרבות המיקרוקרייר הפכה לאחת הטכניקות העיקריות במחקר ציטולוגי והיא נפוצה בתחום התרחבות התאים בקנה מידה גדול. Microcarriers הוכחו גם לשחק תפקיד חשוב יותר ויותר בבניית הנדסת רקמות במבחנה והקרנת תרופות קליניות. השיטות הנוכחיות להכנת מיקרוקריירים כוללות שבבים מיקרופלואידיים והדפסת הזרקת דיו, המסתמכים לעתים קרובות על עיצוב ערוץ זרימה מורכב, ממשק דו-פאזי לא תואם וצורת זרבובית קבועה. שיטות אלה מתמודדות עם האתגרים של עיבוד זרבובית מורכב, שינויי זרבובית לא נוחים, וכוחות שחול מוגזמים כאשר מוחלים על bioink מרובים. במחקר זה, טכניקת הדפסה 3D, הנקראת סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין, הוחלה כדי לאפשר בנייה של מיקרוקארים הידרוג'ל בקוטר של 100-300 מיקרומטר. תאים נזרעו לאחר מכן על מיקרו-מכוניות כדי ליצור מודולים להנדסת רקמות. בהשוואה לשיטות הקיימות, שיטה זו מציעה קוטר קצה זרבובית חינם, החלפת זרבובית גמישה, שליטה חופשית בפרמטרים של הדפסה ותנאי הדפסה קלים למגוון רחב של חומרים ביו-אקטיביים.

Introduction

Microcarriers הם חרוזים עם קוטר של 60-250 מיקרומטר ושטח פנים ספציפי גדול והם משמשים בדרך כלל עבור תרבות בקנה מידה גדול של תאים1,2. המשטח החיצוני שלהם מספק אתרי צמיחה בשפע לתאים, והפנים מספקים מבנה תמיכה להתפשטות מרחבית. המבנה הכדורי מספק גם נוחות בניטור ובקרה של פרמטרים, כולל pH, O2, וריכוז של חומרים מזינים ומטבוליטים. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם bioreactors טנק מעורבב, microcarriers יכול להשיג צפיפות תאים גבוהה יותר בנפח קטן יחסית לעומת תרבויות קונבנציונליות, ובכך לספק דרך חסכונית להשיג תרביות בקנה מידה גדול3. טכנולוגיית תרבות מיקרוקרייר הפכה לאחת הטכניקות העיקריות במחקר ציטולוגי, והתקדמות רבה נעשתה בתחום ההתרחבות בקנה מידה גדול של תאי גזע, הפטוציטים, כונדרוציטים, פיברובלסטים ומבנים אחרים4. הם גם נמצאו כלי רכב משלוח סמים אידיאליים ויחידות מלמטה למעלה, ולכן לוקח על עצמו תפקיד חשוב יותר ויותר בהקרנת תרופות קליניות ותיקון הנדסת רקמות במבחנה5.

כדי לענות על דרישות רכוש מכני בתרחישים שונים, סוגים רבים של חומרים הידרוג'ל פותחו לשימוש בבניית microcarriers6,7,8,9,10,11. הידרוג'לים של חומצה אלגינטית וחומצה היאלורונית (HA) הם שניים מהחומרים המיקרו-קרוריים הנפוצים ביותר בשל תאימותם הביולוגית הטובה ויכולת ההצלבה שלהם12,13. Alginate יכול להיות מקושר בקלות על ידי סידן כלוריד, ואת המאפיינים המכניים שלה ניתן לאפנן על ידי שינוי הזמן חוצה קישור. HA מצומד טיירמין מקושר על ידי צימוד חמצוני של moieties טירמין מזורז על ידי מי חמצן ופרוקסידאז חזרת14. קולגן, בשל המבנה הספירלי הייחודי שלו ורשת סיבים מקושרת, משמש לעתים קרובות כאדג'ובנט להתערבב לתוך microcarriers כדי לקדם עוד יותר את הקובץ המצורף לתאים15,16.

