Presentert her er en mild 3D-utskriftsteknikk drevet av vekslende viskøse inertialkrefter for å muliggjøre bygging av hydrogelmikrokarrierer. Hjemmelagde dyser gir fleksibilitet, noe som gir enkel utskifting for forskjellige materialer og diametre. Cellebindende mikrokarrierer med en diameter på 50-500 μm kan oppnås og samles for videre dyrking.
Mikrokarrierer er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort spesifikt overflateareal, som ofte brukes som bærere for store cellekulturer. Mikrokarrierekulturteknologi har blitt en av de viktigste teknikkene innen cytologisk forskning og brukes ofte innen storskala celleutvidelse. Mikrokarrierer har også vist seg å spille en stadig viktigere rolle i in vitro vev engineering konstruksjon og klinisk narkotika screening. Nåværende metoder for å forberede mikrokarrierer inkluderer mikrofluidiske sjetonger og blekkskriverutskrift, som ofte er avhengige av kompleks strømningskanaldesign, et inkompatibelt tofaset grensesnitt og en fast dyseform. Disse metodene står overfor utfordringene ved kompleks dysebehandling, ubeleilige dyseendringer og overdreven ekstruderingskrefter når de brukes på flere bioink. I denne studien ble en 3D-utskriftsteknikk, kalt vekslende viskøs-inertial kraftstråle, brukt for å muliggjøre bygging av hydrogelmikrokarrierer med en diameter på 100-300 μm. Celler ble senere sådd på mikrokarrierer for å danne vevsteknikkmoduler. Sammenlignet med eksisterende metoder, tilbyr denne metoden en gratis dysespissdiameter, fleksibel dyseveksling, fri kontroll av utskriftsparametere og milde utskriftsforhold for et bredt spekter av bioaktive materialer.
Mikrokarrierer er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort spesifikt overflateareal og brukes ofte til storskala kultur av celler1,2. Deres ytre overflate gir rikelig vekststeder for celler, og interiøret gir en støttestruktur for romlig spredning. Den sfæriske strukturen gir også bekvemmelighet i overvåking og kontroll av parametere, inkludert pH, O2 og konsentrasjon av næringsstoffer og metabolitter. Når mikrokarrierer brukes i kombinasjon med omrørte tankbioreaktorer, kan de oppnå høyere celletetthet i et relativt lite volum sammenlignet med konvensjonelle kulturer, og dermed gi en kostnadseffektiv måte å oppnå store kulturer3 på. Mikrocarrier kulturteknologi har blitt en av de viktigste teknikkene innen cytologisk forskning, og mye fremgang har blitt gjort innen storskala utvidelse av stamceller, hepatocytter, kondrocytter, fibroblaster og andre strukturer4. De har også vist seg å være ideelle legemiddelleveringskjøretøy og nedenfra-og-opp-enheter, og tar derfor en stadig viktigere rolle i klinisk legemiddelscreening og in vitro vevsteknikk reparasjon5.
For å møte mekaniske eiendomskrav i ulike scenarier er flere typer hydrogelmaterialer utviklet for bruk i bygging av mikrokarrierer6,7,8,9,10,11. Alginat- og hyaluronsyre (HA) hydrogeler er to av de mest brukte mikrokarrierematerialene på grunn av deres gode biokompatibilitet og krysskoblingsevne12,13. Alginat kan enkelt krysskobles av kalsiumklorid, og dets mekaniske egenskaper kan moduleres ved å endre krysskoblingstiden. Tyramin-konjugert HA er kryssbundet av oksidativ kobling av tyraminmoieties katalysert av hydrogenperoksid og pepperrotperoksidase14. Kollagen, på grunn av sin unike spiralstruktur og krysskoblede fibernettverk, brukes ofte som en adjuvans for å blande seg inn i mikrokarrierene for å fremme cellevedlegg15,16 ytterligere.
Dagens metoder for å forberede mikrokarrierer inkluderer mikrofluidiske sjetonger, blekkskriverutskrift og elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiske chips har vist seg å være raske og effektive i å produsere ensartede mikrokarrierer24. Denne teknologien er imidlertid avhengig av en kompleks strømningskanaldesign og fabrikasjonsprosess25. Høy temperatur eller overdreven ekstruderingskrefter under blekkskrivere, samt intense elektriske felt i elektrospray-tilnærmingen, kan påvirke materialets egenskaper negativt, spesielt dets biologiske aktivitet19. Dessuten, når de brukes på ulike biomaterialer og diametre, resulterer de tilpassede dysene som brukes i disse metodene i begrenset prosesseringskompleksitet, høy pris og lav fleksibilitet.
For å gi en praktisk metode for mikrokarriereforberedelse, har en 3D-utskriftsteknikk kalt vekslende viskøse trege krefter jetting (AVIFJ) blitt brukt til å konstruere hydrogelmikrokarrierer. Teknikken benytter nedadgående drivkrefter og statisk trykk generert under vertikal vibrasjon for å overvinne overflatespenningen til dysespissen og dermed danne dråper. I stedet for alvorlige krefter og termiske forhold virker små raske forskyvninger direkte på dysen under utskrift, noe som forårsaker en mindre effekt på bioinkens fysisk-kjemiske egenskaper og presenterer stor tiltrekning for bioaktive materialer. Ved hjelp av AVIFJ-metoden ble mikrokarrierer av flere biomaterialer med diametre på 100-300 μm vellykket dannet. Dessuten ble mikrokarrierene ytterligere bevist å binde celler godt og gi et passende vekstmiljø for fulgte celler.
Protokollen som er beskrevet her, gir instruksjoner for fremstilling av flere typer hydrogelmikrokarrierer og etterfølgende cellesåing. Sammenlignet med mikrofluidisk brikke- og blekkskrivermetoder, gir AVIFJ-tilnærming til konstruksjon av mikrokarrierer større fleksibilitet og biokompatibilitet. En uavhengig dyse gjør det mulig å bruke et bredt spekter av lette dyser, inkludert mikropipetter i glass, i disse utskriftssystemene. Den svært kontrollerbare behandlingen gjør det mulig å justere parametere, inkludert…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) og 111 Project (B17026).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Gelatin | SIGMA | G1890 | |
Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
Puller | sutter instrument | P-1000 | |
Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |