Summary
Apresentada aqui é uma técnica de impressão 3D leve impulsionada por forças viscosas-inerciais alternadas para permitir a construção de microcarriers de hidrogel. Bicos caseiros oferecem flexibilidade, permitindo fácil substituição para diferentes materiais e diâmetros. Microcarriers de ligação celular com diâmetro de 50-500 μm podem ser obtidos e coletados para posterior cultivo.
Abstract
Microcarriers são contas com um diâmetro de 60-250 μm e uma grande área de superfície específica, que são comumente usadas como portadores para culturas celulares de grande escala. A tecnologia da cultura microcarrier tornou-se uma das principais técnicas em pesquisa citológica e é comumente usada no campo da expansão celular em larga escala. Microcarriers também têm mostrado desempenhar um papel cada vez mais importante na construção de engenharia de tecidos in vitro e na triagem clínica de medicamentos. Os métodos atuais para preparar microcarriers incluem chips microfluidos e impressão de jato de tinta, que muitas vezes dependem de design complexo de canais de fluxo, uma interface de duas fases incompatível e uma forma de bocal fixo. Esses métodos enfrentam os desafios do processamento complexo do bico, mudanças inconvenientes no bocal e forças excessivas de extrusão quando aplicados a vários bioink. Neste estudo, foi aplicada uma técnica de impressão 3D, chamada de jato de força viscosa-inercial alternada, para permitir a construção de microcarriers de hidrogel com diâmetro de 100-300 μm. As células foram posteriormente semeadas em microcarriers para formar módulos de engenharia de tecidos. Em comparação com os métodos existentes, este método oferece um diâmetro de ponta de bocal gratuito, comutação flexível do bocal, livre controle dos parâmetros de impressão e condições de impressão suaves para uma ampla gama de materiais bioativos.
Introduction
Microcarriers são contas com um diâmetro de 60-250 μm e uma grande área de superfície específica e são comumente usadas para cultura em larga escala de células1,2. Sua superfície externa fornece locais de crescimento abundantes para as células, e o interior fornece uma estrutura de suporte para a proliferação espacial. A estrutura esférica também proporciona comodidade no monitoramento e controle de parâmetros, incluindo pH, O2 e concentração de nutrientes e metabólitos. Quando usados em combinação com bioreatores de tanques agitados, os microcarriers podem alcançar densidades celulares mais altas em um volume relativamente pequeno em comparação com as culturas convencionais, fornecendo assim uma maneira econômica de alcançar culturas em larga escala3. A tecnologia da cultura microcarrier tornou-se uma das principais técnicas da pesquisa citológica, e muito progresso tem sido feito no campo da expansão em larga escala de células-tronco, hepatócitos, condrócitos, fibroblastos e outras estruturas4. Também foram encontrados veículos ideais de entrega de drogas e unidades de baixo para cima, assumindo, portanto, um papel cada vez mais importante na triagem clínica de medicamentos e reparação de tecido in vitro5.
Para atender aos requisitos de propriedade mecânica em diferentes cenários, vários tipos de materiais hidrogel foram desenvolvidos para uso na construção de microcarriers6,7,8,9,10,11. Os hidrogéis de ácido alginato e hialurônico (HA) são dois dos materiais microcarrier mais utilizados devido à sua boa biocompatibilidade e crosslinkability12,13. O alginato pode ser facilmente cruzado por cloreto de cálcio, e suas propriedades mecânicas podem ser moduladas alterando o tempo de ligação cruzada. A HA conjugada com tyramina é cruzada pelo acoplamento oxidativo de moieties de tiranaina catalisadas por peróxido de hidrogênio e peroxidase de rabanete14. O colágeno, devido à sua estrutura espiral única e rede de fibras cruzadas, é frequentemente usado como um adjuvante para se misturar nos microcarriers para promover ainda mais o apego celular15,16.
Os métodos atuais de preparação de microcarriers incluem chips microfluidos, impressão a jato de tinta e eletrospray17,18,19,20,21,22,23. Os chips microfluidos têm sido comprovadamente rápidos e eficientes na produção de microcarriers de tamanho uniforme24. No entanto, essa tecnologia conta com um complexo processo de design e fabricação de canais de fluxo25. Forças de alta temperatura ou extrusão excessiva durante a impressão de jato de tinta, bem como campos elétricos intensos na abordagem eletrospray, podem afetar negativamente as propriedades do material, especialmente sua atividade biológica19. Além disso, quando aplicados a diversos biomateriais e diâmetros, os bicos personalizados utilizados nesses métodos resultam em complexidade de processamento limitada, alto custo e baixa flexibilidade.
