Summary
Presentert her er en mild 3D-utskriftsteknikk drevet av vekslende viskøse inertialkrefter for å muliggjøre bygging av hydrogelmikrokarrierer. Hjemmelagde dyser gir fleksibilitet, noe som gir enkel utskifting for forskjellige materialer og diametre. Cellebindende mikrokarrierer med en diameter på 50-500 μm kan oppnås og samles for videre dyrking.
Abstract
Mikrokarrierer er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort spesifikt overflateareal, som ofte brukes som bærere for store cellekulturer. Mikrokarrierekulturteknologi har blitt en av de viktigste teknikkene innen cytologisk forskning og brukes ofte innen storskala celleutvidelse. Mikrokarrierer har også vist seg å spille en stadig viktigere rolle i in vitro vev engineering konstruksjon og klinisk narkotika screening. Nåværende metoder for å forberede mikrokarrierer inkluderer mikrofluidiske sjetonger og blekkskriverutskrift, som ofte er avhengige av kompleks strømningskanaldesign, et inkompatibelt tofaset grensesnitt og en fast dyseform. Disse metodene står overfor utfordringene ved kompleks dysebehandling, ubeleilige dyseendringer og overdreven ekstruderingskrefter når de brukes på flere bioink. I denne studien ble en 3D-utskriftsteknikk, kalt vekslende viskøs-inertial kraftstråle, brukt for å muliggjøre bygging av hydrogelmikrokarrierer med en diameter på 100-300 μm. Celler ble senere sådd på mikrokarrierer for å danne vevsteknikkmoduler. Sammenlignet med eksisterende metoder, tilbyr denne metoden en gratis dysespissdiameter, fleksibel dyseveksling, fri kontroll av utskriftsparametere og milde utskriftsforhold for et bredt spekter av bioaktive materialer.
Introduction
Mikrokarrierer er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort spesifikt overflateareal og brukes ofte til storskala kultur av celler1,2. Deres ytre overflate gir rikelig vekststeder for celler, og interiøret gir en støttestruktur for romlig spredning. Den sfæriske strukturen gir også bekvemmelighet i overvåking og kontroll av parametere, inkludert pH, O2 og konsentrasjon av næringsstoffer og metabolitter. Når mikrokarrierer brukes i kombinasjon med omrørte tankbioreaktorer, kan de oppnå høyere celletetthet i et relativt lite volum sammenlignet med konvensjonelle kulturer, og dermed gi en kostnadseffektiv måte å oppnå store kulturer3 på. Mikrocarrier kulturteknologi har blitt en av de viktigste teknikkene innen cytologisk forskning, og mye fremgang har blitt gjort innen storskala utvidelse av stamceller, hepatocytter, kondrocytter, fibroblaster og andre strukturer4. De har også vist seg å være ideelle legemiddelleveringskjøretøy og nedenfra-og-opp-enheter, og tar derfor en stadig viktigere rolle i klinisk legemiddelscreening og in vitro vevsteknikk reparasjon5.
For å møte mekaniske eiendomskrav i ulike scenarier er flere typer hydrogelmaterialer utviklet for bruk i bygging av mikrokarrierer6,7,8,9,10,11. Alginat- og hyaluronsyre (HA) hydrogeler er to av de mest brukte mikrokarrierematerialene på grunn av deres gode biokompatibilitet og krysskoblingsevne12,13. Alginat kan enkelt krysskobles av kalsiumklorid, og dets mekaniske egenskaper kan moduleres ved å endre krysskoblingstiden. Tyramin-konjugert HA er kryssbundet av oksidativ kobling av tyraminmoieties katalysert av hydrogenperoksid og pepperrotperoksidase14. Kollagen, på grunn av sin unike spiralstruktur og krysskoblede fibernettverk, brukes ofte som en adjuvans for å blande seg inn i mikrokarrierene for å fremme cellevedlegg15,16 ytterligere.
Dagens metoder for å forberede mikrokarrierer inkluderer mikrofluidiske sjetonger, blekkskriverutskrift og elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiske chips har vist seg å være raske og effektive i å produsere ensartede mikrokarrierer24. Denne teknologien er imidlertid avhengig av en kompleks strømningskanaldesign og fabrikasjonsprosess25. Høy temperatur eller overdreven ekstruderingskrefter under blekkskrivere, samt intense elektriske felt i elektrospray-tilnærmingen, kan påvirke materialets egenskaper negativt, spesielt dets biologiske aktivitet19. Dessuten, når de brukes på ulike biomaterialer og diametre, resulterer de tilpassede dysene som brukes i disse metodene i begrenset prosesseringskompleksitet, høy pris og lav fleksibilitet.
