Summary
大腸菌 は、新生児グラム陰性細菌性髄膜炎の主な原因である。細菌感染の間、好中球によって産生される活性酸素種は主要な殺菌的役割を果たす。ここでは、大 腸菌の髄膜炎に応答して好中球中の活性酸素種を検出する方法を紹介する。
Abstract
大腸菌 (大腸菌)は、新生児髄膜炎を引き起こす最も一般的なグラム陰性細菌である。血液脳関門を通る菌血症の発生と細菌の浸透は、 大腸菌 髄膜炎の発症に不可欠なステップである。活性酸素種(ROS)は、侵入した病原体を破壊する好中球の主要な殺菌機構を表す。このプロトコルでは、髄血性 大腸菌 に感染した好中球における時間依存性細胞内ROS産生を、リアルタイム蛍光マイクロプレートリーダーによって検出された蛍光ROSプローブを用いて定量した。この方法は、病原体と宿主の相互作用の間の哺乳動物細胞におけるROS産生の評価にも適用され得る。
Introduction
新生児細菌性髄膜炎は一般的な小児感染症である。K1カプセルを有する大腸菌(大腸菌)は、新生児細菌性髄膜炎を引き起こす最も一般的なグラム陰性病原体であり、全発生率1、2、3の約80%を占める。抗菌化学療法と支持ケアの進歩にもかかわらず、細菌性髄膜炎は依然として罹患率と死亡率が高い最も壊滅的な状態の1つである4.
新生児細菌性髄膜炎の発生は、通常、新生児の局所病変から末梢循環への病原性細菌の侵入によって引き起こされる細菌血症から始まり、続いて血液脳関門(BBB)を通して脳に浸透し、髄膜4の炎症をもたらす。菌血症の発症は、好中球やマクロファージ等を含む細菌と宿主免疫細胞との相互作用に依存する。白血球の50~70%を占める好中球は、細菌感染に対する防御の第1線である5,6である。細菌の侵入の間、活性化された好中球は、感染部位にリクルートされ、超酸化物アニオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、および一重酸素7を含む活性酸素種(ROS)を放出する。ROSは、細胞膜、核酸分子および細菌のタンパク質との酸化還元反応を受け、侵入菌8の傷害および死をもたらす。ミトコンドリアは、真核細胞におけるROS産生の主な部位であり、各種オキシダーゼ(例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)オキシダーゼ複合体、リポキシゲナーゼ系、プロテインキナーゼCおよびシクロオキシゲナーゼ系)の産生を仲介する。好中球における主要な抗菌機構を表すROSの生産のリアルタイム測定は、細菌と宿主の相互作用の間に宿主防御を研究するための有用な方法である。
このプロトコルでは、髄空大腸菌 に感染した好中球における時間依存的ROS産生を、蛍光ROSプローブDHEで定量し、リアルタイム蛍光マイクロプレートリーダーによって検出した。この方法は、病原体と宿主の相互作用の間に他の哺乳動物細胞におけるROS産生の評価にも適用され得る。
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Protocol
本研究で適用されたボランティアからの末梢血は、中国医科大学第一病院の機関審査委員会(#2020-2020-237-2)によって承認された。
試薬・培養液の調製
- NH4Clの8.29 g、KHCO3の1g、Na2 EDTAの37.2 mgを1Lの二重蒸留水に加えて赤血球のリシスバッファーを準備し、pHを7.2-7.4に調整します。0.22 μmフィルターを用いて濾過して細菌を除去します。
- RPMI 1640培地に5%のウシ胎児血清を加えて好中球用の実験培地を調製し、4°Cで保存します。 使用前に室温に平衡化する。
注:フェノールレッドなしでRPMI 1640培地を使用してください。 - リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)をNaClの8g、KClの0.2g、Na2 HPO4·2H2Oの1.44g、KH2PO4の0.2gを1Lガラスフラスコ中の二重蒸留水の1Lに調製する。pHを7.2~7.4に調整します。121°Cで15分間オートクレーブします。
- 0.5gのリバンピシン粉末をジメチルスルホキシド(DMSO)の10 mLに溶解してリバンピシン溶液を調製し、50mg/mLリフェンピシン溶液を得る。
- NAClの10g、トリプトン10g、酵母エキス5g、寒天粉末15gを1Lの二重蒸留水に加えてLB寒天溶液を調製し、混合物をオートクレーブします。100 μg/mL リファンピシンを含む温かいLB寒天溶液を注ぎ、ペトリ皿を半分のボリュームに充填します。冷却した固体プレートを4°Cに保存します。
- BHI粉末の37gを1Lの二重蒸留水に溶解することにより、細菌株に適した脳心注入(BHI)ブロスを調製する。pHを7.2に調整し、オートクレーブします。
- 蛍光プローブジヒドロエチジウム(DHE)をDMSO溶媒に溶解し、10mMストック溶液を得る。使用前に軽く混ぜます。
注:アリクォートは、すぐに防光バイアルにストックソリューション。ストック液の貯蔵寿命は-20°Cで6ヶ月です。
2. E44菌株の調製
注:E44はリフィンピシン耐性を有する髄膜炎大腸菌 の変異株である。
- 凍結保存されたE44コロニーを無菌ピペットチップで浸し、線を引くことによって100μg/mLリフェンピシンを含むLB寒天プレートにE44株を接種する。一晩で37°Cでインキュベーターにプレートを逆さまに置きます。
- 実験の1日前に、滅菌ピペットチップを備えたプレートからE44コロニーを1つ選び、50mLフラスコに100μg/mLリバンピシンを含むBHIブロスの5mLに入れます。培養シェーカーで細菌培養を37°Cで90rpmで17時間培養します。
3. ヒト末梢血からの好中球の分離
- 抗凝固のためEDTAを含む真空採血管に静脈内にボランティアから血液サンプルの5 mLを引き出す。
- 500 x g で末梢血サンプルを 5 分間遠心分離します。血液サンプルは遠心分離によって3層に分けられ、下から上に赤血球(RBC)層、白血球(WBC)層および血漿層を順次に分ける。
- 3倍RBCリシスバッファーを持つ新しいチューブにピペットを用いた白血球層を吸引する。混合物を十分にブレンドし、室温で5分間置きます。
- 500 x g でチューブを 5 分間遠心分離します。上清を完全に吸引し、廃棄する。
- 沈殿が白くなるまで、RBCライシスバッファーを1〜2回、リシス手順を繰り返します。
- 2 mLのPBSで沈殿を再懸濁して細胞を洗浄する。その後、細胞がチューブの底に落ち着くように5分間300 x g で遠心分離機。
- 50 μLのあらかじめ冷却された磁気細胞選別バッファーで堆積物を再懸濁して、CD16 マイクロビーズで好中球にラベルを付けます。その後、50 μLのヒトCD16マイクロビーズを十分に混ぜます。4°Cで30分間インキュベートします。
注: 細胞表面の抗体のキャッピングや非特異的標識を防ぐために、ソリューションを事前冷却する必要があります。ほとんどの成人は、血液1マイクロリットル当たり約4,000〜10,000個の白血球を有し、その中で好中球は約50〜70%を占める。推定すると、ヒト末梢血の5mLにおける全白血球の数は、通常、2-5 x 107までである。 - 4°Cで2mLの磁気細胞選別バッファーと遠心分離機を加え、300xgで10分間洗浄します。上清を完全に捨てて、500 μLの仕分けバッファーで沈殿を再中断します。
- 磁気カラムと分離棚を組み立てます。磁気カラムを持つシェルフにセパレータを移動し、3 mLのソートバッファでカラムをすすいでください。
- 細胞懸濁液をカラムにドロップして、磁気ビーズによって標識された好中球が磁気カラムに付着できるようにします。
- 3 mLの磁気セル選別バッファーを3回加えて非標識セルを洗い流し、カラムリザーバーが毎回空であることを確認します。
- 磁気セパレータからカラムを取り外し、15 mLチューブに置きます。5 mLの磁気セルソートバッファをカラムに追加します。プランジャーを使用して磁気標識されたセルを押し出します。
注:好中球の純度を向上させるために、新しい列を使用してソート手順を繰り返し行います。 - チューブを5分間300xgで遠心分離し、上清を完全に捨て、1mLの培養培地で沈殿を再懸濁する。セルカウンターでセル数を決定し、さらなる実験のために細胞を準備します。
4. ROSの測定
- 分離された好中球を5分間300xgで遠心分離し、沈殿を再懸濁し、5μM DHE蛍光プローブを含む培養培地で細胞濃度を2 x106/mLに調整した。
- DHEプローブをロードするために37°Cで好中球を30分間インキュベートし、細胞懸濁液をウェルあたり200 μLの96ウェルブラックポリスチレンマイクロプレートに割り当てます。
- マイクロプレートリーダーの電源を入れ、検出ソフトウェアを開きます。不透明な96ウェルプレートフォーマットを選択し、読み取り領域を決定します。
- キネティックモードで蛍光(Ex/Em = 518/605 nm)を60分毎に37°Cで設定します。 各読書の前に3 sのプレートを振るようにしてください。
- インキュベーターからマイクロプレートを取り出し、培養E44(MOI=100)またはファルボル12-ミリ状態13-アセテート(PMA)(100ng/mL)を3複製でプリロードされた好中球を含む各ウェルに加える。PMA を正のコントロールとして使用します。
- プレートをマイクロプレートリーダーに入れ、すぐにアッセイを開始します。
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Representative Results
この記事で概説したプロトコルを用いて、好中球はヒト末梢血から単離され、蛍光プローブDHEを搭載し、E44感染に応答してROSレベルの変化を検出した。ここでは、マイクロプレートリーダーによって決定されたE44株によって誘発されるROS生産をリアルタイムで示す代表的なデータを提供する。100のMOIでE44株を加えることによって、ROSレベルは直ちに増加し、時間依存的な方法で連続的な上昇傾向を示した(図1)。好中球における細胞内ROSの有名なROS誘導体であるPMAを加えることによって、初期段階で平坦な曲線を示し、その後20分から40分に有意に増加し、最終的に60分でピークを迎えるS字曲線を観察した(図1)。
図 1.髄膜炎大腸菌に感染した好中球における時間依存的ROS産生.ヒト末梢血から分離した好中球はDHE色素を装填し、E44株(MOI=100)を添加し、マイクロプレートリーダーで即座に蛍光強度(MFI)の平均値を決定した。PMA(100 ng/mL)で処理した好中球を陽性対照として用いた。すべてのデータを初期値に正規化して相対DHE強度を取得し、SEM±平均として提示した(n=3)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
好中球は、ヒト血液循環における白血球の最も豊富な成分として機能する。それらは、病原体11の侵入に対する防御の第一線を構築する先天的なヒト免疫系における重要なエフェクター細胞である。ROSの生成は、食作用11に続く好中球の主要な殺菌機構の1つを表す。最近の研究では、好中球細胞外トラップ(NET)と呼ばれる好中球によって放出されるネット状の構造が、細菌の殺滅プロセス6、11、12にも関与することが示されている。
病原性微生物の刺激によって誘導される好中球によって産生されるROSは、主に2つの膜結合サブユニット(gp91 phoxおよびp22phox)と3つの細胞質サブユニット(p47phox、p67 phox、およびp40phox)からなるNADPHオキシダーゼの活性化によって引き起こされると報告されている。巻き込まれた細菌は、タンパク質キナーゼC(PKC)、プロテインキナーゼA(PKA)、マイトゲン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)などの好中球内の一連のキナーゼを活性化し、NADPHオキシダーゼの細胞質サブユニットp47フォックスをリン酸化する。次に、p47 phox、p67phox、およびp40phoxからなる細胞体三量体を膜に転写し、膜結合サブユニットgp91phoxおよびp22phoxと結合し、完全なNADPHオキシダーゼ複合体を形成する。組み立てられたNADPHオキシダーゼ複合体は、NADPH由来電子を分子O2に移し、スーパーオキシド陰イオンを生成し、殺菌機能13、14、15を活性化する。また、好中球によって産生されるROSは、好中球16,17のNET形成にも関連している可能性があると報告されている。したがって、ROS産生の検出は、好中球の殺菌機構のさらなる研究に寄与するであろう。
このプロトコルでは、末梢血から分離された好中球は、蛍光プローブDHEでプリロードされ、96ウェル黒いポリスチレンマイクロプレートに割り当てられる。ROSの強度は、髄膜炎性大腸菌 が添加された後、リアルタイムでマイクロプレートリーダーによって検出されます。
採取した血液は、EDTAまたはクエン酸塩を使用して抗凝固し、補体18による好中球の活性化を回避する。好中球は末端分化され、循環血液中に短い寿命(約4〜8時間)を有するので、隔離ステップは、採血19の後にできるだけ早く行われるべきである。フィコール・ハイパクやパーコールのような多くの分離試薬は末梢血11、19、20から好中球を単離するために使用されてきた。このプロトコルでは、好中球は、末梢血からの赤血球溶離後のCD16マイクロビーズ選択によって単離される。それは速度、簡易性および純度の重要な改善を提供する。より純粋な好中球を得るために、CD16磁気ビーズで分離する前に密度勾配遠心分離を適用することができた。
ジヒドロエチジウム(DHE)、2'、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(H2DCF-DA)およびジヒドロロヒダミン123(DHR)など、認識された多数の蛍光プローブを、細胞膜を自由に通過し、細胞内ROSの定量に使用することができます。マイクロプレートリーダーを用いたDHE蛍光プローブの検出に加えて、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡を用いて、示された時点でのDHEの蛍光強度の変化を検出して、好中球におけるROS産生を測定することもできる。
このプロトコルは、ROS産生をリアルタイムで検出するためのより簡単な方法を提供し、病原性微生物に感染した宿主哺乳類細胞におけるROS生成を検出するために様々なシナリオで使用することができる。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益やその他の利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(31670845、31870832、32000811)と遼寧省特別教授プログラム(LJH2018-35)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S.
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J.
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S.
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
