Summary

3D-utskrift av In Vitro Hydrogel Microcarriers ved vekslende Viscous-Inertial Force Jetting

Published: April 21, 2021
doi:

Summary

Presentert her er en mild 3D-utskriftsteknikk drevet av vekslende viskøse inertialkrefter for å muliggjøre bygging av hydrogelmikrokarrierer. Hjemmelagde dyser gir fleksibilitet, noe som gir enkel utskifting for forskjellige materialer og diametre. Cellebindende mikrokarrierer med en diameter på 50-500 μm kan oppnås og samles for videre dyrking.

Abstract

Mikrokarrierer er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort spesifikt overflateareal, som ofte brukes som bærere for store cellekulturer. Mikrokarrierekulturteknologi har blitt en av de viktigste teknikkene innen cytologisk forskning og brukes ofte innen storskala celleutvidelse. Mikrokarrierer har også vist seg å spille en stadig viktigere rolle i in vitro vev engineering konstruksjon og klinisk narkotika screening. Nåværende metoder for å forberede mikrokarrierer inkluderer mikrofluidiske sjetonger og blekkskriverutskrift, som ofte er avhengige av kompleks strømningskanaldesign, et inkompatibelt tofaset grensesnitt og en fast dyseform. Disse metodene står overfor utfordringene ved kompleks dysebehandling, ubeleilige dyseendringer og overdreven ekstruderingskrefter når de brukes på flere bioink. I denne studien ble en 3D-utskriftsteknikk, kalt vekslende viskøs-inertial kraftstråle, brukt for å muliggjøre bygging av hydrogelmikrokarrierer med en diameter på 100-300 μm. Celler ble senere sådd på mikrokarrierer for å danne vevsteknikkmoduler. Sammenlignet med eksisterende metoder, tilbyr denne metoden en gratis dysespissdiameter, fleksibel dyseveksling, fri kontroll av utskriftsparametere og milde utskriftsforhold for et bredt spekter av bioaktive materialer.

Introduction

Mikrokarrierer er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort spesifikt overflateareal og brukes ofte til storskala kultur av celler1,2. Deres ytre overflate gir rikelig vekststeder for celler, og interiøret gir en støttestruktur for romlig spredning. Den sfæriske strukturen gir også bekvemmelighet i overvåking og kontroll av parametere, inkludert pH, O2 og konsentrasjon av næringsstoffer og metabolitter. Når mikrokarrierer brukes i kombinasjon med omrørte tankbioreaktorer, kan de oppnå høyere celletetthet i et relativt lite volum sammenlignet med konvensjonelle kulturer, og dermed gi en kostnadseffektiv måte å oppnå store kulturer3 på. Mikrocarrier kulturteknologi har blitt en av de viktigste teknikkene innen cytologisk forskning, og mye fremgang har blitt gjort innen storskala utvidelse av stamceller, hepatocytter, kondrocytter, fibroblaster og andre strukturer4. De har også vist seg å være ideelle legemiddelleveringskjøretøy og nedenfra-og-opp-enheter, og tar derfor en stadig viktigere rolle i klinisk legemiddelscreening og in vitro vevsteknikk reparasjon5.

For å møte mekaniske eiendomskrav i ulike scenarier er flere typer hydrogelmaterialer utviklet for bruk i bygging av mikrokarrierer6,7,8,9,10,11. Alginat- og hyaluronsyre (HA) hydrogeler er to av de mest brukte mikrokarrierematerialene på grunn av deres gode biokompatibilitet og krysskoblingsevne12,13. Alginat kan enkelt krysskobles av kalsiumklorid, og dets mekaniske egenskaper kan moduleres ved å endre krysskoblingstiden. Tyramin-konjugert HA er kryssbundet av oksidativ kobling av tyraminmoieties katalysert av hydrogenperoksid og pepperrotperoksidase14. Kollagen, på grunn av sin unike spiralstruktur og krysskoblede fibernettverk, brukes ofte som en adjuvans for å blande seg inn i mikrokarrierene for å fremme cellevedlegg15,16 ytterligere.

Dagens metoder for å forberede mikrokarrierer inkluderer mikrofluidiske sjetonger, blekkskriverutskrift og elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiske chips har vist seg å være raske og effektive i å produsere ensartede mikrokarrierer24. Denne teknologien er imidlertid avhengig av en kompleks strømningskanaldesign og fabrikasjonsprosess25. Høy temperatur eller overdreven ekstruderingskrefter under blekkskrivere, samt intense elektriske felt i elektrospray-tilnærmingen, kan påvirke materialets egenskaper negativt, spesielt dets biologiske aktivitet19. Dessuten, når de brukes på ulike biomaterialer og diametre, resulterer de tilpassede dysene som brukes i disse metodene i begrenset prosesseringskompleksitet, høy pris og lav fleksibilitet.

