Kvantifiering i realtid av reaktiva syrearter i neutrofiler infekterade med meningitisk escherichia coli

Summary

Escherichia coli är den främsta orsaken till neonatal gramnegativ bakteriell hjärnhinneinflammation. Under bakterieinfektionen spelar reaktiva syrearter som produceras av neutrofiler en viktig bakteriedödande roll. Här introducerar vi en metod för att upptäcka de reaktiva syrearterna i neutrofiler som svar på hjärnhinneinflammation E. coli.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) är de vanligaste gramnegativa bakterierna som orsakar neonatal hjärnhinneinflammation. Förekomsten av bakteriemi och bakteriell penetration genom blod - hjärnbarriären är oumbärliga steg för utvecklingen av E. coli hjärnhinneinflammation. Reaktiva syrearter (ROS) representerar de viktigaste bakteriedödande mekanismerna hos neutrofiler för att förstöra de invaderade patogenerna. I detta protokoll kvantifierades den tidsberoende intracellulära ROS-produktionen i neutrofiler infekterade med meningitic E. coli med fluorescerande ROS sonder upptäckt av en realtid fluorescens microplate läsare. Denna metod kan också tillämpas vid bedömning av produktion av försäljning i däggdjursceller under interaktioner mellan patogen och värd.

Introduction

Neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation är en vanlig pediatrisk infektionssjukdom. Escherichia coli (E. coli) med en K1-kapsel är den vanligaste gramnegativa patogenen som orsakar neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation, som står för cirka 80% av den totala^{incidensen 1,2,3}. Trots framstegen inom antimikrobiell kemoterapi och stödjande vård är bakteriell hjärnhinneinflammation fortfarande ett av de mest förödande tillstånden med hög sjuklighet och^{dödlighet 4}.

Förekomsten av neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation börjar vanligtvis med bakteriemi orsakad av inträdet av patogena bakterier i perifera cirkulationen från de nyföddas lokala skador, följt av penetration genom blod - hjärnbarriären (BBB) i hjärnan, vilket resulterar i inflammation i hjärnhinnorna⁴. Uppkomsten av bakteriemi beror på interaktionen mellan bakterier och värd immunceller inklusive neutrofiler och makrofager, etc. Neutrofiler, som står för ~ 50-70% av vita blodkroppar, är den första försvarslinjen mot bakteriella infektioner^5,6. Under invasionen av bakterier rekryteras de aktiverade neutrofilerna till de smittsamma platserna och släpper ut reaktiva syrearter (ROS) inklusive superoxidanjon, väteperoxid, hydroxylradikaler och singlet syre⁷. ROS genomgår redoxreaktioner med bakteriernas cellmembran, nukleinsyramolekyler och proteiner, vilket resulterar i skador och död hos de invaderande bakterierna⁸. Mitokondrierna är huvudplatsen för ROS-produktion i eukaryota celler och olika oxidaser (t.ex. nikotinamid adenin dinukleotidfosfat (NADPH) oxidaskomplex, lipoxygenassystem, proteinkinas C och cyklooxygenassystem) förmedlar produktionen av ROS^9,10. Realtidsmätningen av produktionen av ROS, som representerar den primära antimikrobiella mekanismen i neutrofiler, är en användbar metod för att studera värdförsvar under bakterie-värdinteraktionen.

I detta protokoll kvantifierades den tidsberoende ROS-produktionen i neutrofiler infekterade med meningitic E. coli med en fluorescerande ROS sond DHE, upptäckt av en realtid fluorescens microplate läsare. Denna metod kan också tillämpas vid bedömningen av produktionen av försäljning i andra däggdjursceller under interaktionen mellan patogen och värd.

Protocol

Perifert blod från frivilliga som tillämpades i denna forskning godkändes av Institutional Review Board vid det första sjukhuset vid China Medical University (#2020-2020-237-2).

