Summary
Burada sunulan protokol, sıvı kriyojende vitrifikasyondan önce en az 90 ms karıştırılan kendi kendine fitillenen nanotel ızgaraya iki ilgi örneği sunmak için yeni bir robotik sistem olan Spotiton'un kullanımını açıklamaktadır.
Abstract
İki veya daha fazla etkileşime giren parçacığın erken karşılaşması ile tetiklenen kısa ömürlü moleküler durumların yakalanması, kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) alanı için büyük ilgi çekici deneysel bir zorluk olmaya devam ediyor. Bu "zaman çözümlü" çalışmaları destekleyen birkaç metodolojik strateji geliştirilmiştir, bunlardan biri, Spotiton-a roman robotik sistemi- picoliter boyutlu örnek damlacıkların dağıtımını hassas zamansal ve mekansal kontrol ile birleştirir. Zaman çözümlenen Spotiton iş akışı, erken yapısal yeniden düzenlemelerini minimum örnek hacminden sorgulamak için benzersiz verimli bir yaklaşım sunar. Bağımsız olarak kontrol edilen piezoelektrik dağıtıcılardan ateşlendi, iki örnek indi ve kriyojene doğru dalarken nanotel EM ızgarasına hızla karıştı. Potansiyel olarak yüzlerce ızgara, bir numunenin sadece birkaç mikrolitresinden art arda hızlı bir şekilde hazırlanabilir. Burada, Spotiton sisteminin çalışmasının ayrıntılı bir adım adım protokolü, ızgara hazırlığı sırasında ortaya çıkan belirli sorunları gidermeye odaklanarak sunulmaktadır.
Introduction
Kriyo-EM'nin proteinlerin geçici uygun durumlarını saniye altı zaman ölçeğinde (zaman çözümlenmiş cryo-EM) yakalama ve ortaya çıkarma potansiyeli, Tekniği Kriyochet tarafından kriyo-EM ızgaraları hazırlamak için geliştirilen standart dalma dondurma yöntemi üzerine inşa edilen Berriman ve Unwin1 ile başlayan birkaç grup tarafındangerçekleştirilmiştir 2. Kriyojen kabının hemen üstüne, ince sulu bir tabakaya uygulanmış ve şişmiş ilk numuneyi içeren daralmış bir EM ızgarasına ikinci bir numunenin ince bir buğusunu püskürtmek için sıkıştırılmış azot gazı kullanan bir atomizer eklediler. Bu sistem 1 ms'ye kadar düşük karıştırma süreleri elde edebilse de, yine de ilk örneğin kullanıcı tarafından manuel olarak şişirilmesini talep etti-teknik olarak zorlu bir görev- ve ikinci örneğin nispeten yüksek bir hacmi. Ayrıca, pratikte, iki numunenin karıştırılmasının nerede gerçekleştiğini bilmek zordu, bu da ferritin nanopartiküllerinin karışık numunede fidüsiyal bir belirteç olarak kullanılmasını gerektiriyordu. Howard White ve iş arkadaşlarının sonraki çabaları, şişirme ve püskürtme adımlarının bilgisayar kontrolünü birleştirerek bu püskürtme karıştırma yaklaşımının kontrolünü ve tekrarlanabilirliğini geliştirdi3,4. Numunelerin ne kadar iyi ve nerede karıştığını ele almak için, aynı grup5 ve diğerleri6,7,8,9,10, iki numunenin şırınga pompalarının basıncı altında dar kılcal borularda veya azot gazı tarafından tahrik edilen mikrofabrik, mikroakışkan çiplerde karıştırıldığı bir karıştırma püskürtme yaklaşımı11'e geçmiştir. Bu premiksleme sistemleri sadece tam karıştırma sağlamakla kalmaz, aynı zamanda zaman çözülen çalışmaların çözünürlüğünü artırmak için karıştırma sürelerinin ince ayarlanmasını sağlar.
Spotiton sistemindeki EM ızgaralarına örnek uygulamak için alternatif bir yol olarak piezoelektrik dağıtıcıların tanıtılması, hem numune biriktirmenin hassas bir şekilde hedef alınmasını hem de bir ızgara yapmak için çok daha küçük bir numune hacminin gerekliliğinisağladı 12. Daha sonra, nanotel ızgaralarının ve yolda örnek uygulamanın ("anında" tespit edilmesi) kullanımı, bir şişkinlik adımı ihtiyacını ortadan kaldırdı ve uygulamadan vitrifikasyon sürelerine13,14. Burada açıklanan zaman çözümlü cryo-EM'ye yeni bir yaklaşım için, ilk15'inbirikmesinden hemen sonra hareketli bir nanotel ızgarasına ikinci bir numunenin teslim edilmesini sağlamak için Spotiton sistemine gerekli kontrol donanımı ve yazılım yükseltmeleri ile birlikte ikinci bir dağıtıcı eklendi. Üst üste binen iki örnek, nanoteller tarafından vitrifikasyondan önce ince bir sulu tabakaya kötü oldukları için ızgarada karışır. 90 ms'ye kadar düşük karıştırma süreleri elde edilebilir. Bu protokol, piezoelektrik dağıtım ve nanotel ızgaraları kullanılarak zaman çözümlenmiş deneylerin nasıl gerçekleştirileceği hakkında pratik bilgiler sağlamayı amaçlamaktadır. Ayrıca, donanım ve yazılım kullanım kolaylığı, tutarlılık ve aktarım hızını artırmak için değiştirildiğinden, bu protokol daha önce bildirilen yöntem15'ingüncel bir açıklaması olarak da hizmet eder.