Para fornecer um método conveniente para a preparação de microcarrier, uma técnica de impressão 3D chamada alternando forças viscosas-inerciais (AVIFJ) foi aplicada para construir microcarriers de hidrogel. A técnica utiliza forças motrizes descendentes e pressão estática gerada durante a vibração vertical para superar a tensão superficial da ponta do bocal e, assim, formar gotículas. Em vez de forças severas e condições térmicas, pequenos deslocamentos rápidos atuam diretamente no bocal durante a impressão, causando um pequeno efeito sobre as propriedades físico-químicas do bioink e apresentando grande atração por materiais bioativos. Utilizando o método AVIFJ, microcarriers de múltiplos biomateriais com diâmetros de 100-300 μm foram formados com sucesso. Além disso, as microcarriers foram comprovadamente mais adequadas para ligar bem as células e proporcionar um ambiente de crescimento adequado para as células aderidas.
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Protocol
1. Cultura celular
- Suplemente o meio essencial mínimo modificado de alta glicose Dulbecco (H-DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% solução de aminoácido não essencial (NEAA), 1% penicilina G e estreptomicina, e 1% suplemento de glutamina como mídia cultural para células A549.
- Cultura A549 células em uma incubadora de CO2 a 37 °C e com 5% de CO2
- Células dissociadas para subcultura usando trippsina a aproximadamente 80% de confluência.
- Use 3 mL de trippsina para tratar as células no frasco de cultura T75 a 37 °C por 3 min, e depois adicione 6 mL de meio de cultura para parar a trippsinização.
- Pipeta o meio de cultura para colher células vagamente aderidas.
- Centrifugar a 72,5 x g por 3 min. Remova o supernatante e resuspend com 3 mL de meio fresco.
- Transfira 1 mL de suspensão celular para um novo frasco de cultura T75 contendo 10 mL de meio fresco. Mude o meio de cultura a cada 2 dias.
2. Preparação de bicos
- Carregue micropipettos de vidro no puxador seguindo as instruções do fabricante. O diâmetro externo, o diâmetro interno e o comprimento do tubo microa jato são de 1,5 mm, 1,1 mm e 100 mm, respectivamente.
- Defina os parâmetros de puxar para o puxador. Especificamente, os valores de CALOR, PULL, VELOCITY, TIME e PRESSURE são definidos como 560, 255, 255, 150 e 500 por padrão, respectivamente. Retire o bocal sob esses parâmetros.
ATENÇÃO: O bocal obtido após a retirada é muito afiado, e a operação descuidada pode causar ferimentos. - Corte o bocal resultante (etapa 2.2) no diâmetro designado por um dispositivo microdesquente seguindo as instruções do fabricante para obter um diâmetro de ponta específico. Especificamente, localize o diâmetro especificado do bocal no fio de platina aquecido. Aqueça o fio até 60 °C por cerca de 5 s e puxe o bocal para fora.
- Mergulhe a cabecestida do bocal em um agente hidrofóbico por 30 minutos, seguido por três ciclos de lavagem com água esterilizada.
- Antes de imprimir, esterilize o bocal em álcool por 5 minutos e enxágue-o com água esterilizada três vezes para remover o álcool residual.
3. Preparação de bioink de hidrogel
- Dissolver NaCl (0,45 g) em 50 mL de água estéril para obter uma solução NaCl de 0,9% (w/v). Vibre a solução para promover a dissolução. Depois de completamente dissolvido, filtre a solução através de uma membrana de filtro de tereftalato de polietileno de 0,45 μm.
- Pese pó de alginato de sódio de baixa viscosidade (1 g) e dissolva-o em 25 mL de solução NaCl (passo 3.1) a uma alta temperatura de 60-80 °C durante a noite para obter uma solução de estoque de alginato de sódio de 4% (w/v). A solução de estoque pode ser armazenada a 4 °C por 1 mês.
- Esterilize a solução de caldo de alginato de sódio (passo 3.2) aquecendo-a três vezes em um forno (70 °C) por 30 min.
- Diluir o volume adequado da solução de estoque de alginato de sódio (etapa 3,3) em solução NaCl de 0,9% (etapa 3.1) em concentrações de 2%, 1,5% e 0,5% (w/v).
NOTA: Além do aquecimento no forno, outros processos de preparação da solução de alginato de sódio devem ser realizados no capô. - Dissolva 1 g de gelatina em pó em 25 mL de solução NaCl (passo 3.1) a uma alta temperatura de 60-80 °C durante a noite para obter uma solução de caldo de gelatina de 4% (w/v). A solução de estoque pode ser armazenada a 4 °C por 1 mês.
- Esterilize a solução de caldo de gelatina (passo 3.5) aquecendo-a três vezes em um forno (70 °C) por 30 min.
- Diluir o volume adequado da solução de caldo gelatina (etapa 3.6) em solução NaCl de 0,9% (etapa 3.1) a uma concentração de 1,5% (w/v).
NOTA: Além do aquecimento no forno, outros processos de preparação da solução de gelatina devem ser realizados no capô. - Para promover a ligação celular nos microcarriers, prepare a solução de alginato-colágeno misturando a solução de alginato de sódio de 2% (w/v) e a solução de colágeno Tipo I da cauda de rato (4 mg/mL) a uma razão de 3:1. Ajuste a solução para pH 7.2 com solução NaOH de 0,1 M e use imediatamente após a preparação.
- Dissolva a solução de flocculente HA flocculente modificada por tirasina em solução salina tampão de fosfato (PBS) a 60-80 °C durante a noite para obter uma solução PBS de ácido hialurônico modificada por tiranosina de 0,8% w/w. A solução de estoque pode ser armazenada a 4 °C por 1 mês.
- Esterilize a solução HA PBS modificada por tirasina, aquecendo-a três vezes em um forno (70 °C) por 30 min.
- Dissolver pó de peroxidase de rabanete (unidade de atividade de enzimas/mg) em solução PBS para obter 8 unidade de atividade enzimática/mg solução de peroxidase de rabanete peroxidase pbs.
- Solução de peróxido de hidrogênio diluído (30%, w/w) por água DI a 4 mM.
- Prepare a solução modificada de peroxidase ha-rabanete misturando solução PBS de ácido hialurônico modificado por tiranosina e solução pbs de peroxidase de rabanete a uma proporção de 1:1.
NOTA: Além do aquecimento no forno, outros processos de preparação da solução de peroxidase de rabanete HA devem ser realizados no capô.
4. Formação de microdroplets com base no AVIFJ
- Use um sistema de impressão celular criado em casa como relatado anteriormente (Figura 1A)26. A saída de sinal elétrico pelo gerador de forma de onda é primeiro amplificada e, em seguida, impulsiona a cerâmica piezoelétrica para gerar deformação controlável. O bocal fixado na cerâmica piezoelétrica produz vibrações controláveis.
- Esterilize o sistema de impressão limpando com 75% (v/v) álcool e exposição ultravioleta (UV) durante a noite.
- Carregue 5 mL de bioink (passo 3.1) em uma seringa estéril descartável. Instale a seringa na bomba de seringa.
- Conecte a seringa (passo 4.3) e o bocal (passo 2.5) com uma mangueira de silicone de 1 mm de diâmetro interno.
- Fixar o bocal (passo 4.4) a ser usado para imprimir, ajustando o aperto do parafuso de fixação. Mantenha a ponta do bocal longe do substrato durante a instalação para evitar danos e contaminação.
ATENÇÃO: Se o bocal estiver quebrado durante a instalação, use luvas mais grossas e limpe cuidadosamente fragmentos e resíduos de vidro. - Empurre rapidamente a bomba de seringa e carregue o bioink (passo 4.3) para o bocal (passo 4.5). Defina a vazão em 30 μL/min. Limpe o excesso de material na ponta.
- Defina os parâmetros do gerador de sinal. Importação de forma de onda auto-projetada contendo 500.000 pontos de amostragem. Defina a taxa de amostragem e a tensão de pico para pico (Vpp) como 5 milhões de amostras/s e 10 V, respectivamente.