1. Beredning av reagenser och odlingsmedium

1. Förbered lysbufferten för röda blodkroppar genom att tillsätta 8, 29 g NH₄Cl, 1 g KHCO_3,37,2 mg Na₂EDTA i 1 L dubbeldestillerat vatten och justera pH-värdevärdet till 7, 2-7,4. Avlägsna bakterierna genom filtrering med 0,22 μm filter.
2. Förbered experimentellt odlingsmedium för neutrofiler genom att tillsätta 5% fetala nötkreatursserum till RPMI 1640 medium och lagra vid 4 °C. Jämvikt till rumstemperatur före användning.
   OBS: Använd RPMI 1640 medium utan fenolrött.
3. Bered fosfatbuffertens saltlösning (PBS) genom att tillsätta 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄·2H₂O och 0,2 g KH₂PO₄ till 1 L dubbeldestillerat vatten i en 1 L glaskolv. Justera pH-7,2-7,4. Autoklav den i 15 min vid 121 °C.
4. Bered rifampicinlösning genom att lösa upp 0,5 g rifampicinpulver i 10 ml dimetylsulfoxid (DMSO) för att ge en 50 mg/mL rifampicinlösning.
5. Förbered LB agarlösning genom att tillsätta 10 g NaCl, 10 g tryptone, 5 g jästextrakt och 15 g agarpulver i 1 L dubbeldestillerat vatten och autoklavera blandningen. Fyll Petri-disken till hälften av volymen genom att hälla varm LB agarlösning som innehåller 100 μg/mL rifampicin. Förvara den kylda fasta plattan vid 4 °C.
6. Förbered hjärnans hjärtinfusion (BHI) buljong lämplig för bakteriestammar genom att lösa upp 37 g BHI-pulver i 1 L dubbeldestillerat vatten. Justera pH-skatet till 7,2 och autoklavera det.
7. Lös upp fluorescerande sonddihydroethidium (DHE) i DMSO lösningsmedel för att ge en 10 mM stamlösning. Blanda försiktigt före användning.
   OBS: Aliquot stamlösningen omedelbart i ljussäkra injektionsflaskar. Hållbarheten för lagerlösningen är 6 månader vid -20 °C.

2. Beredning av E44 bakteriestam

OBS: E44 är en mutant stam av meningitic E. coli med rifampicin resistens.

1. Doppa den kryopreserverade E44-kolonin med en steril pipettspets, inokulera E44-stammen på LB-agarplattan som innehåller 100 μg/ml rifampicin genom att dra linjer. Lägg plattan upp och ner i inkubatorn vid 37 °C över natten.
2. En dag före försöket, välj en E44-koloni från plattan med en steril pipettspets och lägg den i 5 ml BHI-buljong som innehåller 100 μg/mL rifampicin i en 50 ml kolv. Inkubera bakteriekulturen vid 37 °C med 90 varv/min i 17 timmar i en inkubationsskakapparat.

3. Isolering av neutrofiler från humant perifert blod

1. Dra 5 ml blodprov från frivilliga intravenöst till vakuumbloduppsamlingsröret som innehåller EDTA för antikoagulation.
2. Centrifugera de perifera blodproverna vid 500 x g i 5 min. Blodproverna är indelade i tre lager efter centrifugation, som från botten till toppen är det röda blodcellsskiktet (RBC), det vita blodcellsskiktet (WBC) och plasmaskiktet, sekventiellt.
3. Aspirera det vita blodcellsskiktet med en pipet till ett nytt rör med 3x RBC lysbuffert. Blanda blandningen noggrant och placera vid rumstemperatur i 5 min.
4. Centrifugera röret vid 500 x g i 5 min. Aspirera supernaten helt och kassera.
   1. Upprepa lysproceduren med RBC lysisbuffert 1-2 gånger tills fällningen blir vit.
5. Tvätta cellerna genom att återanvända fällningen med 2 ml PBS. Centrifugera sedan vid 300 x g i 5 minuter för att låta cellerna sätta sig ner till botten av röret.
6. Märk neutrofilerna med CD16-mikrober genom att återanvända sedimentet med 50 μL förkyld magnetisk cellsorteringsbuffert. Blanda sedan med 50 μL mänskliga CD16-mikrober noggrant. Inkubera blandningen vid 4 °C i 30 min.
   OBS: Lösningar bör förkylas för att förhindra kapning av antikroppar på cellytan och icke-specifik märkning. De flesta vuxna har cirka 4 000 till 10 000 vita blodkroppar per mikroliter blod, varav neutrofiler står för cirka 50-70%. Enligt uppskattning är antalet totala vita blodkroppar i 5 ml humant perifert blod vanligtvis upp till 2-5 x 10⁷.
7. Tvätta cellerna genom att tillsätta 2 ml magnetisk cellsorteringsbuffert och centrifug vid 4 °C, 300 x g i 10 min. Kassera supernatanten helt och återanvänd fällningen med 500 μL sorteringsbuffert.
8. Montera magnetkolonnen och separera hyllan. Flytta avgränsaren till hyllan med magnetkolonnen och skölj kolonnen med 3 ml sorteringsbuffert.
9. Släpp cellupphängningen i kolonnen så att de neutrofiler som är märkta av de magnetiska pärlorna kan fästas på magnetkolonnen.
10. Tvätta av de icke-märkta cellerna genom att lägga till 3 ml magnetisk cellsorteringsbuffert 3 gånger och se till att kolumnbehållaren är tom varje gång.
11. Ta bort kolonnen från magnetavskiljaren och sätt den på ett 15 ml-rör. Lägg till 5 ml magnetisk cellsorteringsbuffert i kolumnen. Tryck ut de magnetiskt märkta cellerna med en kolv.
    OBS: För att förbättra neutrofilornas renhet kan sorteringsstegen upprepas med hjälp av en ny kolumn.
12. Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min, kassera supernatanten helt och återanvänd fällningen med 1 ml odlingsmedium. Bestäm cellnumret med en cellräknare och förbered cellerna för ytterligare experiment.

4. Mätning av avkastning på försäljning

1. Centrifugera de isolerade neutrofilerna vid 300 x g i 5 min, återanvänd utfällningen och justera cellkoncentrationen till 2 x 10⁶/mL med odlingsmedium som innehåller 5 μM DHE fluorescenssond.
2. Inkubera neutrofilerna vid 37 °C i 30 minuter för att ladda DHE-sonden och fördela sedan cellfjädringen till en 96-brunns svart polystyrenmikroplatta med 200 μL per brunn.
3. Slå på mikroplåtläsaren och öppna detekteringsprogrammet. Välj ogenomskinligt 96-brunnsplåtformat och bestäm läsområdet.
   1. Ställ fluorescensen (Ex/Em = 518/605 nm) i kinetiskt läge var 5:e minut i 60 min vid 37 °C. Se till att skaka plattan i 3 s före varje avläsning.
4. Ta ut mikroplattan från inkubatorn, tillsätt den odlade E44 (MOI=100) eller phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) (100 ng/mL) till varje brunn som innehåller förinstallerade neutrofiler med 3 replikat. Använd PMA som en positiv kontroll.
5. Placera plattan i mikroplattans läsare och starta analysen omedelbart.

Representative Results

Med hjälp av protokollet som beskrivs i denna artikel isolerades neutrofiler från humant perifert blod och laddades med fluorescens sond DHE för att upptäcka förändringar av ROS nivåer som svar på E44 infektion. Här tillhandahåller vi representativa data som visar den ROS-produktion som framkallas av E44-stammen som bestäms av en mikroplåtläsare i realtid. Genom att lägga till E44-stammar till en moi på 100, ökade ROS-nivåerna omedelbart och visade en kontinuerlig uppåtgående trend med ett tidsberoende sätt (figur 1). Genom att lägga till PMA, en välkänd ROS-inducerare av intracellulär ROS i neutrofiler, observerade vi en S-formad kurva som presenterar en platt kurva i det inledande skedet följt av en betydande ökning från 20 min till 40 min och slutligen når en topp på 60 min (Figur 1).

Figur 1. Tidsberoende ROS-produktion i neutrofiler infekterade med meningitic E. coli. Neutrophils isolerade från humant perifert blod laddades med DHE färgämne, en E44 stam (MOI=100) lades till och den genomsnittliga fluorescens intensitet (MFI) fastställdes omedelbart med en microplate läsare. Neutrofiler som behandlats med PMA (100 ng/mL) användes som en positiv kontroll. Alla data normaliserades till det ursprungliga värdet för att erhålla den relativa DHE-intensiteten och presenterades som ± SEM (n = 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Neutrofiler fungerar som den vanligaste komponenten i vita blodkroppar i människans blodcirkulation. De är viktiga effektorceller i det medfödda mänskliga immunsystemet, som bygger den första försvarslinjen mot invasionen av patogener¹¹. Generationen av ROS representerar en av de viktigaste bakteriedödande mekanismerna för neutrofiler efter faagocytos¹¹. Nyligen genomförda studier har visat att en nätliknande struktur som frigörs av en neutrofil som kallas neutrofil extracellulär fälla (NET) också är involverad i bakteriedödande^{process 6,11,12}.

Det har rapporterats att AVKASTNING som produceras av neutrofiler som induceras av stimulering av patogena mikroorganismer främst orsakas av aktivering av NADPH oxidas, som består av två membranbindande underenheter (gp91^phox och p22^phox) och tre cytosoliska underenheter (p47^phox,p67^phoxoch p40^phox)⁵. De uppslukade bakterierna aktiverar en serie kinaser inuti neutrofiler, såsom proteinkinas C (PKC), proteinkinas A (PKA) och mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPK), som fosforylerar de cytosoliska underenheterna p47^fosox av NADPH-oxidas. Sedan flyttar en cytosolisk trimer bestående av p47^phox, p67^phox, och p40^phox till membranet för att kombinera med membranets bindningsunderenhet gp91^phox och p22^phox, som bildar hela NADPH-oxidaskomplexet. Det monterade NADPH-oxidaskomplexet överför NADPH-härledda elektroner till molekylära O_2,genererar superoxidanjoner och aktiverar bakteriedödande funktioner^13,14,15. Det rapporteras också att ROS som produceras av neutrofiler också kan associeras med NET bildandet av neutrofiler^16,17. Påvisande av produktion av försäljning skulle därför bidra till ytterligare studier av den bakteriedödande mekanismen för neutrofiler.

I detta protokoll är neutrophils isolerade från perifert blod förinstallerade med fluorescens sond DHE och tilldelas en 96-brunn svart polystyren mikroplatta. ROS-intensiteten detekteras av en mikroplatta läsare i realtid efter meningitic Escherichia coli tillsätts.

Det insamlade blodet är antikoagulerat med EDTA eller citrat för att undvika aktivering av neutrofiler med komplement¹⁸. Eftersom neutrofiler är terminalt differentierade och har en kort livslängd (ca 4-8 timmar) i det cirkulerande blodet, bör isoleringsstegen göras så snart som möjligt efter^{blodinsamling 19}. Många isolerande reagenser, såsom Ficoll-Hypaque och Percoll, har använts för att isolera neutrofiler från perifert blod^11,19,20. I detta protokoll isoleras neutrofiler genom CD16 mikrober urval efter erytrocyt lysis från perifert blod. Det erbjuder betydande förbättringar i hastighet, enkelhet och renhet. För att erhålla renare neutrofiler kan en densitetsgradientcentrifugation appliceras före isoleringen med CD16 magnetiska pärlor.

Ett antal erkända fluorescerande sonder, såsom dihydroethidium (DHE), 2', 7'-diklordihydrofluoresceindiaktat (H₂DCF-DA) och dihydrorhodamin 123 (DHR) som passerar genom cellmembranet fritt, kan användas för bestämning av intracellulär ROS genom flödescytometri, konfokal mikroskopi eller mikroplatta^{läsare 21,22,23,24}. Förutom detektion av DHE fluorescens sond med microplate läsare, flöde cytometri och confocal mikroskopi kan också användas för att upptäcka förändringar av fluorescens intensitet av DHE vid de angivna tidpunkterna för att mäta ROS produktion i neutrofiler.

Detta protokoll ger ett enklare sätt att upptäcka ROS-produktion i realtid och kan användas i en mängd olika scenarier för att upptäcka ROS-generationen i värd däggdjursceller infekterade med patogena mikroorganismer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes	KIRGEN	KG2611
96-well plate	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Autuomated cell counter	Bio-rad	508BR03397
Biological Safety Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion	BD	237500
CD16 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-701
Centrifuge	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Fetal bovine serum	Cellmax	SA211.02
Incubator	Heraeus	Hera Cell
MACS separation buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Thermostatic shaker	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Yeast extract	OXOID	LP0021