השיטות הנוכחיות להכנת מיקרוקריירים כוללות שבבים מיקרופלואידיים, הדפסת הזרקת דיו ו electrospray17,18,19,20,20,21,22,23. שבבים מיקרופלואידיים הוכחו כמהירים ויעילים בייצור מיקרו-קרניים בגודל אחיד24. עם זאת, טכנולוגיה זו מסתמכת על תכנון וייצור ערוץ זרימה מורכב25. טמפרטורה גבוהה או כוחות שחול מוגזמים במהלך הדפסת הזרקת דיו, כמו גם שדות חשמליים אינטנסיביים בגישת electrospray, עלול להשפיע לרעה על המאפיינים של החומר, במיוחד את הפעילות הביולוגית שלה19. חוץ מזה, כאשר מוחל על ביו-חומרים וקטרים שונים, חרירים מותאמים אישית המשמשים בשיטות אלה לגרום למורכבות עיבוד מוגבלת, עלות גבוהה, וגמישות נמוכה.

כדי לספק שיטה נוחה להכנת מיקרוקרייר, טכניקת הדפסה תלת-ממדית הנקראת סילון כוחות צמיגים-אינרציאליים לסירוגין (AVIFJ) יושמה לבניית מיקרו-מכוניות הידרוג'ל. הטכניקה משתמשת בכוחות הנעה כלפי מטה ובלחץ סטטי שנוצר במהלך רטט אנכי כדי להתגבר על מתח פני השטח של קצה הזרבובית ובכך ליצור טיפות. במקום כוחות חמורים ותנאים תרמיים, עקירות מהירות קטנות פועלות ישירות על הזרבובית במהלך ההדפסה, וגורמות להשפעה מינורית על התכונות הפיזיקוכימיות של הביוינק ומציגות משיכה גדולה לחומרים ביו-אקטיביים. תוך שימוש בשיטת AVIFJ, מיקרוקארים של ביו-חומרים מרובים עם קטרים של 100-300 מיקרומטר נוצרו בהצלחה. חוץ מזה, המיקרו-מכוניות הוכחו עוד יותר כקושרות תאים היטב ומספקות סביבת גדילה מתאימה לתאים דבוקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות התא

  1. יש להשלים את המדיום החיוני המינימלי (H-DMEM) המותאם לגלוקוז גבוה של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פתרון חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% פניצילין G וסטרפטומיצין, ותוסף גלוטמין 1% כמדיה תרבית לתאי A549.
  2. תרבית A549 תאים בחממת CO2 ב 37 °C (5° C) עם 5% CO2
  3. לנתק תאים עבור תת תרבות באמצעות טריפסין ב כ 80% מפגש.
    1. השתמש 3 מ"ל של טריפסין כדי לטפל בתאים בבקבוק תרבית T75 ב 37 °C (3 °F) במשך 3 דקות, ולאחר מכן להוסיף 6 מ"ל של מדיום תרבות כדי לעצור את הטריפסיניזציה.
    2. פיפטה המדיום התרבותי לקצור תאים דבוקים באופן רופף.
    3. צנטריפוגה ב 72.5 x g במשך 3 דקות. הסר את supernatant ו resuspend עם 3 מ"ל של בינוני טרי.
    4. מעבירים 1 מ"ל של השעיית תאים לבקבוקון תרבות T75 חדש המכיל 10 מ"ל של מדיום טרי. שנה את מדיום התרבות כל יומיים.