Protocol
1. Spotiton makine ve yazılımını kurun
- Sistemi dağıtmaya hazırlayın (Şekil 1).
- Nitrojen besleme tankının ana vanasını açın. Sistem rezervuarı gazdan arındırılmış, ultra saf su ile doldurulduğundan emin olun. Bilgisayarı açın. Çok amaçlı güç pistinde Spotiton sistemini açın.
- Spotiton yazılımının kullanıcı arabirimini(UI)açmak için masaüstü simgesine ( Şekil 2A ) tıklayın( Şekil 2B). Araçlar menüsünde, 3 eksenli robotları (ızgara aşaması ve pipet aşaması) ve dönen dağıtıcı kafa tertibatını (teta aşaması) başlatmak ve ev sahipliği yapmak için Aşamaları Başlat'ı seçin. Dağıtıcı uçlarının başlatma ve takip etmeden önce aşağıyı işaret ettiğinden emin olun.
- Ana pencerede, robotları SafePosition'a göndermek için SafePosition'a git 'e tıklayın ( Şekil3).
NOT: SafePosition'a geçmek, çarpışma riski olmadan herhangi bir konumdaki robotlarla yapılabilir. - Aspirat sekmesinde, dağıtıcı kafalarını rezervuardan gelen suyla birden çok kez yıkamak için Prime'ı seçin. İki uçtan ortaya çıkan kesintisiz su akışları görülene kadar devam edin.
NOT: Uçlar son kapanmada metanol ile yıkandığında sıvı hatlarına önemli miktarda hava girdiyse bunun tekrarlanması gerekebilir.
- Dağıtıcı performansını denetleme
- İnceleme sekmesinde, suyu test etmek için her ipucunu muayene kamerasına gönderin ve iki dağıtıcıdan damlacık üretim desenini eşleştirin (Şekil S1).
NOT: Bir ipucu bir kabarcık (Şekil S2A) veya döküntü nedeniyle ateş edemezse, Aspirat sekmesinde erişilen Ultrasonik Yıkama işlevini kullanarak yıkama istasyonundaki ipuçlarını(Şekil S2B)temizleyin. - Tutarlı boyutta ayrı damlacık akışı elde etmek için her dağıtıcı ve numune için ateşleme genliğini (ünitersiz) ayarlayın.
- İki dağıtıcı tarafından eşdeğer damlacık üretimini görsel olarak onaylayın.
- tip 1 ateşleme videosunu kaydetmek için üst kamera monitöründeki Kaydet düğmesine basın. Tip 1'in sağ taraftaki monitörde ateş ettiği videoyu oynatın, aynı zamanda Tip 2 üst kamera monitöründe ateşlenir (Şekil S1).
NOT: Her bir uç ateşlemesinin videoları kaydedilir ve saklanır.
- tip 1 ateşleme videosunu kaydetmek için üst kamera monitöründeki Kaydet düğmesine basın. Tip 1'in sağ taraftaki monitörde ateş ettiği videoyu oynatın, aynı zamanda Tip 2 üst kamera monitöründe ateşlenir (Şekil S1).
- Dağıtıcılar artık bir ızgarada test ateş etmeye hazır.
NOT: Bu protokol, ızgara ve pipet aşamalarının ilgili dalma konumlarında doğru hizalanmasının doğrulandığını varsayar. Doğru hizalamanın onaylanmaması çarpışmaya, uçlara veya robotlara zarar verebilir.
- İnceleme sekmesinde, suyu test etmek için her ipucunu muayene kamerasına gönderin ve iki dağıtıcıdan damlacık üretim desenini eşleştirin (Şekil S1).
- Izgaradaki suyu test edin.
- Robotların SafePosition'da olduğundan emin olun.
- Birlikte verilen Allen anahtarını kullanarak ızgara robotundaki montajdan cımbızı çıkarın.
- Yakındaki bir tezgahta, bir test ızgarası, nanotel tarafı yukarı, ızgara bloğunun kenarına yerleştirin. Izgaranın kenarını dikkatlice tutun, cımbıza doğru şekilde yerleştirin (Şekil S3) ve cımbızları yeniden monte edin.
- Cryo sekmesinde, ipuçlarını üst dalma yolu kamerasının (üstkamera)görüş alanına taşımak için Kameraya İpucu'na tıklayın. Üst kamera monitöründe Live'ın seçili olduğundan ve üst kamera ışığının açık olduğundan emin olun (makine dolabının önünü arayın (Şekil 1).
- Cımbızları ızgara robotuna monte edin. Monitör içindeki fareyi tıklatarak üst kamera monitöründe görünen Konum İpucu 1.
NOT: Yalnızca İpucu 1 görünür olacak ve tıklamanın konumuna taşınacaktır. - Izgarayı üst kameranın önüne yerleştirmek için Izgaradan Kameraya'yı tıklatın. Gerekirse İpucu 1 konumunu önceki gibi ayarlayın.
- Test ateşiiçin bir veya her iki dağıtıcıyı seçmek için İpucu1 ,İpucu2 veya İpucu1 ve İpucu2'yi seçin.
NOT: Uçları tek tek test ederken, 1. Bu, iki uçtan sıvı şeritleri örtüşmeyen bir desende depolayacak ve kullanıcının her ipucunun ateşlediğini onaylamasına izin verecektir. - Cryo sekmesinde, Vitrify Grid'in seçili olmadığından emin olun, Sıra Hedefi'ne tıklayın, ardından Dalma 'yatıklayın.
NOT: Pipet aşaması hafifçe yükselecek ve ardından ızgara aşaması gelecektir. Izgara robotu daha sonra ızgarayı ateşleme dağıtıcılarının ve üst ve alt kameraların yanından geçirerek güvertenin hemen üzerinde dinlenmeye gelir. Kullanıcı arabiriminin sol tarafındaki alt kameradan bir görüntü yakalamanın üzerinde üst kameradan bir görüntü yakalama görünür. - Üst ve alt görüntüleri değerlendirin: Her uç seçildiğinde ateşlendi mi? Birlikte ateşlendiğinde, iki uçtan gelen sıvı tamamen üst üste binerek tek tek ateşlendiğinden belirgin şekilde daha kalın bir şerit oluşturdu mu?
- Uçlardan biri ateşlenemediyse, net ateşleme gözlenene kadar bir veya birden fazla ultrasonik yıkama döngüsü gerçekleştirin.
- Numune şeritleri tam olarak örtüşmezse, dağıtıcılardan birinin yan hizalamasını allen tuşu kullanarak ayarlayın ve dağıtıcılardan birinin yan ayar vidasını çeyrek dönüşte çevirin ve bir test dalışı gerçekleştirin. Şeritler tamamen örtünene kadar tekrarlayın.
NOT: Her iki ipucu da başarıyla ve beklendiği gibi ateşlenirse, sistem örnek ızgaraları hazırlamaya hazırdır.
2. İki örnekli, karışık ızgaralar hazırlayın
- İlgilenmenin karıştırma süresini elde etmek için Machine Parameters XML dosyasındaki ivme, yavaşlama ve hız değerlerini güncelleştirin.
NOT: Bu değerleri karıştırma süreleriyle ilişkilendiren tablolar daha önce15. - Numuneyi ve ızgaraları hazırlayın.
NOT: Protokolün bu noktasından itibaren ilk ızgara hazırlanmadan önce 20-30 dk geçecek ve numuneler bu zaman aralığında uygun bir sıcaklıkta tutulmalıdır.- İki numuneyi (protein ve ligand veya diğer etkileşim ortağı) uygun bir tamponla istenen konsantrasyonlara seyreltin, ideal olarak, her ikisi için de aynıdır.
NOT: Spotiton ızgaraları, otomatik dalma dondurucuları için kullanılandan 1,5-2 kat daha yüksek protein konsantrasyonları gerektirir. Bunun nedeni, proteinin bir dalma sırasında ızgara yüzeyinde ince sulu bir tabakada geçirdiği minimum zaman olabilir ve parçacıklara hava-su arayüzünde konsantre olma fırsatı daha az verir. - Kriyojen kabını sıvı nitrojenle doldurun.
- Plazma temiz 3-4 nanotel ızgara. Başlangıç noktası olarak 5 W, hidrojen ve oksijen, 1,5 dk kullanın.
NOT: En etkili plazma temizleme süresi ve tarifi, ortam sıcaklığına ve neme ve kullanılan nanotel ızgaralarının grubuna bağlı olarak günden güne değişebilir. Alternatif gaz karışımları veya bir kızdırma deşarjı da etkili olabilir, ancak bu amaç için test edilmemiştir. Tampon çözeltisindeki su ve protein genellikle nanoteller tarafından farklı hızlarda kötü olduğundan, o gün kullanılacak ızgaraların fitilini gerçek numunenin dağıtıldığı bir dalma üzerinde değerlendirmek en iyi uygulamadır.
- İki numuneyi (protein ve ligand veya diğer etkileşim ortağı) uygun bir tamponla istenen konsantrasyonlara seyreltin, ideal olarak, her ikisi için de aynıdır.
- Sistemdeki nem seviyesini ayarlayın.
NOT: Izgaraları hem yapmak hem de plazma temizlemek için kullanılan koşullara ek olarak, nem nanotel ızgaralarının fitilleme hızını etkileyen bir diğer birincil faktördür. Belirli bir seans için hedef yüzde nem her gün ve ızgara grubu için ampirik olarak belirlense de,% 90-95 iyi bir başlangıç noktasıdır.- Nebülizörün yeterince ultra saf suyla doldurulmasını sağlayın. Nebülizörü takın ve buharın nebülizör kapağındaki merkezi bağlantı noktasından çıkışını gözlemleyin.
- Ana penceredeki canlı nem monitörünü gözlemleyin veya Raporlar | altında ortam nem izleyicisini açın Ortam (Şekil S4). İki bölgede nem seviyelerini kontrol edin: Oda ve Kefen.
NOT: Oda Spotiton muhafazası içindeki tüm alanları içerir. Kefen, ızgara ve dağıtıcı uçlarının "kamerada" konumlarını hemen kapsayan alandır. Siyah reçine örtüsü, bir ızgara yüklemek için muhafaza kapıları açıldığında ayarlanan nem seviyesini korur. - Hedef nem değerlerine ulaşıldıktan sonra, bu değerleri Nem sekmesinden otomatik veya manuel olarak koruyun. Otomatik denetim'i seçin ve setpoint'i seçilen eşik sınırı içinde tutmak için bir setpoint ve eşik seçin. Alternatif olarak, Manuel kontrol'ü seçin ve iki fan kontrolünü kullanarak nem seviyesini ayarlayın: oda fanı ve kefen fanı.
NOT: Hazne fanını açmak buharı sol bağlantı noktasındaki bir filtreden çeker ve daha büyük su damlacıklarının odaya girmesini önleyerek ortam neminde daha fazla artış olmasını önler. Oda kapıları kapalı kaldığı sürece, nem seviyesi istenen yüzdede stabilize olacaktır. Kefen fanını açmak buharı sağ bağlantı noktasından kefene çeker. Bu hem odaya buhar salınımını azaltır hem de kefen içindeki nem seviyesini arttırır.
- Numuneyi dağıtıcılara yükleyin.
- Numune bardaklarına her numuneden 5 μL ekleyin.
NOT: Kabarcıkların tanıtılmasını önlemek için, hacmi kabın iç yan duvarına çok dikkatli bir şekilde dağıtın, ardından numuneyi kabın altına zorlamak için aşağı doğru sallayın. - Numune bardaklarını tutma tepsisine, soldaki tip 1 örneğini, sağdaki tip 2 için yükleyin. Tepsiyi oturana kadar makineye geri itin.
- Aspirat sekmesinde, her ipucu tarafından aspire edilecek ses seviyesi için 3 μL'yi seçin. Numune tepsisinin güvenli bir şekilde oturduğundan emin olun, ardından Aspirat'a tıklayın ve pipet aşamasının dağıtıcı kafalarını numune kapaklarına nasıl hareket ettirdiğini gözlemleyin.
- Numune kaplarını çıkararak ve sıvı seviyesinde bir düşüş gözlemleyerek her iki numunenin de başarılı bir şekilde aspirasyonunun doğrulanması.
- Denetle sekmesinde, engelsiz dağıtımı onaylamak için her ipucunu inceleme kamerasına gönderin. Her uçtan damlacık oluşumunu eşleştirmek için genliği gerektiği gibi ayarlayın (bkz. bölüm 1.2).
NOT: Protein örneğini dağıtan uç için genliklerin artırılması gerekecektir. - Sistem artık örnek bir ızgara hazırlamaya hazır.
- Numune bardaklarına her numuneden 5 μL ekleyin.
- Örnek ızgaraları dondurma
- Taze plazma temizlenmiş bir ızgarayı cımbıza yükleyin, ancak cımbızı henüz monte etmeyin. Nem seviyesinin yükseldiğine emin olun, ~90-95%. Etan kabını doldur.
- Her iki ucun da muayene kamerasının önünde son bir test ateşi gerçekleştirin ve hiçbir engelleme olmadığını onaylayın. Cryo sekmesinde, Kameraya ipucu 'natıklayın.
- Etan kabını doldur. Etan buz oluşursa, ek etan gazı ile gerektiği gibi eritin.
NOT: 2.5.4 ve 2.5.5 adımları, (i) odanın yüksek neminde nanotellerin doygunluğunu ve (ii) protein örneğini ateşleyen ucun tıkanma olasılığını en aza indirmek için nispeten hızlı bir şekilde (<20 s) tamamlanmalıdır. - Cımbızı ızgara ile ızgara aşamasına monte edin. Cryo sekmesinde, Izgaradan kameraya 'yatıklayın. İpucu 1'in üst kamera monitörüne doğru şekilde yer olduğundan emin olun (bkz. adımlar 1.3.4-1.3.5).