For å gi en praktisk metode for mikrokarriereforberedelse, har en 3D-utskriftsteknikk kalt vekslende viskøse trege krefter jetting (AVIFJ) blitt brukt til å konstruere hydrogelmikrokarrierer. Teknikken benytter nedadgående drivkrefter og statisk trykk generert under vertikal vibrasjon for å overvinne overflatespenningen til dysespissen og dermed danne dråper. I stedet for alvorlige krefter og termiske forhold virker små raske forskyvninger direkte på dysen under utskrift, noe som forårsaker en mindre effekt på bioinkens fysisk-kjemiske egenskaper og presenterer stor tiltrekning for bioaktive materialer. Ved hjelp av AVIFJ-metoden ble mikrokarrierer av flere biomaterialer med diametre på 100-300 μm vellykket dannet. Dessuten ble mikrokarrierene ytterligere bevist å binde celler godt og gi et passende vekstmiljø for fulgte celler.

Protocol

1. Cellekultur Supplere høyglukose Dulbecco modifisert Minimum Essential Medium (H-DMEM) med 10% foster bovint serum (FBS), 1% unødvendig aminosyre løsning (NEAA), 1% penicillin G og streptomycin, og 1% Glutamine supplement som kulturmedier for A549 celler. Kultur A549 celler i en CO2 inkubator ved 37 °C og med 5 % CO2 Dissosiere celler for subkultur ved hjelp av trypsin ved ca. 80% samløp. Bruk 3 ml trypsin til å behandle cellene i T75-kulturflasken ved …

Representative Results

Skrivehoder med varierte konvergenshastigheter og diametre ble fremstilt for å oppnå utskrift av flere typer materialer. Dysene oppnådd med økende trekkstyrke er vist i figur 1B. Dysene ble delt inn i tre områder: reservoar (III), sammentrekning (II) og skrivehode (I). Reservoaret var den ubehandlede delen av dysen, der væsken ga statisk trykk og bioinkinngang for utskrift. Sammentrekningsområdet var hoveddelen for å generere nedadgående drivkrefter. Trekkstyrken hadde en betydelig …

Discussion

Protokollen som er beskrevet her, gir instruksjoner for fremstilling av flere typer hydrogelmikrokarrierer og etterfølgende cellesåing. Sammenlignet med mikrofluidisk brikke- og blekkskrivermetoder, gir AVIFJ-tilnærming til konstruksjon av mikrokarrierer større fleksibilitet og biokompatibilitet. En uavhengig dyse gjør det mulig å bruke et bredt spekter av lette dyser, inkludert mikropipetter i glass, i disse utskriftssystemene. Den svært kontrollerbare behandlingen gjør det mulig å justere parametere, inkludert…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) og 111 Project (B17026).

Materials

A549 cells ATCC CCL-185 Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope Olympus DP70
Confocal microscope Nikon TI-FL
Fetal bovine serum, FBS BI 04-001-1ACS
Gelatin SIGMA G1890
Glass micropipettes sutter instrument b150-110-10
GlutaMAX GIBCO 35050-061
H-DMEM GIBCO 11960-044 Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder SIGMA P6782
Hydrophobic agent 3M PN7026 Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device narishige MF-900
Non-essential amino acids, NEAA GIBCO 11140-050 non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin GIBCO 15140-122
Petri dish SIGMA P5731-500EA
Puller sutter instrument P-1000
Sodium alginate SIGMA A0682
Trypsin GIBCO 25200-056
Type I collagen solution from rat tail SIGMA C3867

References

  1. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
  2. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
  3. Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
  4. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  5. Naqvi, S. M., et al. Living cell factories – electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
  6. Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
  7. Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
  8. Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
  9. Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
  10. Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
  11. Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
  12. Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
  13. Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
  14. Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
  15. Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
  16. Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
  17. Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
  18. Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
  19. Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
  20. Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
  21. Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
  22. Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
  23. Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
  24. Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
  25. Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
  26. Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
  27. Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
  28. Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).

Play Video

Cite This Article
Liu, T., Shao, Y., Wang, Z., Chen, Y., Pang, Y., Weng, D., Sun, W. 3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting. J. Vis. Exp. (170), e62252, doi:10.3791/62252 (2021).

View Video