2. הכנת חרירים

  1. טען מיקרופיפטים מזכוכית על המושך בהתאם להוראות היצרן. הקוטר החיצוני, הקוטר הפנימי והאורך של צינור המיקרו-סילון הם 1.5 מ"מ, 1.1 מ"מ ו-100 מ"מ, בהתאמה.
  2. הגדר את פרמטרי המשיכה עבור המושך. באופן ספציפי, הערכים של חום, משיכה, מהירות, זמן ולחץ מוגדרים ל- 560, 255, 255, 150 ו- 500 כברירת מחדל, בהתאמה. משוך את הזרבובית תחת הפרמטרים האלה.
    אזהרה: הזרבובית המתקבלת לאחר ביצוע ההזמנה חדה מאוד, וניתוח רשלני עלול לגרום לפציעות.
  3. חתוך את הזרבובית המתקבלת (שלב 2.2) בקוטר המיועד על ידי התקן מיקרו-זיוף בהתאם להוראות היצרן כדי לקבל קוטר קצה ספציפי. באופן ספציפי, אתר את הקוטר שצוין של הזרבובית על חוט הפלטינה המחומם. מחממים את החוט עד 60 °C (60 °F) עבור כ 5 s ולמשוך את הזרבובית לגזרים.
  4. לטבול את ראש ההדפסה של הזרבובית בסוכן הידרופובי במשך 30 דקות, ואחריו שלושה מחזורים של שטיפה עם מים מעוקרים.
  5. לפני ההדפסה, לחטא את הזרבובית באלכוהול במשך 5 דקות ולשטוף אותו עם מים מעוקרים שלוש פעמים כדי להסיר את האלכוהול שיורית.

3. הכנת ביונק הידרוג'ל

  1. להמיס NaCl (0.45 גרם) לתוך 50 מ"ל של מים סטריליים כדי לקבל 0.9% (w / v) פתרון NaCl. לרטוט את הפתרון כדי לקדם פירוק. לאחר שהומס לחלוטין, לסנן את הפתרון באמצעות 0.45 מיקרומטר פוליאתילן טרפטלט מסנן קרום.
  2. לשקול אבקת נתרן אלגינט צמיגות נמוכה (1 גרם) ולהמיס אותו ב 25 מ"ל של פתרון NaCl (שלב 3.1) בטמפרטורה גבוהה של 60-80 °C (60°C) לילה כדי לקבל 4% (w / v) פתרון מלאי נתרן אלגינט. פתרון המניה ניתן לאחסן ב 4 °C (65 °F) במשך חודש אחד.
  3. לחטא את פתרון מלאי נתרן אלגינט (שלב 3.2) על ידי חימום אותו שלוש פעמים בתנור (70 °C (70 °F) במשך 30 דקות.
  4. לדלל נפח תקין של פתרון מניית נתרן אלגינט (שלב 3.3) ב 0.9% פתרון NaCl (שלב 3.1) בריכוזים של 2%, 1.5%, ו 0.5% (w /v).
    הערה: בנוסף לחימום בתנור, תהליכי הכנה אחרים של פתרון נתרן אלגינט צריך להתבצע במכסה המנוע.
  5. להמיס 1 גרם אבקת ג'לטין ב 25 מ"ל של פתרון NaCl (שלב 3.1) בטמפרטורה גבוהה של 60-80 °C (60 °F) לילה כדי לקבל 4% (w / v) פתרון מלאי ג'לטין. פתרון המניה ניתן לאחסן ב 4 °C (65 °F) במשך חודש אחד.
  6. לחטא את פתרון מלאי הג'לטין (שלב 3.5) על ידי חימום אותו שלוש פעמים בתנור (70 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות.
  7. לדלל את הנפח הנכון של פתרון מניית ג'לטין (שלב 3.6) בפתרון NaCl של 0.9% (שלב 3.1) בריכוז של 1.5% (w/v).
    הערה: בנוסף לחימום בתנור, תהליכי הכנה אחרים של תמיסת ג'לטין צריכים להתבצע במכסה המנוע.
  8. כדי לקדם את כריכת התאים במיקרו-קרויירים, הכינו את תמיסת הקולגן אלגינט אלגינט על ידי ערבוב תמיסת 2% (w/v) נתרן אלגינט ופתרון קולגן מסוג I מזנב החולדה (4 מ"ג/מ"ל) ביחס של 3:1. התאימו את הפתרון ל-pH 7.2 עם פתרון NaOH של 0.1 M והשתמשו בו מיד לאחר ההכנה.
  9. ממיסים את מוצק HA שעבר שינוי טירוזין בתמיסת תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ב 60-80 °C (60 °F) לילה כדי לקבל 0.8% w / w טירוזין שונה חומצה היאלורונית PBS פתרון. פתרון המניה ניתן לאחסן ב 4 °C (65 °F) במשך חודש אחד.
  10. לחטא את פתרון HA PBS שונה טירוזין על ידי חימום אותו שלוש פעמים בתנור (70 °C (70 °F) במשך 30 דקות.
  11. המיס אבקת פרוקסידאז חזרת (500 יחידת פעילות אנזימים/מ"ג) בתמיסת PBS להשגת 8 יחידות פעילות אנזימים/מ"ג תמיסת PBS של חזרת מ"ג.
  12. לדלל תמיסת מי חמצן (30%, w / w) על ידי מים DI ל 4 מ"מ.
  13. הכן את פתרון ה-HA-חזרת peroxidase שונה על ידי ערבוב פתרון PBS חומצה היאלורונית שונה טירוזין ופתרון PBS פרוקסידאז חזרת ביחס של 1:1.
    הערה: בנוסף לחימום בתנור, תהליכי הכנה אחרים של פתרון peroxidase חזרת HA צריך להתבצע במכסה המנוע.