For å gi en praktisk metode for mikrokarriereforberedelse, har en 3D-utskriftsteknikk kalt vekslende viskøse trege krefter jetting (AVIFJ) blitt brukt til å konstruere hydrogelmikrokarrierer. Teknikken benytter nedadgående drivkrefter og statisk trykk generert under vertikal vibrasjon for å overvinne overflatespenningen til dysespissen og dermed danne dråper. I stedet for alvorlige krefter og termiske forhold virker små raske forskyvninger direkte på dysen under utskrift, noe som forårsaker en mindre effekt på bioinkens fysisk-kjemiske egenskaper og presenterer stor tiltrekning for bioaktive materialer. Ved hjelp av AVIFJ-metoden ble mikrokarrierer av flere biomaterialer med diametre på 100-300 μm vellykket dannet. Dessuten ble mikrokarrierene ytterligere bevist å binde celler godt og gi et passende vekstmiljø for fulgte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Supplere høyglukose Dulbecco modifisert Minimum Essential Medium (H-DMEM) med 10% foster bovint serum (FBS), 1% unødvendig aminosyre løsning (NEAA), 1% penicillin G og streptomycin, og 1% Glutamine supplement som kulturmedier for A549 celler.
- Kultur A549 celler i en CO2 inkubator ved 37 °C og med 5 % CO2
- Dissosiere celler for subkultur ved hjelp av trypsin ved ca. 80% samløp.
- Bruk 3 ml trypsin til å behandle cellene i T75-kulturflasken ved 37 °C i 3 minutter, og tilsett deretter 6 ml kulturmedium for å stoppe trypsiniseringen.
- Pipette kulturmediet for å høste løst festede celler.
- Sentrifuge ved 72,5 x g i 3 min. Fjern supernatanten og resuspend med 3 ml friskt medium.
- Overfør 1 ml cellefjæring til en ny T75-kulturflaske som inneholder 10 ml ferskt medium. Endre kulturmediet annenhver dag.
2. Tilberedning av dyser
- Legg mikropipetter i glass på uttrekkeren i henhold til produsentens anvisninger. Den ytre diameteren, den indre diameteren og lengden på mikrostrålerøret er henholdsvis 1,5 mm, 1,1 mm og 100 mm.
- Still inn trekkparametrene for uttrekkeren. Verdiene for HEAT, PULL, VELOCITY, TIME og PRESSURE er satt til henholdsvis 560, 255, 255, 150 og 500 som standard. Trekk av dysen under disse parametrene.
FORSIKTIG: Dysen som oppnås etter at du har trukket av, er svært skarp, og uforsiktig drift kan forårsake skader. - Klipp av den resulterende dysen (trinn 2.2) ved den angitte diameteren av en mikroforingsenhet i henhold til produsentens instruksjoner for å oppnå en bestemt spissdiameter. Finn spesielt den angitte diameteren på dysen på den oppvarmede platinatråden. Varm opp ledningen opp til 60 °C i ca. 5 s og trekk dysen fra hverandre.
- Senk dysens skrivehode ned i et hydrofobt middel i 30 minutter, etterfulgt av tre skyllesykluser med sterilisert vann.
- Før du skriver ut, steriliser dysen i alkohol i 5 min og skyll den med sterilisert vann tre ganger for å fjerne gjenværende alkohol.
3. Fremstilling av hydrogel bioink
- Løs opp NaCl (0,45 g) i 50 ml sterilt vann for å oppnå en 0,9% (w / v) NaCl-løsning. Vibrer løsningen for å fremme oppløsning. Etter å ha blitt fullstendig oppløst, filtrer løsningen gjennom en 0,45 μm polyetylentereftalatfiltermembran.
- Vei natriumalginatpulver med lav viskositet (1 g) og oppløs det i 25 ml NaCl-oppløsning (trinn 3.1) ved en høy temperatur på 60-80 °C over natten for å oppnå en 4 % (w/v) natriumalginatbestandsoppløsning. Lagerløsningen kan lagres ved 4 °C i 1 måned.
- Steriliser natriumalginatoppløsningen (trinn 3.2) ved å varme den opp tre ganger i en ovn (70 °C) i 30 minutter.
- Fortynn riktig volum natriumalginatbestandsoppløsning (trinn 3,3) i 0,9% NaCl-oppløsning (trinn 3.1) ved konsentrasjoner på 2%, 1,5% og 0,5% (w / v).
MERK: I tillegg til oppvarming i ovnen, bør andre tilberedningsprosesser av natriumalginatoppløsning utføres i hetten. - Løs opp 1 g gelatinpulver i 25 ml NaCl-oppløsning (trinn 3.1) ved en høy temperatur på 60-80 °C over natten for å oppnå en 4% (w / v) gelatin lagerløsning. Lagerløsningen kan lagres ved 4 °C i 1 måned.
- Steriliser gelatinoppløsningen (trinn 3.5) ved å varme den tre ganger i en ovn (70 °C) i 30 minutter.
- Fortynn riktig volum gelatin lageroppløsning (trinn 3,6) i 0,9% NaCl-løsning (trinn 3.1) i en konsentrasjon på 1,5% (w / v).
MERK: I tillegg til oppvarming i ovnen, bør andre fremstillingsprosesser av gelatinoppløsning utføres i hetten. - For å fremme cellebinding på mikrokarrierene, lag alginat-kollagenoppløsningen ved å blande 2% (w / v) natriumalginatoppløsningen og type I kollagenoppløsningen fra rottehale (4 mg / ml) i forholdet 3: 1. Juster oppløsningen til pH 7.2 med 0,1 M NaOH-oppløsning og bruk den umiddelbart etter tilberedning.
- Løs opp den tyrosinmodifiserte HA-flokulente faste i fosfatbuffersaltvann (PBS) ved 60-80 °C over natten for å oppnå en 0,8 % m/w tyrosinmodifisert hyaluronsyre PBS-løsning. Lagerløsningen kan lagres ved 4 °C i 1 måned.
- Steriliser den tyrosinmodifiserte HA PBS-oppløsningen ved å varme den opp tre ganger i en ovn (70 °C) i 30 minutter.
- Løs opp pepperrotperoksidasepulver (500 enzymaktivitetsenhet/mg) i PBS-oppløsning for å oppnå 8 enzymaktivitetsenhet/mg pepperrotperoksidase PBS-oppløsning.
- Fortynn hydrogenperoksidoppløsning (30%, m/w) med DI-vann til 4 mM.
- Forbered den modifiserte HA-pepperrotperoksidaseoppløsningen ved å blande tyrosinmodifisert hyaluronsyre PBS-løsning og pepperrotperoksidase PBS-oppløsning i forholdet 1:1.
MERK: I tillegg til oppvarming i ovnen, bør andre tilberedningsprosesser av HA-pepperrotperoksidaseoppløsning utføres i hetten.
4. Mikrodråper formasjon basert på AVIFJ
- Bruk et hjemmeetablert celleutskriftssystem som tidligere rapportert (figur 1A)26. Den elektriske signalutgangen fra bølgeformgeneratoren forsterkes først og driver deretter piezoelektrisk keramikk for å generere kontrollerbar deformasjon. Dysen festet på piezoelektrisk keramikk produserer dermed kontrollerbare vibrasjoner.
- Steriliser utskriftssystemet ved å tørke av med 75 % (v/v) alkohol og ultrafiolett (UV) eksponering over natten.
- Legg 5 ml bioink (trinn 3.1) i en steril engangssprøyte. Monter sprøyten på sprøytepumpen.
- Koble sprøyten (trinn 4.3) og dysen (trinn 2.5) med en silikonslange med 1 mm indre diameter.
- Fest munnstykket (trinn 4.4) som skal brukes til utskrift ved å justere strammingen til klemskruen. Hold dysespissen unna underlaget under installasjonen for å unngå skade og forurensning.
FORSIKTIG: Hvis munnstykket brytes under installasjonen, bruk tykkere hansker og rengjør glassfragmenter og rester forsiktig. - Skyv sprøytepumpen raskt og last bioinken (trinn 4.3) til dysen (trinn 4.5). Still inn strømningshastigheten på 30 μL/min. Tørk av overflødig materiale på spissen.
- Angi signalgeneratorparametere. Importer selvdesignet bølgeform som inneholder 500 000 prøvepunkter. Angi samplingsfrekvensen og topp-til-topp spenning (Vpp) som henholdsvis 5 millioner prøver / s og 10 V.
- Rengjør sklier eller Petri-retter med deionisert vann. Plasser dem under dysen som utskriftssubstrat.
