Summary
Burada sunulan, hidrojel mikrokaçörlerin yapımını sağlamak için viskoz-atalet kuvvetlerinin alternatifi tarafından tahrik edilen hafif bir 3D baskı tekniğidir. Ev yapımı nozüller esneklik sunarak farklı malzemeler ve çaplar için kolay değişim sağlar. 50-500 μm çapında hücre bağlama mikrokaderleri elde edilebilir ve daha fazla kültleme için toplanabilir.
Abstract
Mikrokaçarlar, 60-250 μm çapında boncuklar ve büyük ölçekli hücre kültürleri için taşıyıcı olarak yaygın olarak kullanılan geniş bir özel yüzey alanıdır. Mikrokaçör kültürü teknolojisi sitolojik araştırmalarda ana tekniklerden biri haline gelmiştir ve yaygın olarak büyük ölçekli hücre genişlemesi alanında kullanılmaktadır. Mikrokaçörlerin in vitro doku mühendisliği yapımı ve klinik ilaç taramasında giderek daha önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Mikrokaçörleri hazırlamak için mevcut yöntemler arasında genellikle karmaşık akış kanalı tasarımına, uyumsuz iki fazlı arayüze ve sabit bir nozul şekline dayanan mikroakışkan çipler ve mürekkep püskürtmeli baskı bulunur. Bu yöntemler, birden fazla biyoink'e uygulandığında karmaşık nozül işleme, sakıncalı nozül değişiklikleri ve aşırı ekstrüzyon kuvvetlerinin zorluklarıyla karşı karşıyadır. Bu çalışmada, 100-300 μm çapında hidrojel mikrokaçörlerin yapımını sağlamak için alternatif viskoz-atalet kuvveti jetleme adı verilen bir 3D baskı tekniği uygulanmıştır. Hücreler daha sonra doku mühendisliği modülleri oluşturmak için mikrokaçörler üzerine tohumlandı. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem çok çeşitli biyoaktif malzemeler için ücretsiz nozül ucu çapı, esnek nozül anahtarlama, baskı parametrelerinin serbest kontrolü ve hafif baskı koşulları sunar.
Introduction
Mikrokaçarlar 60-250 μm çapında ve geniş bir yüzey alanına sahip boncuklardır ve genellikle büyük ölçekli hücre kültürü için kullanılır1,2. Dış yüzeyleri hücreler için bol miktarda büyüme alanı sağlar ve iç mekansal çoğalma için bir destek yapısı sağlar. Küresel yapı ayrıca pH, O2 ve besin ve metabolit konsantrasyonu da dahil olmak üzere parametreleri izleme ve kontrol etmede kolaylık sağlar. Karıştırılmış tank biyoreaktörleri ile birlikte kullanıldığında, mikrokaçörler geleneksel kültürlere kıyasla nispeten küçük bir hacimde daha yüksek hücre yoğunlukları elde edebilir, böylece büyük ölçekli kültürlere ulaşmak için uygun maliyetli bir yol sağlayabilir3. Mikrokaç kültürü teknolojisi sitolojik araştırmalarda ana tekniklerden biri haline gelmiştir ve kök hücrelerin, hepatositlerin, kondrositlerin, fibroblastların ve diğer yapıların büyük ölçekli genişlemesi alanında çok ilerleme kaydedildi4. Ayrıca ideal ilaç dağıtım araçları ve aşağıdan yukarıya üniteler oldukları ve bu nedenle klinik ilaç taraması ve in vitro doku mühendisliği onarımında giderek daha önemli bir rol üstlendikleri bulunmuştur5.
Farklı senaryolarda mekanik özellik gereksinimlerini karşılamak için, mikrokaçörlerin yapımında kullanılmak üzere birden fazla hidrojel malzeme türü geliştirilmiştir6,7,8,9,10,11. Aljinat ve hyaluronik asit (HA) hidrojelleri, iyi biyouyumlulukları ve çapraz bağlantıları nedeniyle en çok kullanılan mikrokaç malzemelerden ikisidir12,13. Aljinat kalsiyum klorür ile kolayca çapraz bağlanabilir ve mekanik özellikleri çapraz bağlama süresi değiştirilerek modüle edilebilir. Tyramine konjuge HA, hidrojen peroksit ve yaban turpu peroksidaz14 ile katalize edilen tyramine moieties'in oksidatif bağlantısı ile çapraz bağlanır. Kollajen, benzersiz spiral yapısı ve çapraz bağlı fiber ağı nedeniyle, hücre bağlanmasını daha da teşvik etmek için mikrokaçörlere karışmak için genellikle bir yardımcı olarak kullanılır15,16.
Mikrokaçör hazırlamanın güncel yöntemleri arasında mikroakışkan çipler, mürekkep püskürtmeli baskı ve elektrospray17,18,19,20,21,22,23 bulunur. Mikroakışkan çiplerin tek tip boyutlu mikrokaçörler üretmede hızlı ve verimli olduğu kanıtlanmıştır24. Ancak, bu teknoloji karmaşık bir akış kanalı tasarımına ve üretim sürecine dayanır25. Mürekkep püskürtmeli baskı sırasında yüksek sıcaklık veya aşırı ekstrüzyon kuvvetlerinin yanı sıra elektrospray yaklaşımındaki yoğun elektrik alanları, malzemenin özelliklerini, özellikle biyolojik aktivitesini olumsuz yönde etkileyebilir19. Ayrıca, çeşitli biyomalzemelere ve çaplara uygulandığında, bu yöntemlerde kullanılan özelleştirilmiş nozüller sınırlı işlem karmaşıklığı, yüksek maliyet ve düşük esneklik sağlar.
Mikrokaç hazırlama için uygun bir yöntem sağlamak için, hidrojel mikrokaçörleri oluşturmak için alternatif viskoz-atalet kuvvetleri püskürtme (AVIFJ) adı verilen bir 3D baskı tekniği uygulanmıştır. Teknik, nozül ucunun yüzey gerilimini aşmak ve böylece damlacıklar oluşturmak için dikey titreşim sırasında oluşturulan aşağı doğru itici kuvvetler ve statik basınç kullanır. Şiddetli kuvvetler ve termal koşullar yerine, küçük hızlı yer değiştirmeler baskı sırasında doğrudan nozul üzerinde hareket eder, biyoink'in fizikokimyasal özellikleri üzerinde küçük bir etkiye neden olan ve biyoaktif malzemeler için büyük bir cazibe sunan. AVIFJ yöntemi kullanılarak, 100-300 μm çapında birden fazla biyomalzemenin mikrokaçları başarıyla oluşturulmuştur. Ayrıca, mikrokaçların hücreleri iyi bağladığı ve yapışan hücreler için uygun bir büyüme ortamı sağladığı daha da kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü
- Yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye edilmiş Minimum Esansiyel Ortamı (H-DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 gereksiz amino asit çözeltisi (NEAA), %1 penisilin G ve streptomisin ve %1 Glutamin takviyesini A549 hücreleri için kültür medyası olarak tamamlar.
- 37 °C'de ve %5 CO2'de co2 inkübatörde Kültür A549 hücreleri
- Yaklaşık % 80 izdihamda tripsin kullanarak alt kültür için ayrıştırma hücreleri.
- T75 kültür şişeslerindeki hücreleri 3 dakika boyunca 37 °C'de tedavi etmek için 3 mL tripsin kullanın ve ardından trypnizasyonu durdurmak için 6 mL kültür ortamı ekleyin.
- Pipet gevşek yapıştılı hücreleri hasat etmek için kültür ortamı.
- 3 dakika boyunca 72,5 x g'da santrifüj. Süpernatant çıkarın ve 3 mL taze ortam ile resuspend.
- 1 mL hücre süspansiyonu, 10 mL taze ortam içeren yeni bir T75 kültür şişesine aktarın. Kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin.
2. Nozüllerin hazırlanması
- Cam mikropipettes'i üreticinin talimatlarına uyarak çekmeciye yükleyin. Mikro jet borusunun dış çapı, iç çapı ve uzunluğu sırasıyla 1,5 mm, 1,1 mm ve 100 mm'dir.
- Çekme parametrelerini çekin. Özellikle, HEAT, PULL, VELOCITY, TIME ve PRESSURE değerleri varsayılan olarak 560, 255, 255, 150 ve 500 olarak ayarlanır. Bu parametrelerin altındaki nozüleyi çekin.
DİkKAT: Çekildikten sonra elde edilen nozül çok keskindir ve dikkatsiz çalışma yaralanmalara neden olabilir. - Elde edilen nozülü (adım 2.2) belirli bir uç çapını elde etmek için üreticinin talimatlarını izleyerek bir mikro dövge cihazı ile belirlenen çapta kesin. Özellikle, nozülün belirtilen çapını ısıtılmış platin tel üzerine bulun. Teli yaklaşık 5 sn boyunca 60 °C'ye kadar ısıtın ve nozulu ayırın.
- Nozülün baskı kafasını 30 dakika boyunca hidrofobik bir maddeye batırın, ardından sterilize suyla üç kez durulayın.
- Yazdırmadan önce, nozülü alkolde 5 dakika sterilize edin ve kalan alkolü çıkarmak için üç kez sterilize suyla durulayın.
3. Hidrojel biyoink hazırlanması
- %0,9 (w/v) NaCl çözeltisi elde etmek için NaCl'i (0,45 g) 50 mL steril suya çözün. Çözünmeyi teşvik etmek için çözeltiyi titreştirin. Tamamen çözüldükten sonra, çözeltiyi 0,45 μm polietilen tereftalat filtre membranından filtreleyin.
- Düşük viskoziteli sodyum aljinat tozunu (1 g) tartın ve %4 (w/v) sodyum aljinat stok çözeltisi elde etmek için bir gecede 60-80 °C'lik yüksek bir sıcaklıkta 25 mL NaCl çözeltisinde (adım 3,1) çözün. Stok çözeltisi 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
- Sodyum aljinat stok çözeltisini (adım 3.2) bir fırında (70 °C) üç kez 30 dakika ısıtarak sterilize edin.
- Uygun sodyum aljinat stok çözeltisi hacmini (adım 3.3) %0.9 NaCl çözeltisinde (adım 3.1) %2, %1.5 ve %0.5 (w/v) konsantrasyonlarda seyreltin.
NOT: Fırında ısıtmaya ek olarak, kaputta sodyum aljinat çözeltisinin diğer hazırlık işlemleri yapılmalıdır. - %4 (w/v) jelatin stok çözeltisi elde etmek için 1 g jelatin tozunu 25 mL NaCl çözeltisinde (adım 3.1) bir gecede 60-80 °C yüksek sıcaklıkta çözün. Stok çözeltisi 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
- Jelatin stok çözeltisini (adım 3.5) bir fırında (70 °C) üç kez 30 dakika ısıtarak sterilize edin.
- Uygun jelatin stok çözeltisi hacmini (adım 3.6) % 0.9 NaCl çözeltisinde (adım 3.1) % 1.5 (w / v) konsantrasyonda seyreltin.
NOT: Fırında ısıtmaya ek olarak, jelatin çözeltisinin diğer hazırlık işlemleri davlumbazda yapılmalıdır. - Mikrokaçörlerde hücre bağlanmasını teşvik etmek için% 2 (w/v) sodyum aljinat çözeltisini ve Tip I kolajen çözeltisini sıçan kuyruğundan (4 mg/mL) 3:1 oranında karıştırarak aljinat-kollajen çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 0,1 M NaOH çözeltisi ile pH 7,2'ye ayarlayın ve hazırlık sonrası kullanın.
- Tirozin modifiye HA flokülent katıyı fosfat tampon salin (PBS) çözeltisinde bir gecede 60-80 °C'de eriterek %0,8 w tirozin modifiye hyaluronik asit PBS çözeltisi elde edin. Stok çözeltisi 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
- Tirozin modifiye HA PBS çözeltisini bir fırında (70 °C) 30 dakika üç kez ısıtarak sterilize edin.
- 8 enzim aktivite birimi/mg yaban turpu peroksidaz PBS çözeltisi elde etmek için PBS çözeltisinde yaban turpu peroksidaz tozunu (500 enzim aktivite birimi/mg) çözün.
- Hidrojen peroksit çözeltisini (%30, w/w) DI su ile 4 mM'ye seyreltin.
- Tirozin modifiye hyaluronik asit PBS çözeltisi ve yaban turpu peroksidaz PBS çözeltisini 1:1 oranında karıştırarak modifiye HA-yaban turpu peroksidaz çözeltisini hazırlayın.
NOT: Fırında ısıtmaya ek olarak, HA-yaban turpu peroksidaz çözeltisinin diğer hazırlık işlemleri kaputta yapılmalıdır.
4. AVIFJ'ye dayalı mikro damlacık oluşumu
- Daha önce bildirildiği gibi evde kurulmuş bir hücre baskı sistemi kullanın (Şekil 1A)26. Dalga biçimi üreteci tarafından elektrik sinyali çıkışı önce yükseltilir ve daha sonra kontrol edilebilir deformasyon oluşturmak için piezoelektrik seramikleri çalıştırır. Piezoelektrik seramiğe sabitlenmiş nozül böylece kontrol edilebilir titreşimler üretir.
- Bir gecede %75 (v/v) alkol ve ultraviyole (UV) maruziyeti ile silerek baskı sistemini sterilize edin.
- Tek kullanımlık steril bir şırınna 5 mL biyoink (adım 3.1) yükleyin. Şırındıcı şırınna pompasına takın.
- Şırınd (adım 4.3) ve nozülü (adım 2.5) 1 mm iç çaplı bir silikon hortumla bağlayın.
- Sıkıştırma vidasının sızdırmazlığını ayarlayarak yazdırma için kullanılacak nozülü (adım 4.4) sabitleyin. Hasar ve kirlenmeyi önlemek için kurulum sırasında nozülün ucunu alt tabakadan uzak tutun.
DİkKAT: Kurulum sırasında nozul kırılmışsa, lütfen daha kalın eldivenler giyin ve cam parçalarını ve kalıntılarını dikkatlice temizleyin. - Şırıng pompasını hızla itin ve biyoink'i (adım 4.3) nozüle (adım 4.5) yükleyin. Akış hızını 30 μL/dak olarak ayarlayın. Ucundaki fazla malzemeyi silin.
- Sinyal üreteci parametrelerini ayarlayın. 500.000 örnekleme noktası içeren kendi kendine tasarlanmış dalga biçimini içe aktarın. Örnekleme hızını ve tepe-tepe gerilimini (Vpp) sırasıyla 5 milyon numune/s ve 10 V olarak ayarlayın.
- Slaytları veya Petri tabaklarını deiyonize suyla temizleyin. Bunları baskı alt tabakası olarak nozülün altına yerleştirin.
- Hareket yolunu ve tetik titreşim modunu isteğe bağlı bırakma olarak önceden ayarla.
- Önceden tasarlanmış desenleri izleyerek damlacıkları yazdırın.
5. AVIFJ'ye dayalı mikrokaçör oluşumu
- Biyoink'i %2 (w/v) aljinat çözeltisi (adım 3.4), aljinat-kollajen çözeltisi (adım 3.8) veya değiştirilmiş HA-yaban turpu peroksidaz çözeltisi (adım 3.13) olarak değiştirmek dışında 4.1-4.4 adımlarını yineleyin.
- % 3 (w/v) kalsiyum klorür çözeltisi elde etmek için 3 g kalsiyum klorürü 100 mL steril suya çözün. Tamamen çözüldükten sonra, çözeltiyi 0,45 μm polietilen tereftalat filtre membranından filtreleyin.
- Petri kabına 5 mL çapraz bağlama çözeltisi (kalsiyum klorür çözeltisi veya hidrojen peroksit çözeltisi) ekleyin. Petri kabını bir substrat olarak çalışmak için nozülün altına yerleştirin.
- Yazdırdikten sonra, mikro taşıyıcıları 3 dakika çapraz bağlayın.
- Mikrokaç süspansiyonunu bir santrifüj tüpünde toplayın ve mikrokaçları 3 dakika boyunca 29 x g'da santrifüjleme ile zenginleştirin. Mikrokaçörleri kültür ortamlarında yaklaşık 600 mikrokarrier/mL'de yeniden depolayın.
6. Mikrokaçörlerin yüzeyindeki hücrelerin aşılanması
- Hücrelerin gözlemini kolaylaştırmak için A549 hücrelerini Hücre İzleyici Yeşil CMFDA ile lekelenin. Özellikle, kültür medyasını çıkarın, 10 μM Hücre İzleyici boyası içeren 5 mL serumsuz ortam ekleyin ve bir inkübatörde 30 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Ardından, boya çözeltisini taze ortamla değiştirin.
- A549 hücre süspansiyonu 1,6 x 106 hücre/mL yoğunluğunda yeniden biriktirin.
- Düşük yapışan 6 kuyulu bir kültür plakasına 1 mL aljinat-kollajen mikrokaçör süspansiyonu (adım 5.3) ve 1 mL A549 hücre süspansiyonu (adım 6.1) ekleyin.
- Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de bir inkübatörde 30 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Plakayı çalkalayıcıdan alın ve mikrokaerlerin yerleşmesi için 30 dakika bekleyin. Yarısı her 2 günde bir kültür ortamını değiştirir.
7. Mikrodroplet/mikrokaçör oluşumunun analizi
- Parlak alan mikroskobu veya konfokal mikroskop altında nozülü (adım 2.2), Petri tabaklarını (adım 4.10 ve adım 5.4) ve mikrokarrierli hücreleri (adım 6.5) gözlemleyin ve ölçün. Özellikle, objektif büyütme 4x, 10x veya 20x ve göz merceği büyütme 10x'tir.
- ImageJ yazılımı ile mikrokaçların çapını ölçün. Resimde çekim yaparken mikroskopla birlikte gelen ölçek çubuğuna göre, ImageJ'de ölçeğin gerçek boyutunu ayarlayın ve mikrokaverilerin yarıçapının veya yarı ana ekseninin 10 çizgisini çizin. ImageJ, bu çizgi parçalarının ortalama boyutunu ve standart saptırmasını alabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çeşitli yakınsama hızlarında ve çaplarında baskı kafaları, birden fazla malzeme türünün basılmasını sağlamak için üretilmiştir. Artan çekme mukavemeti ile elde edilen nozüller Şekil 1B'de gösterilmiştir. Nozüller üç alana ayrılmıştır: rezervuar (III), kasılma (II) ve baskı kafası (I). Rezervuar, sıvının baskı için statik basınç ve biyoink girişi sağladığı nozülun işlenmemiş kısmıydı. Daralma alanı, aşağı doğru itici güçler üretmek için ana parçaydı. Çekme mukavemeti, baskı kafası üzerinde önemli bir etkiye sahipti ve uzun çekme mukavemeti ile daha düşük bir yakınsama oranı gösterdi. Daha dar ve daha uzun baskı kafası, baskı sırasında yüzey gerilimini artırarak ayrık mikro damlacıkların oluşumunu zorlaştırmış, ancak sonraki işlemlerde daha küçük çaplı uçların kesilmesini kolaylaştırmıştır. Daha sonra iğneli çatallama aleti ile baskı kafası belirlenen çapta kesilmiştir (Şekil 1C). 100, 120, 150 ve 200 μm dahil olmak üzere çeşitli çaplara sahip ipuçları, çeşitli in vitro mikrotizelerin gereksinimlerini karşılayan farklı boyutlarda mikrokaçörler üretmek için mevcuttu.
Baskı işleminin stabilitesi ve kontrol edilebilirliği ilk olarak Petri kaplarına damlacıklar yazdırılarak doğrulandı. 30 μm uç nozulu ile PBS, %1,5 aljinat ve %1,5 jelatin dahil olmak üzere birden fazla biyoink sabit olarak basılmıştır (Şekil 2A,B). Belirli bir biyoink yazdırmanın zorluğu, örnekleme oranına ve baskı için kullanılan Vpp'ye yansıdı. NaCl çözeltisi gibi düşük viskoziteli biyoink daha küçük parametrelerde basıldı ve bu da daha küçük damlacık çaplarına neden oldu. Artan viskozite ile, daha büyük tahrik kuvvetlerine ihtiyaç duyulduğu ve daha büyük damlacıklar elde edeceği için yazdırma işlemi buna bağlı olarak daha zor hale geldi (Şekil 2B). Bu mekanizma ile, şekil 2C'de gösterildiği gibi farklı damlacık boyutlarını ayarlamak için belirli bir biyoink için parametrelerin ve tahrik kuvvetlerinin ayarlanması kullanılabilir. Şekil 2D, düz bir yüzeyde belirli "THU" harflerini oluşturan damlacıkların düzenini göstermektedir. Ayrıca, mikroskobik gözlemlerin kombinasyonu, mikrodropletlerin 100 μm içinde daha küçük ölçeklerde lokalizasyonuna izin verdi.
Aljinat mikrokaçörleri (Şekil 3A) ve HA mikrokaçörleri (Şekil 3C) farklı çaplarda uçlarla basılmıştır. Uç çapının aljinat mikrokaçer çapı üzerindeki etkileri Şekil 3B'de gösterilmiştir. Boyut çok küçük olduğunda çözeltinin volatilizasyonunun neden olduğu tıkanıklıkla sınırlı olarak, baskılı aljinat mikrokaçörlerinin en küçük çapı yaklaşık 100 μm idi. En büyük çap 300 μm'ye kadar ulaşabilirken. Baskılı mikrokaçların çapı uç çapına göre artar ve her zaman ikincisinden daha büyüktür. Ucun çapı 250 μm'den büyük olduğunda, biyoink yazdırılamaz. Baskılı modifiye HA mikrokaderlerinin çapı 76,7 ± 1,8 μm 75 μm uç çapları idi (Şekil 3C).
A549 hücreleri ve aljinat-kollajen mikrokarrierleri bir tabağa tohumlandı ve inkübatördeki bir çalkalayıcıya yerleştirildi. Hücrelerin 2 gün boyunca karıştırıldıktan sonra aljinat-kollajen mikrokaçörlerine yapıştığı gözlendi. Hücreler çoğalarak mikrokaçların daha büyük yüzeyini aşamalı olarak kaplar. 6 gün boyunca ekimden sonra, A549 hücreleri mikrokaç yüzeyleri neredeyse tamamen kapladı. Bu sonuç, geliştirilen mikrokaçların hücreleri iyi bağlayabileceğini ve hücreler için uygun bir büyüme ortamı sağlayabileceğini doğrulamaz. Mikrokaçörlerin yüzeyine yaparak ve çoğalarak A549 hücrelerinin parlak alan görüntüleri ve konfokal görüntüleri Şekil 4'te gösterilmiştir.
Şekil 1: AVIFJ baskı sistemi ve çeşitli çaplardaki nozüllerin hazırlanması. (A) AVIFJ nozüllerinin montajı. (B) Belirli PULL parametreleri altında, nozülün baskı kafası farklı oranlarda yakınsaacak şekilde şekillendirildi. Ölçek çubuğu: 200 μm. (C) İğneli iğmelet ile ucu belirlenen pozisyonlarda kesildi. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Avifj tarafından çeşitli konsantrasyonlarda birden fazla biyomalzeme türünün basılması. (A) Sonuçların bu bölümünde kullanılan nozül. Ucun çapı 30 μm idi. Ölçek çubuğu: 100 μm. (B) PBS, %1,5 aljinat ve %1,5 jelatin dahil olmak üzere çeşitli parametrelerde birden fazla hidrojel malzeme türünün basılması. M: Saniyede bir milyon örnek, tek bir titreşimin süresini yansıtır. V: tek bir titreşimin darbesini yansıtan zirveden tepeye voltaj. Ölçek çubuğu: 100 μm. (C) Çeşitli parametrelerde % 0,5 aljinatın basılması. Ölçek çubuğu: 100 μm. (D) 2D düzenlemeler ve damlacıkların yakın konumlandırılması. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nozül ucunun farklı çaplarında basılan mikrokaçörler. (A) Sırasıyla 70, 100, 130, 160, 210 ve 250 μm'de nozül ucu çapları ile basılan %2 aljinat mikrokarit. Ölçek çubuğu: 100 μm. (B) Nozül ucu çapının mikrokaçörlerin büyüklüğüne etkisi. Farklı çaplarda nozüllerle basılan mikrokaçerilerin boyutları ImageJ yazılımı kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. Her nozül için on mikrokaç seçildi ve hesaplandı. Veriler ortalama ± s.d. (C) Uç çapları 75 μm olan baskılı modifiye HA mikrokaçörleri olarak sunulmaktadır. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Aljinat-kollajen mikrokarrierler üzerinde tohumlama hücreleri. (A) Mikrokaçarların yüzeyinde bağlı kalan ve çoğalan A549 hücrelerinin parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. (B) Mikrokaçörlerin yüzeyine yaparak ve çoğalarak A549 hücrelerinin konfokal görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. Noktalı elipsler mikrokaçların kenarlıklarını vurgulamak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, çok tip hidrojel mikrokaçörlerin hazırlanması ve daha sonra hücre tohumlama için talimatlar sağlar. Mikroakışkan çip ve mürekkep püskürtmeli baskı yöntemleriyle karşılaştırıldığında, AVIFJ mikrokaçörler oluşturmaya yönelik yaklaşımı daha fazla esneklik ve biyouyumluluk sunar. Bağımsız bir nozül, bu baskı sistemlerinde cam mikropipletler de dahil olmak üzere çok çeşitli hafif nozüllerin kullanılmasını sağlar. Son derece kontrol edilebilir işleme, rezervuarın hacmi, iç çapı ve baskı kafasının şekli gibi parametrelerin serbestçe ayarlanmasını sağlar. Ayrıca, tek kullanımlık nozül, birden fazla malzeme arasında geçiş yapmak için sterilizasyonu kolaylaştırır ve bu da tekrarlanan kullanımdan kaynaklanan potansiyel kirlenmeyi önler. Son olarak, küçük ve hızlı yer değiştirmeler, ağır kuvvetler ve termal koşullar yerine, baskı işlemi sırasında doğrudan nozül üzerinde hareket eder ve baskılı biyoink'in orijinal fiziksel ve kimyasal özelliklerini maksimum ölçüde korur; bu özellik biyomalzeme uygulamaları için oldukça çekicidir.
Doğru boyutta mikrokaçörlerin başarılı bir şekilde üretilmesi için en kritik adımlar şunlardır: 1) Uygun çaplarda uçlu nozulların hazırlanması ve 2) uygun numune alma oranının ve Vpp'nin baskılı biyoink'in viskozitesine göre uyarılması. Mikrokaç konstrüksiyonunun stabilitesi, uydu damlacıklarının çıkarılması ve harici tahrik kuvvetlerinin uygulanmasıyla daha da sağlanır. Artan parametreler mikrokaçörlerin oluşumunu kolaylaştırır, ancak aşırı itici kuvvetler uydu mikrokaçörü oluşumunun temel nedenidir ve bu da inhomogeneous mikrokaçör boyutuna neden olmaktadır. Bu nedenle, mikrokaç boyutunun homojenliğini artırmak için uygun (aşırı olmayan) örnekleme oranlarının ve Vpp'nin kullanılması önerilir. Mikrokaç stabilitesini artırmak için bir başka yön de harici tahrik kuvvetlerinin uygulanmasıdır. Dış sürüş kuvvetleri statik basıncı ve aşağı doğru sürüş kuvvetlerini tamamlar ve uçta yüzey geriliminin üstesinden gelmek için birlikte çalışır. Nozül ve ek itme kuvvetlerini beslemek için şırıngam pompası itme deneyi yapıldı. Özellikle, nozül, itme hızı hassas bir şırınna pompası tarafından ayarlanan bir şırındıya bağlandı. Bu yöntem, aynı hidrojel çözelti konsantrasyonunun mikrokaçların boyutunu azaltmak için faydalı olan sınırlı parametrelerde mikro damlacıklar oluşturmasına izin verdi. Diğer çalışmalar, mikro damlacık basımını teşvik etmek için elektrostatik alanların veya sıkma rezervuarlarının kullanıldığını bildirmektedir27,28.
Harici tahrik kuvvetlerinin uygulanmasının yazdırılabilir mürekkeplerin türlerini ve konsantrasyonlarını genişletmesi beklense de, burada kullanılan baskı tekniği hala sınırlı sürüş kuvvetlerinin zorluğuyla karşı karşıyadır ve yüksek viskoziteli mürekkepler için hala etkisizdir.
Avifj 3D yazıcı kullanılarak mikrokaç hazırlığı ve hücre yapışma fizibilitesi önceden doğrulandı. Daha sonraki çalışmalar, mikrokaçörlerin biyolojik modellerin yapımındaki potansiyel uygulamalarına odaklanacaktır. Gelecekteki araştırmalarda, hücre yapışıklığı süreci optimize edilecek, böylece hücre sayısı ve türleri daha da artırılacak ve zenginleştirilecektir, bu da fonksiyonel bir doku veya damar ağı oluşturması beklenir. Ayrıca, biyoink fonksiyonel heterojen yapısal birimler oluşturmak için hücrelerle birlikte basılacaktır. Mikrokapsüller, mikropartiküller ve diğer yapılar da klinik kullanım için sürekli bir ilaç salınım modeli oluşturmak için mikrokaverilerin içine yüklenebilir. Özetle, in vitro fonksiyonel mikro dokular oluşturacak şekilde ölçeklendirilmesi beklenen doku mikro birimlerinin oluşturulması için bir yöntem geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (3212007), Tsinghua Üniversitesi Girişim Bilimsel Araştırma Programı (20197050024), Tsinghua Üniversitesi Bahar Esintisi Fonu (20201080760), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (51805294), Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2018YFA0703004) ve 111 Projesi (B17026) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
References
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