4. היווצרות מיקרו-טיפות המבוססת על AVIFJ

  1. השתמש במערכת הדפסת תאים ביתית כפי שדווח בעבר (איור 1A)26. תפוקת האות החשמלי על ידי גנרטור צורת הגל מוגברת תחילה ולאחר מכן מניעה קרמיקה פיזואלקטרית כדי ליצור עיוות לשליטה. הזרבובית הקבועה על הקרמיקה הפיזואלקטרית מייצרת ובכך מייצרת תנודות לשליטה.
  2. חטא את מערכת ההדפסה על-ידי ניגוב עם 75% (v/v) אלכוהול וחשיפה אולטרה סגולה (UV) במהלך הלילה.
  3. יש לטעון 5 מ"ל של ביוינק (שלב 3.1) למזרק סטרילי חד פעמי. התקן את המזרק על משאבת המזרק.
  4. חבר את המזרק (שלב 4.3) ואת הזרבובית (שלב 2.5) עם צינור סיליקון בקוטר פנימי של 1 מ"מ.
  5. תקן את הזרבובית (שלב 4.4) שתשמש להדפסה על-ידי התאמת ההידוק של בורג ההידוק. יש להרחיק את קצה הזרבובית מהמצע במהלך ההתקנה כדי למנוע נזק וזיהום.
    אזהרה: אם הזרבובית שבורה במהלך ההתקנה, אנא לבש כפפות עבות יותר ונקה בקפידה שברי זכוכית ושאריות.
  6. דחוף במהירות את משאבת המזרק וטען את הביוינק (שלב 4.3) לזרבובית (שלב 4.5). הגדר את קצב הזרימה ב- 30 μL / min. נגב את החומר העודף בקצה.
  7. הגדר פרמטרים של מחולל אותות. יבא צורת גל בעיצוב עצמי המכילה 500,000 נקודות דגימה. הגדר את קצב הדגימה ואת מתח השיא לשיא (Vpp) כ- 5 מיליון דגימות/s ו- 10 V, בהתאמה.
  8. שקופיות נקיות או מנות פטרי עם מים deionized. הנח אותם מתחת לזרבובית כמצע ההדפסה.
  9. קבעו מראש את נתיב התנועה ואת מצב ההפעלה של הרטט כירידה לפי דרישה.
  10. הדפס את הטיפות בהתאם לתבניות שעוצבו מראש.