- Vitrify Grid, Queue Target'a tıklayın, sonra Dalın. Izgara robotuna ızgarayı etandan sıvı nitrojene atlaması ve su altında kalan rafa bırakması istendiğinde Tamam'ı tıklayın.
NOT: Cımbız daha sonra odaya geri yükselir. Sıvı nitrojene atladıktan sonra, ızgaranın cımbızdan düşüp düşmediğine soran bir istem görünür. Düşmediyse, Hayır'ı tıklatın ve cımbız ızgarayı ayırmak için birkaç kez açılıp kapanır. - Saklanması veya atılması gerekip gerekmeyeceğine karar vermek için ızgara görüntülerini inceleyin (Şekil S5).
- Izgarayı koruyorsanız, önceden soğutulmuş ızgara kutusuna aktarın. Alternatif olarak, sonraki ızgaraları tespit edin ve ardından her ızgaranın dinlenme alanındaki konumuna göre tanımlanabilmesine dikkat ederek tüm ızgaraları aynı anda ızgara kutusuna aktarın.
- Izgarayı bir ızgara kutusuna aktarmak için, ince uçlu ön uçlu ön uçlu tokmaklar, ızgarayı kenardan hafifçe kavrayın ve çentiğin sol ilk yuvasından başlayarak saat yönünde hareket eden bir ızgara kutusu yuvasına yerleştirin.
- Tüm ızgaralar yüklendiğinde, ızgara kutusu kapağını kapak aracına takın ve sıvı nitrojene ön soğutma. Kapağı ızgara kutusuna vidalayın ve bir kapak aleti veya önceden soğmuş bir tornavida ile sıkın.
- Kapalı ızgara kutusunu görüntüleme veya uzun süreli depolama için küçük bir savaş alanına hızlı bir şekilde aktarmak için büyük forseps kullanın.
- Aşağı akış EM görüntüleme için ızgara uygunluğunu değerlendirin.
- Bir ızgara saplandıktan hemen sonra kullanıcı arabiriminin sol tarafında görüntülenen üst ve alt dalma yolu kameralarındaki görüntüleri gözlemleyin. Fitilleme hızını, her iki ucun başarılı bir şekilde ateşlenmesini ve iki örnek şeridinin çakışma kapsamını değerlendirmek için bu görüntüleri kullanın.
- Deneme görüntüleyiciyi kullanarak dalma sırasında makine ayarları ve nem ölçümleri ile birlikte üst ve alt kameralardan gelen ızgara görüntülerini gözden geçirin ve karşılaştırın: Raporlar | Deney.
- Elektron mikroskopunda iyi fitilleme kanıtı gösteren görüntüleme için ızgaraları seçin.
Representative Results
Şekil 4, tek bir zaman çözümlü Spotiton seansı sırasında RNA polimeraz vevitrifikasyon15'den önce 150 ms'lik bir promotör dizisi taşıyan 105 bp DNA oligomer karıştırılarak hazırlanan ızgaraların görüntülerini göstermektedir. Şekilde görülen, örnek uygulamadan sonra iki zaman noktasında altı ızgaranın iki yüksek hızlı kamerası tarafından çekilen görüntülerdir. Dalma tarzı dondurucular arasında benzersiz olan bu kameralar, kullanıcının nanoteller tarafından gözlenen fitilleme boyutuna ve sıvı numunelerin EM görüntüleme için yeterince ince sulu bir katmana çekilme olasılığına bağlı olarak bir ızgarayı tutup tutmamaya veya atmaya hemen karar vermesini sağlar. Tek bir ızgara tam bir veri kümesi için yeterli buz sağlayabilse de, en uygun koşullar elde edildikten sonra, bir veya daha fazla kişinin kaybolması veya kirlenmesi durumunda elde tutmak için birkaç ızgara hazırlanır. Bu oturumda hazırlanan altı ızgaradan, görüntü yakalamaları sadece birini yetersiz fitilleme ile gösterir (Şekil 4F).
Gösterilen ızgaralar (2.5.1 ile 2.5.8 arasında adımlar) protokolde açıklandığı gibi örnekleri ve makineyi hazırlamak için bir saat sonra 40 dakikalık bir süre boyunca art arda hazırlandı (adım 1.1.1 ile 2.4.6). Altı ızgaradan ikisi veri toplama için kullanıldı ve geri kalanı gerekirse daha sonra analiz için kaydedildi. Vitrifiye bir ızgara üzerindeki buz deseni (Şekil 5C) üst kamera görüntüsünde görülen biriken sıvı deseni ile yakından eşleşir (Şekil 5B). Alt kamera görüntüsünde görünür bir sıvı şeridinin olmamasıyla belirgin hale gelen karışık örneklerin etkili bir şekilde fitillemesi (Şekil 5A), nanotel kaplı ızgara çubukları boyunca meydana gelir ve örnek nadiren indiği karelere taşar. Buz dolu kareler içinde, buz genellikle karenin merkezindeki delikler içinde en kalındır ve ızgara çubuklarına daha yakın deliklerde daha ince hale gelir (Şekil 5E). Genellikle ızgara çubuklarına hemen bitişik delikler nanotellere yakınlık nedeniyle boştur (Şekil 5F).