- Forhåndsinnstill bevegelsesbanen og utløsermodusen for vibrasjon som drop-on-demand.
- Skriv ut slippverktøyene etter de forhåndsutformede mønstrene.
5. Mikrokarrieredannelse basert på AVIFJ
- Gjenta trinn 4.1-4.4, unntatt endre bioink til 2% (w/v) alginatoppløsning (trinn 3.4), alginat-kollagenoppløsning (trinn 3.8), eller modifisert HA-pepperrot peroxidase løsning (trinn 3.13).
- Løs opp 3 g kalsiumklorid i 100 ml sterilt vann for å oppnå 3% (w / v) kalsiumkloridoppløsning. Etter å ha blitt fullstendig oppløst, filtrer løsningen gjennom en 0,45 μm polyetylentereftalatfiltermembran.
- Tilsett 5 ml krysskoblingsløsning (kalsiumkloridoppløsning eller hydrogenperoksidoppløsning) i en Petri-tallerken. Plasser Petri-parabolen under dysen for å fungere som et substrat.
- Etter utskrift, krysskobling mikrokarrierene i 3 min.
- Samle mikrocarrier suspensjon i et sentrifugerør, og berike mikrokarrierer ved sentrifugering ved 29 x g i 3 min. Resuspend mikrokarrierene i kulturmedier på ca. 600 mikrokarrierer/ml.
6. Inokulerende celler på overflaten av mikrokarrierer
- Flekk A549 celler med Cell Tracker Grønn CMFDA for å lette observasjonen av celler. Fjern spesielt kulturmedier, tilsett 5 ml serumfritt medium som inneholder 10 μM Cell Tracker-fargestoff og inkuber celler i 30 minutter i en inkubator. Deretter erstatter du fargestoffløsningen med friskt medium.
- Resuspend A549 celle suspensjon ved tettheten av 1,6 x 106 celler / ml.
- Tilsett 1 ml alginat-kollagenmikrokarrierfjæring (trinn 5.3) og 1 ml A549 celleoppheng (trinn 6.1) i en lavtilklytende 6-brønns kulturplate.
- Plasser platen på en shaker ved 30 o/min i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Ta platen av shakeren og vent i 30 minutter for å la mikrokarrierene slå seg ned. Halvparten endrer kulturmediet annenhver dag.
7. Analyse av mikrodråper/mikrokarrieredannelse
- Vær oppmerksom på og mål munnstykket (trinn 2.2), Petri-rettene (trinn 4.10 og trinn 5.4), og celler med mikrokarrierer (trinn 6.5) under et lyst feltmikroskop eller konfokalt mikroskop. Spesielt er den objektive forstørrelsen 4x, 10x eller 20x og okularforstørrelsen er 10x.
- Mål diameteren på mikrokarrierene etter ImageJ-programvare. I følge skalalinjen som følger med mikroskopet når du tar bilder på bildet, angir du den faktiske størrelsen på skalaen i ImageJ, og tegner 10 linjer av radiusen eller den semi-store aksen til mikrokarrierene. ImageJ kan få gjennomsnittlig størrelse og standardavvik for disse linjesegmentene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skrivehoder med varierte konvergenshastigheter og diametre ble fremstilt for å oppnå utskrift av flere typer materialer. Dysene oppnådd med økende trekkstyrke er vist i figur 1B. Dysene ble delt inn i tre områder: reservoar (III), sammentrekning (II) og skrivehode (I). Reservoaret var den ubehandlede delen av dysen, der væsken ga statisk trykk og bioinkinngang for utskrift. Sammentrekningsområdet var hoveddelen for å generere nedadgående drivkrefter. Trekkstyrken hadde en betydelig effekt på skrivehodet, noe som viste en lavere konvergenshastighet med utvidet trekkstyrke. Det smalere og lengre skrivehodet økte overflatespenningen under utskrift, noe som gjorde dannelsen av diskrete mikrodråper vanskeligere, men forenklet kuttingen av tips med mindre diameter i etterfølgende operasjoner. Etterpå, med nåle smiing instrumentet, ble skrivehodet kuttet av med den angitte diameteren (figur 1C). Tips med forskjellige diametre, inkludert 100, 120, 150 og 200 μm, var tilgjengelige for å generere mikrokarrierer av forskjellige størrelser, og oppfyller kravene til ulike in vitro mikrotissues.
Stabiliteten og kontrollerbarheten til utskriftsprosessen ble først verifisert ved å skrive ut dråper på Petri-retter. Med en 30 μm spissdyse ble flere bioink, inkludert PBS, 1,5% alginat og 1,5% gelatin stabilt trykt (figur 2A, B). Vanskeligheten med å skrive ut en bestemt bioink ble reflektert i samplingsfrekvensen og Vpp som brukes til utskrift. Bioink med lav viskositet som NaCl-oppløsning ble trykt med mindre parametere, noe som resulterte i mindre dråpediametre. Med økende viskositet ble utskriftsprosessen tilsvarende vanskeligere, ettersom større drivkrefter var nødvendig og større dråper ville oppnå (figur 2B). Med denne mekanismen kan justering av parametere og drivkrefter for en gitt bioink brukes til å justere forskjellige dråpestørrelser, som vist i figur 2C. Figur 2D viser arrangementet av dråper som danner de spesifikke bokstavene "THU" på en flat overflate. Dessuten tillot kombinasjonen av mikroskopiske observasjoner lokalisering av mikrodråper i mindre skalaer innen 100 μm.
Alginatmikrokarrierer (figur 3A) og HA-mikrokarrierer (figur 3C) ble trykt med spisser med forskjellige diametre. Effektene av spissdiameteren på alginatmikrokarrierdiameteren er vist i figur 3B. Begrenset av blokkeringen forårsaket av volatilisering av løsningen når størrelsen er for liten, var den minste diameteren på de trykte alginatmikrokarrierene ca. 100 μm. Mens den største diameteren kan nå opp til 300 μm. Diameteren på de trykte mikrokarrierene øker i tråd med spissdiameteren og er alltid større enn sistnevnte. Når spissens diameter er større enn 250 μm, kan bioink ikke skrives ut. Diameteren på trykte modifiserte HA-mikrokarrierer var 76,7 ± 1,8 μm med spissdiametre på 75 μm (figur 3C).
A549 celler og alginat-kollagenmikrokarrierer ble sådd i en tallerken og plassert på en shaker i inkubatoren. Cellene ble observert for å holde seg til alginat-kollagenmikrokarrierene etter blanding i 2 dager. Celler dekker gradvis større overflate av mikrokarrierer ved spredning. Etter dyrking i 6 dager dekket A549-celler nesten mikrokarrierens overflater. Dette resultatet bekrefter at de utviklede mikrokarrierene kan binde celler godt og gi et passende vekstmiljø for cellene. Bilder med lyse felt og konfokale bilder av A549-celler som holder seg til og sprer seg på overflaten av mikrokarrierene, vises i figur 4.
Figur 1: AVIFJ-utskriftssystemet og klargjøring av dyser med forskjellige diametre. (A) Installasjon av AVIFJ-dyse. (B) Under spesifikke PULL-parametere ble dysens skrivehode formet for å konvergere med forskjellige hastigheter. Skalastang: 200 μm. (C) Med kanyle smiinstrumentet ble spissen avskåret i utpekte posisjoner. Skalastang: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Utskrift av flere typer biomaterialer ved ulike konsentrasjoner av AVIFJ. (A) Dysen som brukes i denne delen av resultatene. Spissens diameter var 30 μm. Skala bar: 100 μm. (B) Utskrift av flere typer hydrogelmaterialer, inkludert PBS, 1,5% alginat og 1,5% gelatin ved ulike parametere. M: en million prøver per sekund, som gjenspeiler varigheten av en enkelt vibrasjon. V: topp-til-topp spenning, som reflekterer slaget av en enkelt vibrasjon. Skala bar: 100 μm. (C) Utskrift av 0,5% alginat ved ulike parametere. Skala bar: 100 μm. (D) 2D-ordninger og tett posisjonering av dråper. Skalastang: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mikrokarrierer trykt med forskjellige diametre på dysespissen. (A) 2% alginatmikrokarrierer, trykt med dysespissdiametre på henholdsvis 70, 100, 130, 160, 210 og 250 μm. Skala bar: 100 μm. (B) Effekt av dysespissdiameteren på størrelsen på mikrokarrierer. Størrelsene på mikrokarrierene trykt med dyser med forskjellige diametre ble statistisk analysert ved hjelp av ImageJ-programvare. Ti mikrokarrierer for hver dyse ble valgt og beregnet. Data presenteres som gjennomsnittlige ± s.d. (C) Trykte modifiserte HA-mikrokarrierer med spissdiametre på 75 μm. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Såceller på alginat-kollagenmikrokarrierer. (A) Lyse feltbilder av A549-celler som holder seg til og sprer seg på overflaten av mikrokarrierene. Skala bar: 100 μm. (B) Konfokale bilder av A549-celler som holder seg til og sprer seg på overflaten av mikrokarrierene. Skala bar: 100 μm. Prikkede ellipser brukes til å markere grensen til mikrokarrierer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her, gir instruksjoner for fremstilling av flere typer hydrogelmikrokarrierer og etterfølgende cellesåing. Sammenlignet med mikrofluidisk brikke- og blekkskrivermetoder, gir AVIFJ-tilnærming til konstruksjon av mikrokarrierer større fleksibilitet og biokompatibilitet. En uavhengig dyse gjør det mulig å bruke et bredt spekter av lette dyser, inkludert mikropipetter i glass, i disse utskriftssystemene. Den svært kontrollerbare behandlingen gjør det mulig å justere parametere, inkludert volumet av reservoaret, den indre diameteren og formen på skrivehodet, fritt justert. Videre letter engangsdysen sterilisering for veksling mellom flere materialer, noe som unngår potensiell forurensning fra gjentatt bruk. Til slutt virker små og raske forskyvninger, i stedet for alvorlige krefter og termiske forhold, direkte på dysen under utskriftsprosessen, og opprettholder de opprinnelige fysiske og kjemiske egenskapene til den trykte bioink i maksimal grad; denne funksjonen er svært attraktiv for biomaterialer.
De mest kritiske trinnene for vellykket produksjon av mikrokarrierer av riktig størrelse er: 1) Forbereder dyser med spisser med passende diametre, og 2) tilpasser egnet samplingshastighet og Vpp i henhold til viskositeten til den trykte bioink. Stabiliteten til mikrokarrierekonstruksjonen oppnås ytterligere ved å fjerne satellittdråper og bruke eksterne drivkrefter. De økte parametrene letter dannelsen av mikrokarrierer, men overdreven drivkrefter er hovedårsaken til satellittmikrokarrierdannelse, noe som resulterer i en inhomogen mikrokarrierestørrelse. For å forbedre ensartetheten til mikrocarrier-størrelsen, anbefales det derfor å bruke passende (ikke overdreven) samplingsfrekvenser og Vpp. Et annet aspekt for å forbedre mikrocarrier stabilitet er anvendelsen av eksterne drivkrefter. De eksterne drivkreftene utfyller det statiske trykket og nedadgående drivkrefter, og arbeider sammen for å overvinne overflatespenningen på spissen. En sprøytepumpe som dyttet ble eksperimentert med for å mate dysen og supplere ytterligere skyvekrefter. Spesielt ble dysen koblet til en sprøyte, hvis skyvehastighet ble justert av en presisjonssprøytepumpe. Denne metoden tillot samme konsentrasjon av hydrogelløsning å danne mikrodråper ved begrensede parametere, noe som er gunstig for å redusere størrelsen på mikrokarrierene. Andre studier har rapportert bruk av elektrostatiske felt eller klemmereservoarer for å fremme mikrodroplettrykk27,28.
Selv om det forventes at bruk av eksterne drivkrefter vil utvide spekteret av typer og konsentrasjoner av trykkbare blekk, står utskriftsteknikken som brukes her fortsatt overfor utfordringen med begrensede drivkrefter og er fortsatt ineffektiv for blekk med høy viskositet.
Muligheten for mikrokarriereforberedelse og celleadhesjon ved hjelp av en AVIFJ 3D-skriver ble foreløpig bekreftet. Etterfølgende arbeid vil fokusere på de potensielle anvendelsene av mikrokarrierene i byggingen av biologiske modeller. I fremtidig forskning vil celleadhesjonsprosessen bli optimalisert slik at antall og typer celler vil bli ytterligere økt og beriket, noe som forventes å danne et funksjonelt vev eller vaskulært nettverk. Dessuten vil bioink bli ytterligere co-printet med celler for å danne funksjonelle heterogene strukturelle enheter. Mikrokapsler, mikropartikler og andre strukturer kan også lastes inn i mikrokarrierene for å danne en vedvarende legemiddelutgivelsesmodell for klinisk bruk. Oppsummert er det utviklet en metode for å konstruere vevsmikroenheter, som forventes å bli skalert opp for å danne in vitro funksjonelle mikrovev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) og 111 Project (B17026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