5. היווצרות מיקרוקארים המבוססת על AVIFJ

  1. חזור על שלבים 4.1-4.4, למעט לשנות את הביו-ink ל-2% (w/v) פתרון אלגינט (שלב 3.4), תמיסת קולגן אלגינט (שלב 3.8) או פתרון פרוקסידאז HA-חזרת שונה (שלב 3.13).
  2. ממיסים 3 גרם של סידן כלורי לתוך 100 מ"ל של מים סטריליים כדי לקבל 3% (w / v) פתרון סידן כלוריד. לאחר שהומס לחלוטין, לסנן את הפתרון באמצעות 0.45 מיקרומטר פוליאתילן טרפטלט מסנן קרום.
  3. הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת קישור צולבת (תמיסת סידן כלוריד או תמיסת מי חמצן) לצלחת פטרי. מניחים את צלחת פטרי מתחת לזרבובית לעבוד כמצע.
  4. לאחר ההדפסה, להצליב את microcarriers במשך 3 דקות.
  5. לאסוף השעיה microcarrier בצינור צנטריפוגה, ולהעשיר מיקרוקארים על ידי צנטריפוגה ב 29 x גרם במשך 3 דקות. הקדישו מחדש את המיקרו-מכוניות במדיה התרבותית בכ-600 מיקרו-מכוניות/מ"ל.

6. חיסון תאים על פני השטח של מיקרוקארים

  1. כתם A549 תאים עם מעקב תא ירוק CMFDA כדי להקל על התצפית של תאים. באופן ספציפי, להסיר מדיה תרבית, להוסיף 5 מ"ל של מדיום ללא סרום המכיל 10 μM צבע מעקב תא, ודגור תאים במשך 30 דקות באינקובטור. לאחר מכן, החלף את תמיסת הצבע במדיום טרי.
  2. resuspend השעיית התא A549 בצפיפות של 1.6 x 106 תאים / מ"ל.
  3. הוסיפו 1 מ"ל של השעיית מיקרוקרייר אלגינט קולגן (שלב 5.3) ו-1 מ"ל של השעיית תאים A549 (שלב 6.1) לצלחת תרבית נמוכה של 6 בארות.
  4. מניחים את הצלחת על שייקר ב 30 סל"ד באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2.
  5. תוריד את הצלחת מהשייקר ותחכה 30 דקות כדי לתת למיקרו-קארים להתיישב. חצי משנים את מדיום התרבות כל יומיים.

7. ניתוח של היווצרות מיקרו-טיפות/מיקרו-מכוניות

  1. שימו לב ומדדו את הזרבובית (שלב 2.2), את צלחות הפטרי (שלב 4.10 ואת שלב 5.4) ואת התאים עם מיקרוקריות (שלב 6.5) תחת מיקרוסקופ שדה בהיר או מיקרוסקופ קונפוקלי. באופן ספציפי, ההגדלה האובייקטיבית היא 4x, 10x או 20x והגדלת העיניים היא 10x.
  2. מדוד את הקוטר של המיקרו-מכוניות על ידי תוכנת ImageJ. על פי סרגל קנה המידה שמגיע עם המיקרוסקופ בעת הצילום בתמונה, הגדר את הגודל הממשי של קנה המידה ב- ImageJ, וצייר 10 שורות של הרדיוס או הציר הראשי למחצה של המיקרוקארים. ImageJ יכול לקבל את הגודל הממוצע ואת סטיית התקן של מקטעי קו אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ראשי הדפסה של שיעורי התכנסות וקטרים מגוונים היו מפוברקים כדי להשיג את ההדפסה של סוגים מרובים של חומרים. החרירים המתקבלים עם כוח המשיכה הגובר מוצגים באיור 1B. החרירים חולקו לשלושה תחומים: מאגר (III), התכווצות (II) וראש הדפסה (I). המאגר היה החלק הלא מעובד של הזרבובית, שבו הנוזל סיפק לחץ סטטי וקלט ביו-ink להדפסה. אזור ההתכווצות היה החלק העיקרי ביצירת כוחות מניעים כלפי מטה. עוצמת המשיכה השפיעה באופן משמעותי על ראש ההדפסה, והדגימה שיעור התכנסות נמוך יותר עם כוח משיכה מורחב. ראש ההדפסה הצר והארוך יותר הגביר את מתח פני השטח במהלך ההדפסה, מה שהופך את היווצרותם של מיקרו-טיפות נפרדות לקשה יותר, אך הקל על חיתוך טיפים בקוטר קטן יותר בפעולות הבאות. לאחר מכן, עם מכשיר החישול המחט, ראש ההדפסה נחתך בקוטר הייעודי (איור 1C). טיפים עם קטרים שונים, כולל 100, 120, 150, ו 200 מיקרומטר, היו זמינים כדי ליצור microcarriers בגדלים שונים, לענות על הדרישות של מיקרוטיסו במבחנה שונים.

היציבות והשליטה של תהליך ההדפסה אומתו לראשונה על ידי הדפסת טיפות על צלחות פטרי. עם זרבובית קצה של 30 מיקרומטר, הודפסו ביינק מרובה, כולל PBS, 1.5% אלגינט ו-1.5% ג'לטין (איור 2A,B). הקושי בהדפסת ביוינק מסוים בא לידי ביטוי בקצב הדגימה וב-Vpp המשמש להדפסה. ביונק צמיגות נמוכה כגון פתרון NaCl הודפסו בפרמטרים קטנים יותר, וכתוצאה מכך קטרים טיפתיים קטנים יותר. עם התגברות הצמיגות, תהליך ההדפסה נעשה קשה יותר בהתאמה, ככל שכוחות ההנעה הגדולים יותר היו נחוצים וטיפות גדולות יותר היו משיגות (איור 2B). באמצעות מנגנון זה, ניתן להשתמש בהתאמת הפרמטרים וכוחות ההנעה לביוינק נתון כדי להתאים גדלי טיפות שונים, כפי שמוצג באיור 2C. איור 2D מציג את סידור הטיפות היוצרות את האותיות הספציפיות "THU" על משטח שטוח. חוץ מזה, השילוב של תצפיות מיקרוסקופיות מותר לוקליזציה של microdroplets בקנה מידה קטן יותר בתוך 100 מיקרומטר.

מיקרו-מכוניות אלגינטיות (איור 3A) ומיקרו-מכוניות HA (איור 3C) הודפסו עם קצוות בקטרים שונים. ההשפעות של קוטר הקצה על קוטר המיקרו-קרון האלגינט מוצגות באיור 3B. מוגבל על ידי החסימה הנגרמת על ידי התנודתיות של הפתרון כאשר הגודל הוא קטן מדי, הקוטר הקטן ביותר של microcarriers אלגינט מודפס היה כ 100 מיקרומטר. בעוד הקוטר הגדול ביותר יכול להגיע עד 300 מיקרומטר. הקוטר של microcarriers המודפס גדל בקנה אחד עם קוטר הקצה והוא תמיד גדול יותר מאשר האחרון. כאשר קוטר הקצה גדול מ-250 מיקרומטר, לא ניתן להדפיס את הביו-ink. הקוטר של מיקרוקארים HA שעברו שינוי מודפס היה 76.7 ± 1.8 מיקרומטר עם קוטר קצה של 75 מיקרומטר (איור 3C).

תאי A549 ומיקרו-קרני קולגן אלגינט נזרעו בצלחת והונחו על שייקר באינקובטור. התאים נצפו לדבוק microcarriers קולגן אלגינט לאחר ערבוב במשך 2 ימים. תאים מכסים בהדרגה משטח גדול יותר של מיקרו-מכוניות על ידי התפשטות. לאחר הטיפוח במשך 6 ימים, תאי A549 כיסו כמעט באופן מלא את משטחי המיקרו-קרויר. תוצאה זו מאשרת כי microcarriers המפותח יכול לקשור תאים היטב ולספק סביבת צמיחה מתאימה עבור התאים. תמונות שדה בהירות ותמונות קונפוקליות של תאי A549 הנצמדים ומתרבים על פני השטח של המיקרו-מכוניות מוצגים באיור 4.