- Limpe slides ou pratos de Petri com água deionizada. Coloque-os sob o bocal como substrato de impressão.
- Predefinir o caminho de movimento e ativar o modo de vibração como drop-on-demand.
- Imprima as gotículas seguindo os padrões pré-projetados.
5. Formação de microcarriers com base na AVIFJ
- Repetir passos 4.1-4.4, exceto alterar a solução de alginato bioink para 2% (w/v) solução de alginate-colágeno (passo 3.8) ou solução modificada de peroxidase ha-rabanete (passo 3.13).
- Dissolva 3 g de cloreto de cálcio em 100 mL de água estéril para obter 3% (w/v) solução de cloreto de cálcio. Depois de completamente dissolvido, filtre a solução através de uma membrana de filtro de tereftalato de polietileno de 0,45 μm.
- Adicione 5 mL de solução de ligação cruzada (solução de cloreto de cálcio ou solução de peróxido de hidrogênio) em uma placa de Petri. Coloque a placa de Petri sob o bico para trabalhar como um substrato.
- Após a impressão, cruze as microcarriers por 3 minutos.
- Colete a suspensão de microcarrier em um tubo de centrífuga e enriqueça microcarriers por centrifugação a 29 x g por 3 min. Resuspenja os microcarriers em mídia cultural em aproximadamente 600 microcarriers/mL.
6. Células inoculantes na superfície dos microcarriers
- Colorisse as células A549 com CMFDA Verde Rastreador de Células para facilitar a observação das células. Especificamente, remova a mídia de cultura, adicione 5 mL de meio livre de soro contendo corante rastreador de células de 10 μM e incuba células por 30 minutos em uma incubadora. Em seguida, substitua a solução de corante por meio fresco.
- Resuspende a suspensão celular A549 na densidade de 1,6 x 106 células/mL.
- Adicione 1 mL de suspensão de microcarrier de colágeno alginato (etapa 5.3) e 1 mL de suspensão celular A549 (etapa 6.1) em uma placa de cultura de 6 poços de baixa adesão.
- Coloque a placa sobre um agitador a 30 rpm em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
- Tire a placa do agitador e espere 30 minutos para deixar as microcarriers se acalmarem. Metade muda o meio de cultura a cada 2 dias.
7. Análise da formação de microdroplets/microcarriers
- Observe e meça o bocal (passo 2.2), as placas de Petri (passo 4.10 e passo 5.4), e células com microcarriers (passo 6.5) sob um microscópio de campo brilhante ou microscópio confocal. Especificamente, a ampliação objetiva é 4x, 10x ou 20x e a ampliação da ocular é de 10x.
- Meça o diâmetro dos microcarriers pelo software ImageJ. De acordo com a barra de escala que vem com o microscópio ao fotografar na imagem, defina o tamanho real da escala em ImageJ, e desenhe 10 linhas do raio ou do eixo semi-maior das microcarriers. ImageJ pode obter o tamanho médio e o desvio padrão desses segmentos de linha.
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Representative Results
Foram fabricados cabeçoteiros de variadas taxas de convergência e diâmetros para a impressão de múltiplos tipos de materiais. Os bicos obtidos com o aumento da força de puxar são mostrados na Figura 1B. Os bicos foram divididos em três áreas: reservatório (III), contração (II) e cabeçote de impressão (I). O reservatório era a parte não processada do bocal, na qual o líquido forneceu pressão estática e entrada de bioink para impressão. A área de contração foi a principal parte para a geração de forças motrizes para baixo. A força de puxar teve um efeito significativo no cabeçote de impressão, demonstrando uma taxa de convergência mais baixa com força de puxar estendida. O cabeçote de impressão mais estreito e mais longo aumentou a tensão superficial durante a impressão, dificultando a formação de microdroplets discretos, mas facilitou o corte de pontas de diâmetro menor em operações subsequentes. Posteriormente, com o instrumento de forjação da agulha, o cabeçoso foi cortado no diâmetro designado (Figura 1C). Foram disponibilizadas dicas com diversos diâmetros, incluindo 100, 120, 150 e 200 μm, para geração de microcarriers de diferentes tamanhos, atendendo aos requisitos de diversos microtissues in vitro .
A estabilidade e a controlabilidade do processo de impressão foram verificadas pela primeira vez pela impressão de gotículas nas placas de Petri. Com um bico de ponta de 30 μm, bioink múltiplo, incluindo PBS, 1,5% de alginato e 1,5% de gelatina foram impressos (Figura 2A,B). A dificuldade de imprimir um determinado bioink se refletiu na taxa de amostragem e no Vpp utilizado para impressão. O bioink de baixa viscosidade, como a solução NaCl, foi impresso em parâmetros menores, resultando em diâmetros menores de gotículas. Com a crescente viscosidade, o processo de impressão tornou-se correspondentemente mais difícil, pois as maiores forças de acionamento eram necessárias e gotículas maiores obteriam (Figura 2B). Com este mecanismo, o ajuste de parâmetros e forças de acionamento para um determinado bioink pode ser usado para ajustar diferentes tamanhos de gotículas, como mostrado na Figura 2C. A Figura 2D mostra o arranjo de gotículas formando as letras específicas "THU" em uma superfície plana. Além disso, a combinação de observações microscópicas permitiu a localização de microdroplets em escalas menores dentro de 100 μm.
Microcarriers alginato (Figura 3A) e microcarriers HA (Figura 3C) foram impressos com pontas de diferentes diâmetros. Os efeitos do diâmetro da ponta no diâmetro da microcarrier alginato são mostrados na Figura 3B. Limitado pelo bloqueio causado pela volatilização da solução quando o tamanho é muito pequeno, o menor diâmetro das microcarriers de alginato impresso foi de aproximadamente 100 μm. Enquanto o diâmetro maior pode chegar a até 300 μm. O diâmetro das microcarriers impressas aumenta de acordo com o diâmetro da ponta e é sempre maior que o último. Quando o diâmetro da ponta é maior que 250 μm, o bioink não pode ser impresso. O diâmetro das microcarriers HA modificadas impressas foi de 76,7 ± 1,8 μm com diâmetros de ponta de 75 μm (Figura 3C).
As células A549 e microcarriers de alginato-colágeno foram semeadas em uma placa e colocadas em um shaker na incubadora. As células foram observadas para aderir às microcarriers de alginato-colágeno após a mistura por 2 dias. As células cobrem progressivamente uma superfície maior de microcarriers por proliferação. Após o cultivo por 6 dias, as células A549 cobriram quase totalmente as superfícies das microcarrier. Este resultado confirma que as microcarriers desenvolvidas podem ligar bem as células e fornecer um ambiente de crescimento adequado para as células. Imagens de campo brilhantes e imagens confocalas de células A549 aderindo e proliferando na superfície dos microcarriers são mostradas na Figura 4.
Figura 1: O sistema de impressão AVIFJ e a preparação de bicos de vários diâmetros. (A) A instalação do bocal AVIFJ. (B) Sob parâmetros pull específicos, o cabeçoteiro do bocal foi moldado para convergir a diferentes taxas. Barra de escala: 200 μm. (C) Com o instrumento de forjamento da agulha, a ponta foi cortada em posições designadas. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Impressão de múltiplos tipos de biomateriais em várias concentrações por AVIFJ. (A) O bocal utilizado nesta seção de resultados. O diâmetro da ponta foi de 30 μm. Barra de escala: 100 μm. (B) Impressão de múltiplos tipos de materiais hidrogel, incluindo PBS, 1,5% de alginato e gelatina de 1,5% em vários parâmetros. M: um milhão de amostras por segundo, refletindo a duração de uma única vibração. V: tensão de pico a pico, refletindo o curso de uma única vibração. Barra de escala: 100 μm. (C) A impressão de 0,5% alginato em vários parâmetros. Barra de escala: 100 μm. (D) arranjos 2D e posicionamento próximo de gotículas. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microcarriers impressos com diferentes diâmetros da ponta do bocal. (A) microcarriers alginato de 2%, impressos com diâmetros de ponta de bocal a 70, 100, 130, 160, 210 e 250 μm, respectivamente. Barra de escala: 100 μm. (B) Efeito do diâmetro da ponta do bocal no tamanho das microcarriers. Os tamanhos dos microcarriers impressos com bicos de diferentes diâmetros foram estatisticamente analisados por meio do software ImageJ. Foram selecionados e calculados dez microcarriers para cada bocal. Os dados são apresentados como média ± s.d. (C) Microcarriers HA modificados impressos com diâmetros de ponta a 75 μm. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Células de semeadura em microcarriers de colágeno-colágeno. (A) Imagens de campo brilhantes de células A549 aderindo e proliferando na superfície das microcarriers. Barra de escala: 100 μm. (B) Imagens confocal de células A549 aderindo e proliferando na superfície dos microcarriers. Barra de escala: 100 μm. Elipses pontilhadas são usadas para destacar a borda dos microcarriers. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui fornece instruções para a preparação de multi-tipos de microcarriers de hidrogel e subsequentes semeadura de células. Em comparação com os métodos microfluídicos de impressão de chips e jatos de tinta, a abordagem AVIFJ para a construção de microcarriers oferece maior flexibilidade e biocompatibilidade. Um bocal independente permite que uma ampla gama de bicos leves, incluindo micropipettos de vidro, sejam usados nestes sistemas de impressão. O processamento altamente controlável permite que parâmetros, incluindo o volume do reservatório, o diâmetro interno e a forma da cabeçuda de impressão sejam livremente ajustados. Além disso, o bocal descartável facilita a esterilização para comutação entre vários materiais, o que evita contaminação potencial do uso repetido. Finalmente, pequenos e rápidos deslocamentos, em vez de forças severas e condições térmicas, atuam diretamente no bocal durante o processo de impressão, mantendo as propriedades físicas e químicas originais do bioink impresso na medida máxima; este recurso é altamente atraente para aplicações de biomateriais.
Os passos mais críticos para a produção bem-sucedida de microcarriers do tamanho correto são: 1) Preparar bicos com pontas de diâmetros apropriados, e 2) adaptando a taxa de amostragem adequada e Vpp de acordo com a viscosidade do bioink impresso. A estabilidade da construção de microcarriersa é alcançada ainda pela remoção de gotículas de satélite e a aplicação de forças motrizes externas. Os parâmetros aumentados facilitam a formação de microcarriers, mas as forças motrizes excessivas são a principal razão para a formação de microcarrier por satélite, resultando em um tamanho de microcarrier inhomogêneo. Assim, para melhorar a uniformidade do tamanho do microcarrier, recomenda-se o uso de taxas de amostragem adequadas (não excessivas) e Vpp. Outro aspecto para melhorar a estabilidade dos microcarridores é a aplicação de forças motrizes externas. As forças motrizes externas complementam a pressão estática e as forças motrizes para baixo, trabalhando juntas para superar a tensão superficial na ponta. Uma bomba de seringa empurrando foi experimentada para alimentar o bocal e forças adicionais de pressão suplementar. Especificamente, o bocal estava conectado a uma seringa, cuja velocidade de empurrar foi ajustada por uma bomba de seringa de precisão. Este método permitiu a mesma concentração de solução de hidrogel para formar microdroplets em parâmetros limitados, o que é benéfico para a redução do tamanho das microcarriers. Outros estudos relataram o uso de campos eletrostáticos ou reservatórios de espremedores para promover a impressão de micro-gotas27,28.
Embora se espera que a aplicação de forças motrizes externas amplie o leque de tipos e concentrações de tintas imprimíveis, a técnica de impressão usada aqui ainda enfrenta o desafio de forças motrizes limitadas e ainda é ineficaz para tintas de alta viscosidade.
A viabilidade da preparação de microcarrier e da adesão celular utilizando uma impressora 3D AVIFJ foi verificada preliminarmente. O trabalho subsequente se concentrará nas possíveis aplicações das microcarriers na construção de modelos biológicos. Em pesquisas futuras, o processo de adesão celular será otimizado para que o número e os tipos de células sejam ainda maiores e enriquecidos, o que deverá formar um tecido funcional ou rede vascular. Além disso, o bioink será ainda co-impresso com células para formar unidades estruturais heterogêneas funcionais. Microcápsulas, micropartículas e outras estruturas também podem ser carregadas dentro dos microcarriers para formar um modelo sustentado de liberação de medicamentos para uso clínico. Em resumo, foi desenvolvido um método para a construção de micro-unidades teciduais, que devem ser dimensionadas para formar microssus móveis funcionais in vitro .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural de Pequim (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) e o Projeto 111 (B17026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
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