Şekil 1: Zaman çözümlenmiş Spotiton sistemi. 1. Operatörün iş istasyonu; 2. Çevre odası; 3. Azot kaynağı; 4. Etan tedariki 5. Üst dalma yolu kamerası için arka ışık kontrolü 6. Piezoelektrik dağıtıcı kontrolörleri; 7. Şırınd pompaları; 8. Vakum pompası; 9. Su kaynağını ve atık şişeleri yıkayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Spotiton yazılım kullanıcı arayüzü. (A) Masaüstü simgesi ve giriş ekranı. (B) Ana kullanıcı arabirimi altı alandan oluşur: 1. üst dalma yolu ("üst") ve uç inceleme kameraları için görüntüleme alanı; 2. alt dalma yolu ("alt") kamera için ekran alanı; 3. İpucu inceleme videoları için oynatma alanı; 4. Çok fonksiyonlu sekme alanı; 5. Canlı nem monitörü; 6. Canlı sistem günlük dosyası. Kısaltma: UI = kullanıcı arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Spotiton odasının iç görünümü (SafePosition'daki robotlar). 1. Izgara robotu (kırmızı); 2. Dağıtıcı robot (sarı); 3. Üst dalma yolu kamerası (pembe); 4. Alt dalma yolu kamerası (açık mavi); 5. Uç muayene kamerası (turuncu); 6. Nem örtüsü (yeşil); 7. örnek tepsi; 8. Nebülizör montajı (koyu mavi); 9. Sistem rezervuarı ve su hatları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Zaman çözümlenmiş bir Spotiton ızgara yapma oturumundan temsili sistem kamera görüntüleri. (A -F) Üst (sol) ve alt (sağ) spotiton kullanılarak RNA polimeraz ve bir promotör DNA dizisinin uygulandığı altı ızgaranın yol kamera görüntülerini daldırma yolu görüntüleri. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Spotiton tarafından hazırlanmış bir ızgarada buz biriktirme şekli. Şekil 4F'degösterilen ızgaranın (A) alt ve (B) üst kamera görüntülerinin ve (C) atlasının bölümleri. Numune birikimi ve karıştırmadan kaynaklanan yaklaşık buz yerleri renkli lavantadır. Karenin içinde sarı ok ucu ile işaretlenmiş alanlar (E-G)olarak resmedilir. (E) olarak gösterilen bölge sarı renkte(D)olarak kutulanmıştır. Temsili kare (E), delik (F) ve (G) içinde gösterilen ızgaradan toplanan pozlama görüntüleri (A-D). Kare ve delik görüntülerindeki kutulu alanlar sırasıyla delik ve pozlama görüntülerine karşılık gelir. Ölçek çubukları = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S1: Uç ateşlemesinin incelenmesi. Kullanıcı Arayüzü'nün solundaki üst kamera monitöründe Tip 2 ateşlemesinin canlı görüntüsü görülürken, tip 1 ateşlemesinin daha önce yapılmış bir kaydı, sağdaki video oynatma alanında karşılaştırma için bir döngüde oynatılır. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Şekil S2: Dağıtıcı uçlarının ultrasonik temizliği. (A)ucundaki bir hava kabarcığı damlacık oluşumunu bozacak ve uç ateşini önleyecektir. (B) Bir hava kabarcığını çıkarmak veya uç deliği engelleyen kurutulmuş proteini temizlemek için ultrasonik temizleme istasyonunda suya batırılmış ipuçları. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Şekil S3: Izgara cımbızla yükleniyor. (A) Izgara bloğunun kenarına nanotel tarafı yerleştirilmiş bir ızgara. (B) Kendiliğinden kapanan cımbızlara doğru yerleştirilmiş bir ızgara. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Şekil S4: Nem izleyicisi. Tipik bir ızgara yapma seansı sırasında kaydedildiği gibi haznedeki (koyu mavi) ve kefendeki (açık mavi) bağıl nem oranı. Izgara dalma süreleri (yeşil kareler) grafikte çizilir. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Şekil S5: Bir dalma sırasında nanotel ızgaralarında fitilleme. Temsili üst (A, C, E) ve alt (B, D, F) çok yavaş (A, B), ideal (C, D) ve çok hızlı (E, F) nanotel ızgaralarında fitilleme yol kamera görüntüleri dalma. Hafif kalınlaşma (beyaz ok uçları), numune tarafından doymuş nanotellerle ızgara çubuklarını gösterir. Bu bölgelerdeki kareler tipik olarak elektron mikroskobik görüntüleme için uygun kalınlıkta buz içerir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Lütfen bu dosyayı indirin.
Discussion
Bu protokol, Spotiton robotik sisteminin, genellikle bir ilgi proteini ve 90-500 ms karıştırılmış aktif bir ligand olmak üzere iki örnek taşıyan kriyo-EM görüntüleme için ızgara hazırlamak için kullanımını özetlemektedir. İş akışı basit olsa da, kullanıcının üretken bir kılavuz oluşturma oturumu sağlamak için akılda tutması gereken birkaç husus vardır. İlk olarak, piezoelektrik dağıtıcı uçlarından birinin tıkanması veya ateş etmesini engellemesi nadir değildir. Böyle bir arıza, üst veya alt kameradan görüntü çekimlerinde görülen ve her iki ipucu ateşlendikten sonra görülenden gözle görülür şekilde daha dar olan sıvı bir şeritle sonuçlanacaktır. Tıkanıklık, uçta bir hava kabarcığı konaklamasından, damlacık oluşumunu bozardan veya dar uç deliği kurutup kapatan protein örneğinden neden olabilir. Aspire edilmiş örnek işlemde kaybolmasına rağmen, her iki sorun da uçların ultrasonik bir şekilde yıkanması ve numunenin yeniden aspirasyonu ile çözülebilir. Sonraki tıkanıklığı ve numune atıklarını önlemek için, numune aspirasyonundan önce sıvı hatlarını iyice astarlamak (yıkamak) ve oda ve kefen içinde yüksek ve tutarlı bir nem seviyesini korumak çok önemlidir. Ek olarak, özellikle yüksek konsantrasyona sahip bir protein örneği, bakımlı neme rağmen uç ateşlemesini etkileyebilir. İnceleme sekmesindeki ateşleme genliği artırılması, yüksek protein konsantrasyonu nedeniyle zayıf ateşlemeyi kısmen telafi etse de, numunenin en az 1:2 seyreltmesi uç ateşlemesini iyileştirecek ve tıkanmasını önleyecektir.
İkincisi, hedeflenen karıştırma süresi için en uygun kalınlıkte buz üretmek için gereken ideal fitilleme hızına ulaşmak zor olabilir. Genellikle, daha hızlı karıştırma süreleri daha hızlı fitilleme gerektirir, daha yavaş karıştırma süreleri daha yavaş fitilleme gerektirir. İdeal olarak kötü ızgara için, üst kamera görüntüsünde sıvı bir şerit açıkça ayırt edilebilirken, alt kamerada, şeridin konumundaki ızgara çubuklarının sadece çok hafif bir kalınlaşma görünür kalır. Alt kamera görüntüsünde koyu bir şeritle gösterilen yavaş fitilleme, genellikle görüntüleme için çok kalın buz bırakır. Her iki görüntüde de bir şerit olmaması, deliklerde su bırakmamış olabilecek hızlı fitilleme gösterir (Şekil S5). Nanotel yoğunluğu, plazma temizleme ayarları ve süresi ve oda nemine maruz kalma süresi ve ayarlanan oda nemi gibi çeşitli faktörler fitilleme hızını etkileyebilir. Zayıf (yavaş) fitilleme, ızgaradaki nanotellerin seyrek kaplanması sonucu olabilir. Nanotel çözeltisine maruz kalma süresini biraz seyrelterek ve artırarak16, ızgara çubuklarındaki nanotellerin yoğunluğu ve kapsamı artacak ve daha hızlı fitillenmeyi kolaylaştıracaktır. Nanotel yoğunluğu yeterliyse, watt ayarını veya plazma temizleme süresini artırmak da fitillenmeyi artıracaktır. Burada önerilen ayarlar nispeten düşük güç ve uzun süredir, ancak gerekirse değiştirilebilir.
Bununla birlikte, hem belirli bir şebeke grubu hem de plazma temizleme ayarları önceki bir seansta iyi çalıştıysa, nanotellerin oda içindeki yüksek neme aşırı maruz kalmasından ve nemle doygunluğuna ve sıvı tutma kapasitesinin azalmasına yol açan yavaş fitilleme performansı ortaya çıkabilir. Oda neminin ızgara doygunluğu etkisi, cımbız montajı ile ızgaranın dalması arasındaki geçen süreyi en aza indirerek veya dalmadan önce sistem nem seviyesini azaltarak azaltılabilir. Bununla birlikte, ikincisinin protein örneği ile yüklenen ucun tıkanması riskini getirdiği belirtilmelidir. Bu riski dengelemek için, uçları yüksek nem seviyesinin korunduğu kefende tutmak, yeni bir ızgara tutan cımbız takmak için izin gereken süreyi artırabilir. Son olarak, azaltılmış bir dalma süresinin (ızgara ivmesi ve/ veya maksimum hızın artırılmasıyla elde edilir) ızgaranın fitil özelliklerini değiştirmeden daha ince buzla ızgaralara neden olabileceği belirtilmelidir. Bununla birlikte, iki numunenin karıştırma süresi de azaltılacağından, dalma süresi genellikle yavaş fitilleme için değiştirilen bir faktör değildir. Çok hızlı olan, ızgara deliklerinde çok ince veya bulunmayan buzla sonuçlanan fitillemeleri gidermek için, yukarıda özetlenen önlemlerin tersi alınabilir.
Spotiton, altsaniye zaman çözümlü çalışmalar için geliştirilen diğer tekniklerle karşılaştırıldığında belirli avantajlar ve dezavantajlar sunar. Karışık numune şeridi her dağıtıcıdan sadece 2-4 nL sıvı içerdiğinden, numune sınırlı olduğunda birçok ızgara-önemli bir avantaj hazırlamak için her numunenin tek bir 3 μL aliquot'u yeterlidir. Ek olarak, tamamen Spotiton17'yeözgü olmasa da entegre kameralar kullanılarak numune birikiminin gözlemlenmesi, diğer karıştırma cihazlarının bir özelliği değildir ve dalmış ızgaraların ham bir geçiş / başarısızlık değerlendirmesine tabi tutulmasına izin vererek tarama süresini büyük ölçüde azaltır. Sistemin en önemli dezavantajlarından biri, mekanik bileşenlerin fiziksel sınırlamaları ile kısıtlanan ve daha hızlı biyolojik reaksiyonların sorgulanılmasını ulaşılamaz duruma getiren minimum 90 ms karıştırma süresidir. Buna karşılık, mevcut mikroakışkan sistemlerde rutin olarak 10 ms'den daha az bir süre elde edilir. Spotiton tabanlı, ticari olarak kullanılabilen bukalemun sisteminde, tasarım ve inşaat iyileştirmeleri minimum dalma süresini 54 ms'ye düşürdü ve ikinci bir dağıtıcının eklenmesinin Spotiton'un şu anda sunabileceğinden daha hızlı karıştırma sürelerine izin verme olasılığını artırdı.
Bugüne kadar, Spotiton kullanarak erken, kısa ömürlü moleküler durumları araştırmak için 70S ribozom montajı, transmembran iyon kanalında kalsiyum tetiklenen konformasyonel değişiklikler ve GTP hidrolizi15'eyanıt olarak dinamin daralması dahil olmak üzere bir dizi deney yapılmıştır. Bu sonuçların yayınlanmasından bu yana, Spotiton ızgara oluşturma oturumlarının verimini, tekrarlanabilirliğini ve raporlamasını geliştirmek için sisteme çeşitli değişiklikler eklenmiştir. Bunlar arasında çift bölgeli, otomatik nem izleme ve kontrol sistemi, deney görüntüleyici özelliği, yan yana uç inceleme özelliği ve kullanıcı arabirimine birkaç küçük yükseltme bulunur. Yükseltilmiş sistem, daha önce bildirilenlere benzer gelecekteki iki örnek karıştırma deneylerini ve küçük moleküllü terapötik ile protein hedefi ve hatta antikor-antijen kompleksi oluşumu arasındaki gibi hızlı bağlayıcı tahlilleri daha iyi destekleyecektir. İki etkileşim ortağı içeren mevcut ve gelecekteki zaman çözümlenmiş deneyler kesinlikle devam edecek olsa da, üçüncü bir piezoelektrik dağıtıcı ve ilişkili donanımın eklenmesi olası deneylerin yelpazesini daha da genişletebilir. Örneğin, bir deterjanın ilk birikmesi ve ardından ilgi proteini, ardından etkileşime giren veya etkinleştirilen ligand, deterjana uzun süre maruz kalmanın potansiyel olumsuz etkilerini ortadan kaldırabilir, genellikle tercih edilen yönlendirme gibi yaygın yetersiz görüntüleme sonuçlarını önlemek için gereklidir. Spotiton, hem zaten yayınlanmış çalışmalar hem de gelecekteki potansiyel uygulamalar ışığında, kriyo-EM topluluğunun altsaniye zaman çözümlü çalışmaların yürütülmesini kolaylaştırmak için önemli bir aracı temsil ediyor.
Disclosures
B.C./C.S.P., Spotiton prototipini temel alan ticari bir enstrüman olan bukalemun üreten SPT Labtech şirketi ile ticari bir ilişkiye sahiptir.
Acknowledgments
Engineering Arts LLC'den (Arizona, ABD) Peter A. Kahn ve Terry Rohde'a Spotiton sisteminin ilk tasarımı ve daha sonra geliştirilmesi için teşekkür ederiz. Yardım ve teknik destek için New York Yapısal Biyoloji Merkezi'ndeki Simons Elektron Mikroskopi Merkezi personeline teşekkür ederiz. Burada sunulan çalışma, NIH (GM103310) ve Simons Vakfı'nın (SF349247) hibeleriyle desteklenen New York Yapısal Biyoloji Merkezi'nde bulunan Otomatik Moleküler Mikroskopi için Ulusal Kaynak'ta gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
References
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, Pt 6 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing "self-wicking" nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