Figure 1
איור 1: מערכת ההדפסה AVIFJ והכנת חרירים בקטרים שונים. (א) התקנת זרבובית AVIFJ. (B) תחת פרמטרי PULL ספציפיים, ראש ההדפסה של הזרבובית עוצב כך שיתכנס בקצבים שונים. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (ג) עם מכשיר חישול המחט, הקצה נחתך במיקומים ייעודיים. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדפסה של סוגים רבים של ביו-חומרים בריכוזים שונים על-ידי AVIFJ. (A) הזרבובית המשמשת בסעיף זה של התוצאות. קוטר הקצה היה 30 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) הדפסה של סוגים רבים של חומרים הידרוג'ל כולל PBS, 1.5% אלגינט, ו 1.5% ג'לטין בפרמטרים שונים. M: מיליון דגימות לשנייה, המשקף את משך של רטט יחיד. V: מתח שיא לשיא, המשקף את השבץ של רטט יחיד. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (ג) הדפסה של 0.5% אלגינט בפרמטרים שונים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (ד) סידורים דו-ממדיים ומיצוב צמוד של טיפות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקרו-מכוניות המודפסות בקטרים שונים של קצה הזרבובית. (A) 2% מיקרו-קרונות אלגינט, מודפסים עם קוטר קצה זרבובית ב-70, 100, 130, 130, 160, 210 ו-250 מיקרומטר, בהתאמה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) ההשפעה של קוטר קצה הזרבובית על גודל המיקרו-מכוניות. הגדלים של microcarriers מודפס עם חרירים של קטרים שונים נותחו סטטיסטית באמצעות תוכנת ImageJ. עשרה מיקרוקריירים עבור כל זרבובית נבחרו ומחושבים. הנתונים מוצגים כממוצע ± s.d. (C) מיקרוקארים HA שונה מודפס עם קוטר קצה ב 75 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זריעת תאים על מיקרו-פחמן קולגן אלגינט. (A) תמונות שדה בהירות של תאי A549 הנצמדים ומתרבים על פני השטח של המיקרו-מכוניות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) תמונות קונפוקליות של תאי A549 הנצמדים ומתרבים על פני השטח של המיקרו-מכוניות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אליפסות מנוקדות משמשות כדי להדגיש את הגבול של microcarriers. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק הוראות להכנת סוגים רבים של מיקרוקארים הידרוג'ל וזריעת תאים לאחר מכן. בהשוואה לשיטות הדפסת שבבים מיקרופלואידיים והזרקת דיו, גישת AVIFJ לבניית מיקרו-מכוניות מציעה גמישות רבה יותר והתאמה ביולוגית. זרבובית עצמאית מאפשרת שימוש במגוון רחב של חרירים קלים, כולל מיקרופיפטים מזכוכית, במערכות הדפסה אלה. העיבוד בעל השליטה הגבוהה מאפשר להתאים באופן חופשי פרמטרים הכוללים את נפח המאגר, הקוטר הפנימי ואת צורת ראש ההדפסה. יתר על כן, הזרבובית החד פעמית מאפשרת עיקור למעבר בין חומרים מרובים, אשר מונע זיהום פוטנציאלי משימוש חוזר ונשנה. לבסוף, עקירות קטנות ומהירות, במקום כוחות חמורים ותנאים תרמיים, פועלות ישירות על הזרבובית במהלך תהליך ההדפסה, תוך שמירה על התכונות הפיזיקליות והכימיות המקוריות של הביוינק המודפס במידה המרבית; תכונה זו אטרקטיבית מאוד עבור יישומים ביו-חומריים.

השלבים הקריטיים ביותר לייצור מוצלח של מיקרו-מכוניות בגודל הנכון הם: 1) הכנת חרירים עם טיפים של קטרים מתאימים, ו -2) התאמת קצב הדגימה המתאים ו- Vpp בהתאם לצמיגות של הביוינק המודפס. היציבות של בניית מיקרוקרייר מושגת עוד יותר על ידי הסרת טיפות לווין ויישום כוחות מניעים חיצוניים. הפרמטרים המוגברים להקל על היווצרות של microcarriers, אבל כוחות נהיגה מופרזים הם הסיבה העיקרית להיווצרות מיקרוקרייר לווין, וכתוצאה מכך גודל microcarrier inhomogeneous. לכן, כדי לשפר את האחידות של גודל microcarrier, מומלץ להשתמש כראוי (לא מוגזם) שיעורי דגימה Vpp. היבט נוסף לשיפור יציבות המיקרו-קרויר הוא יישום כוחות מניעים חיצוניים. כוחות המניעה החיצוניים משלימים את הלחץ הסטטי וכוחות הנהיגה כלפי מטה, ועובדים יחד כדי להתגבר על מתח פני השטח בקצה. ניסויים בדחיפה של משאבת מזרק נערכו כדי להאכיל את הזרבובית וכוחות דחיפה נוספים משלימים. באופן ספציפי, הזרבובית חוברה למזרק, שמהירות הדחיפה שלו הותאמה על ידי משאבת מזרק מדויקת. שיטה זו אפשרה לאותו ריכוז של פתרון הידרוג'ל ליצור microdroplets בפרמטרים מוגבלים, אשר מועיל עבור הפחתת גודל של microcarriers. מחקרים אחרים דיווחו על שימוש בשדות אלקטרוסטטיים או סחיטת מאגרים כדי לקדם הדפסת מיקרופלופט 27,28.

למרות שהחלת כוחות מניעים חיצוניים צפויה להרחיב את מגוון הסוגים והריכוזים של צבעי דיו הניתנים להדפסה, טכניקת ההדפסה המשמשת כאן עדיין מתמודדת עם האתגר של כוחות מניעים מוגבלים ועדיין אינה יעילה עבור דיו בעל צמיגות גבוהה.

ההיתכנות של הכנת מיקרוקרייר והידבקות תאים באמצעות מדפסת AVIFJ 3D אומתה מראש. העבודה הבאה תתמקד ביישומים הפוטנציאליים של המיקרו-מכוניות בבניית מודלים ביולוגיים. במחקר עתידי, תהליך הידבקות התא ימוטב כך שמספר וסוגי התאים יגדלו ויועשרו עוד יותר, מה שצפוי ליצור רקמה תפקודית או רשת כלי דם. חוץ מזה, הביוינק יודפס עוד יותר במשותף עם תאים כדי ליצור יחידות מבניות הטרוגניות פונקציונליות. מיקרו-קפסולות, מיקרו-חלקיקים ומבנים אחרים יכולים להיטען גם בתוך המיקרו-מכוניות כדי ליצור מודל מתמשך לשחרור תרופות לשימוש קליני. לסיכום, פותחה שיטה לבניית יחידות מיקרו-יחידות רקמות, אשר צפויות להיות מדורגות עד כדי ליצור מיקרו-רקמות תפקודיות במבחנה .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (3212007), תוכנית המחקר המדעית של יוזמת אוניברסיטת צינגחואה (20197050024), קרן רוח האביב של אוניברסיטת צינגחואה (20201080760), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (51805294), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2018YFA0703004), ופרויקט 111 (B17026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CCL-185 Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope Olympus DP70
Confocal microscope Nikon TI-FL
Fetal bovine serum, FBS BI 04-001-1ACS
Gelatin SIGMA G1890
Glass micropipettes sutter instrument b150-110-10
GlutaMAX GIBCO 35050-061
H-DMEM GIBCO 11960-044 Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder SIGMA P6782
Hydrophobic agent 3M PN7026 Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device narishige MF-900
Non-essential amino acids, NEAA GIBCO 11140-050 non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin GIBCO 15140-122
Petri dish SIGMA P5731-500EA
Puller sutter instrument P-1000
Sodium alginate SIGMA A0682
Trypsin GIBCO 25200-056
Type I collagen solution from rat tail SIGMA C3867

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
  2. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
  3. Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
  4. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  5. Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
  6. Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
  7. Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
  8. Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
  9. Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
  10. Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
  11. Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
  12. Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
  13. Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
  14. Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
  15. Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
  16. Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
  17. Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
  18. Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
  19. Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
  20. Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
  21. Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
  22. Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
  23. Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
  24. Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
  25. Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
  26. Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
  27. Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
  28. Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 170 הדפסה בתלת-ממד מלמטה למעלה הידרוג'ל מיקרוקרייר מיקרו-סיסו
הדפסה תלת-ממדית של מיקרוקארים הידרוג'ל <em>במבחנה</em> על ידי סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, T., Shao, Y., Wang, Z., Chen,… More

Liu, T., Shao, Y., Wang, Z., Chen, Y., Pang, Y., Weng, D., Sun, W. 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting. J. Vis. Exp. (170), e62252, doi:10.3791/62252 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter