Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التحديد الكمي في الوقت الحقيقي لأنواع الأكسجين التفاعلية في العدلات المصابة بالإشريشيا القولونية السحايا

Published: April 20, 2021 doi: 10.3791/62314
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Developmental Cell Biology, Key Laboratory of Cell Biology, Ministry of Public Health, and Key Laboratory of Medical Cell Biology, Ministry of Education, China Medical University
* These authors contributed equally

Summary

الإشريكية القولونية هي السبب الرئيسي لالتهاب السحايا البكتيري السلبي للغرام الوليدي. خلال العدوى البكتيرية ، تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية التي تنتجها العدلات دورا كبيرا في مبيد الجراثيم. هنا نقدم طريقة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية في العدلات استجابة لالتهاب السحايا E. coli.

Abstract

الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية)هي البكتيريا الأكثر شيوعا سلبية الغرام المسببة لالتهاب السحايا الوليدي. حدوث البكتيريا والاختراق البكتيري من خلال حاجز الدم في الدماغ هي خطوات لا غنى عنها لتطوير التهاب السحايا الإشريكية القولونية. تمثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) آليات مبيدات الجراثيم الرئيسية للعدلات لتدمير مسببات الأمراض الغازية. في هذا البروتوكول، تم قياس إنتاج ROS داخل الخلايا المعتمد على الوقت في العدلات المصابة بالإشريكية القولونية السحائية باستخدام مسابير ROS الفلورية التي تم اكتشافها من قبل قارئ اللوحة الدقيقة الفلورية في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تقييم إنتاج ROS في خلايا الثدييات أثناء التفاعلات بين مسببات الأمراض والمضيف.

Introduction

التهاب السحايا البكتيري الوليدي هو مرض معد شائع لدى الأطفال. الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية)مع كبسولة K1 هو الممرض الأكثر شيوعا سلبية الغرام مما تسبب في التهاب السحايا البكتيري الوليدي، وهو ما يمثل حوالي 80٪ من إجمالي الإصابة1،2،3. على الرغم من التقدم في العلاج الكيميائي المضاد للميكروبات والرعاية الداعمة ، لا يزال التهاب السحايا البكتيري واحدا من أكثر الحالات تدميرا مع ارتفاع المراضة والوفيات4.

يحدث التهاب السحايا البكتيري الوليدي عادة ما يبدأ مع البكتيريا الناجمة عن دخول البكتيريا المسببة للأمراض في الدورة الدموية الطرفية من الآفات المحلية للمواليد الجدد ، تليها اختراق من خلال حاجز الدم في الدماغ (BBB) في الدماغ ، مما يؤدي إلى التهاب السحايا4. بداية البكتيريا يعتمد على التفاعل بين البكتيريا والخلايا المناعية المضيفة بما في ذلك العدلات وال الضامة، الخ. العدلات، والتي تمثل ~ 50-70٪ من خلايا الدم البيضاء، هي خط الدفاع الأول ضد العدوى البكتيرية5،6. خلال غزو البكتيريا ، يتم تجنيد العدلات المنشطة إلى المواقع المعدية وإطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بما في ذلك أيون أكسيد فائق ، بيروكسيد الهيدروجين ، الجذور الهيدروكسيل ، والأوكسجين الفردي7. يخضع ROS لتفاعلات الأكسدة مع غشاء الخلية وجزيئات الحمض النووي وبروتينات البكتيريا ، مما يؤدي إلى إصابة ووفاة البكتيريا الغازية8. الميتوكوندريا هو الموقع الرئيسي لإنتاج ROS في الخلايا eukaryotic، ومختلف oxidases (على سبيل المثال، نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد فوسفات (NADPH) مجمع أوكسيداز، نظام ليبوكسيجيناز، بروتين كيناز C ونظام سيكلوكسيجيناز) التوسط في إنتاج ROS9،10. يعد القياس في الوقت الفعلي لإنتاج ROS ، الذي يمثل الآلية الأساسية المضادة للميكروبات في العدلات ، طريقة مفيدة لدراسة دفاع المضيف أثناء التفاعل بين البكتيريا والمضيف.

في هذا البروتوكول، تم قياس إنتاج ROS المعتمد على الوقت في العدلات المصابة بالإشريكية القولونية السحائية كميا مع مسبار ROS الفلوري DHE، الذي تم اكتشافه من قبل قارئ اللوحة الدقيقة الفلورية في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تقييم إنتاج ROS في خلايا الثدييات الأخرى أثناء التفاعل بين العامل الممرض والمضيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الدم المحيطي من المتطوعين المطبقين في هذا البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لأول مستشفى في الجامعة الطبية الصينية (#2020-2020-237-2).

1. إعداد الكواشف والثقافة المتوسطة

  1. إعداد العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق إضافة 8.29 غرام من NH4Cl, 1 غرام من KHCO3, 37.2 ملغ من Na2EDTA إلى 1 لتر من الماء المقطر المزدوج وضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4. إزالة البكتيريا عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر.
  2. إعداد المتوسطة الثقافة التجريبية ل العدلات بإضافة 5٪ مصل البقر الجنين إلى RPMI 1640 المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية. توازن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: استخدم متوسط RPMI 1640 بدون أحمر الفينول.
  3. إعداد الفوسفات العازلة المالحة (PBS) عن طريق إضافة 8 غرام من NaCl، 0.2 غرام من KCl، 1.44 غرام من Na2HPO4· 2H2O و 0.2 غرام من KH2PO4 إلى 1 لتر من الماء المقطر المزدوج في قارورة زجاجية 1 لتر. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4. أوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية.
  4. إعداد محلول ريفامبيسين عن طريق حل 0.5 غرام من مسحوق ريفامبيسين في 10 مل من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) لتسفر عن محلول ريفامبيسين 50 ملغ / مل.
  5. إعداد LB أجار الحل بإضافة 10 غرام من NaCl، 10 غرام من تريبتون، 5 غرام من استخراج الخميرة و 15 غرام من مسحوق أجار في 1 لتر من الماء المقطر المزدوج وautclave الخليط. ملء أطباق بيتري إلى نصف حجم عن طريق صب الحارة LB أجار الحل التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ريفامبيسين. قم بتخزين اللوحة الصلبة المبردة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  6. إعداد الدماغ ضخ القلب (BHI) مرق مناسبة للسلالات البكتيرية عن طريق حل 37 غرام من مسحوق BHI في 1 لتر من الماء المقطر مزدوجة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 وautclave ذلك.
  7. حل مسبار الفلورسنت ديهيدرويثيديوم (DHE) في المذيبات DMSO لتسفر عن محلول مخزون 10 mM. تخلط بلطف قبل الاستخدام.
    ملاحظة: Aliquot حل الأسهم فورا في قوارير واقية من الضوء. العمر الافتراضي لحل المخزون هو 6 أشهر عند -20 درجة مئوية.

2. إعداد سلالة البكتيريا E44

ملاحظة: E44 هو سلالة متحولة من الإشريكية القولونية السحائي مع مقاومة ريفامبيسين.

  1. تراجع مستعمرة E44 cryopreserved مع طرف ماصة معقمة، تلقيح سلالة E44 على لوحة أجار LB التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ريفامبيسين عن طريق رسم خطوط. ضع اللوحة رأسا على عقب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. قبل يوم واحد من التجربة ، اختر مستعمرة E44 واحدة من اللوحة مع طرف ماصة معقم ووضعها في 5 مل من مرق BHI الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل ريفامبيسين في قارورة 50 مل. احتضان الثقافة البكتيرية في 37 درجة مئوية مع 90 دورة في الدقيقة لمدة 17 ساعة في شاكر الحضانة.

3. عزل العدلات من الدم المحيطي البشري

  1. رسم 5 مل من عينة الدم من المتطوعين عن طريق الوريد إلى أنبوب جمع الدم فراغ التي تحتوي على EDTA لمكافحة التخثر.
  2. الطرد المركزي عينات الدم المحيطي في 500 x ز لمدة 5 دقائق. وتنقسم عينات الدم إلى ثلاث طبقات عن طريق الطرد المركزي، والتي من أسفل إلى أعلى هي طبقة خلايا الدم الحمراء (RBC)، وطبقة خلايا الدم البيضاء (WBC) وطبقة البلازما، على التوالي.
  3. يستنشق طبقة خلايا الدم البيضاء مع ماصة إلى أنبوب جديد مع 3x RBC تحلل العازلة. يمزج الخليط جيدا ويوضع في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. الطرد المركزي الأنبوب في 500 × ز لمدة 5 دقائق. يستنشق supernatant تماما وتجاهل.
    1. كرر إجراء التحلل مع مخزن تحلل RBC المؤقت 1-2 مرات ، حتى يتحول الراسب إلى اللون الأبيض.
  5. غسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق عجل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. ثم الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا يستقر إلى أسفل الأنبوب.
  6. تسمية العدلات مع الميكروبات CD16 عن طريق إعادة تعليق الرواسب مع 50 ميكروغرام من العازلة فرز الخلايا المغناطيسية المبردة مسبقا. ثم تخلط مع 50 ميكرولتر من الميكروبات CD16 الإنسان بدقة. احتضان الخليط في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يجب تبريد الحلول مسبقا لمنع وضع حد أقصى للأجسام المضادة على سطح الخلية ووضع علامات غير محددة. معظم البالغين لديهم حوالي 4000 إلى 10000 خلية دم بيضاء لكل ميكرولتر من الدم ، من بينها العدلات تمثل ما يقرب من 50-70 ٪. حسب التقدير ، فإن عدد خلايا الدم البيضاء الإجمالية في 5 مل من الدم المحيطي البشري عادة ما يصل إلى 2-5 × 107.
  7. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من العازلة فرز الخلايا المغناطيسية والطرد المركزي في 4 درجة مئوية، 300 × ز لمدة 10 دقيقة. تجاهل supernatant تماما وإعادة إنفاق الراسب مع 500 ميكرولتر من الفرز العازلة.
  8. تجميع العمود المغناطيسي وفصل الرف. نقل الفاصل إلى الرف مع العمود المغناطيسي وشطف العمود مع 3 مل من المخزن المؤقت الفرز.
  9. إسقاط تعليق الخلية في العمود للسماح العدلات المسمى من قبل الخرز المغناطيسي لإرفاق العمود المغناطيسي.
  10. اغسل الخلايا غير المسماة بإضافة 3 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية 3 مرات، مع التأكد من أن خزان العمود فارغ في كل مرة.
  11. قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وضعه على أنبوب 15 مل. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية إلى العمود. دفع خارج الخلايا المسماة المغناطيسي باستخدام المكبس.
    ملاحظة: لتحسين نقاء العدلات، قد تتكرر خطوات الفرز باستخدام عمود جديد.
  12. الطرد المركزي الأنبوب في 300 × ز لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant تماما وإعادة إنفاق عجل مع 1 مل من الثقافة المتوسطة. تحديد رقم الخلية باستخدام عداد الخلية وإعداد الخلايا لإجراء المزيد من التجارب.

4. قياس روس

  1. الطرد المركزي العدلات المعزولة في 300 × ز لمدة 5 دقائق، resuspend المرسب، وضبط تركيز الخلية إلى 2 × 106/ مل مع وسيطة الثقافة التي تحتوي على 5 ميكرومتر DHE مضان التحقيق.
  2. احتضان العدلات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحميل مسبار DHE، ومن ثم تخصيص تعليق الخلية إلى لوحة صغيرة البوليسترين الأسود 96 جيدا مع 200 ميكرولتر لكل بئر.
  3. قم بتشغيل قارئ اللوحة الدقيقة وفتح برنامج الكشف. اختر تنسيق لوحة 96 بئرا معتما وحدد منطقة القراءة.
    1. ضبط الفلورسينس (Ex/Em = 518/605 نانومتر) في الوضع الحركي كل 5 دقائق لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من هز اللوحة لمدة 3 ق قبل كل قراءة.
  4. إخراج لوحة صغيرة من الحاضنة، إضافة E44 المستزرعة (MOI = 100) أو phorbol 12-myristate 13-خلات (PMA) (100 نانوغرام / مل) إلى كل بئر تحتوي على العدلات المحملة مسبقا مع 3 يكرر. استخدم سلطة النقد الفلسطينية كعنصر تحكم إيجابي.
  5. ضع اللوحة في قارئ اللوحة الدقيقة وابدأ الفحص على الفور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام البروتوكول المبين في هذه المقالة، تم عزل العدلات من الدم المحيطي البشري وتحميلها مع مسبار مضان DHE للكشف عن التغيرات في مستويات ROS استجابة للعدوى E44. هنا ، نقدم بيانات تمثيلية توضح إنتاج ROS الذي أثارته سلالة E44 التي يحددها قارئ microplate في الوقت الفعلي. بإضافة سلالات E44 في وزارة الداخلية من 100، زادت مستويات ROS على الفور وأظهرت اتجاها تصاعديا مستمرا مع طريقة تعتمد على الوقت(الشكل 1). بإضافة PMA، وهو محفز ROS معروف من ROS داخل الخلايا في العدلات، لاحظنا منحنى على شكل حرف S يقدم منحنى مسطح في المرحلة الأولية تليها زيادة كبيرة من 20 دقيقة إلى 40 دقيقة وبلغت ذروتها في النهاية عند 60 دقيقة (الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1. إنتاج ROS تعتمد على الوقت في العدلات المصابة بالإشريكية القولونية السحائي . تم تحميل العدلات المعزولة عن الدم المحيطي البشري بصبغة DHE ، وأضيفت سلالة E44 (MOI = 100) ، وتم تحديد متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) على الفور مع قارئ لوحة صغيرة. استخدمت العدلات المعالجة بسلطة النقد الفلسطينية (100 نانوغرام/مل) كتحكم إيجابي. تم تسوية كافة البيانات إلى القيمة الأولية للحصول على كثافة DHE النسبية وتقديمها على أنها متوسط ± SEM (n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العدلات بمثابة العنصر الأكثر وفرة من خلايا الدم البيضاء في الدورة الدموية البشرية. فهي خلايا تأثير هامة في الجهاز المناعي البشري الفطري ، الذي يبني خط الدفاع الأول ضد غزو مسببات الأمراض11. جيل ROS يمثل واحدة من آليات مبيدات الجراثيم الرئيسية من العدلات بعد البلعومة11. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن بنية تشبه الشبكة الصادرة عن العدلات تسمى فخ العدلات خارج الخلية (NET) وتشارك أيضا في عملية قتل البكتيريا6,11,12.

وقد أفيد أن ROS التي تنتجها العدلات الناجمة عن تحفيز الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض هي أساسا بسبب تفعيل NADPH oxidase، الذي يتكون من اثنين من الوحدات الفرعية ملزمة الغشاء (gp91phox وp22phox)وثلاث وحدات فرعية السيتوسوليك (p47فؤوس،p67فلوكس،وp40فلوكس)5. البكتيريا الغارقة تنشيط سلسلة من kinases داخل العدلات، مثل البروتين كيناز C (PKC)، كيناز البروتين A (PKA)، وكيناز البروتين المنشط ميتوجين (MAPK)، أن الفوسفوريلات الوحدات الفرعية السيتوسولية p47فلوكس من أوكسيداز NADPH. ثم تريمر السيتوسوليك تتألف من p47phox، p67phox، وp40phox translocates إلى الغشاء إلى الجمع مع الغشاء ملزمة subunit gp91phox وp22phox، وتشكيل مجمع NADPH oxidase الكامل. مجمع NADPH oxidase المجمع ينقل الإلكترونات المشتقة من NADPH إلى جزيئي O2، وتوليد أنيونات فائقة أكسيد وتفعيل وظائف مبيد الجراثيم13،14،15. وتفيد التقارير أيضا أن ROS التي تنتجها العدلات قد تكون مرتبطة أيضا مع تشكيل صافي العدلات16،17. ولذلك، فإن الكشف عن إنتاج روس تسهم في مزيد من الدراسة لآلية مبيدات الجراثيم من العدلات.

في هذا البروتوكول، يتم تحميل العدلات المعزولة عن الدم المحيطي مسبقا مع مسبار مضان DHE وتخصيصها للصفيحة الدقيقة البوليسترين السوداء 96 جيدا. يتم الكشف عن كثافة ROS من قبل قارئ microplate في الوقت الحقيقي بعد إضافة الإشريكية القولونية السحائي.

الدم الذي تم جمعه مضاد للتخثر باستخدام EDTA أو سيترات لتجنب تنشيط العدلات عن طريق تكملة18. كما يتم تمييز العدلات بشكل نهائي ولها فترة حياة قصيرة (حوالي 4-8 ساعات) في الدم المتداول ، يجب أن تتم خطوات العزل في أقرب وقت ممكن بعد جمع الدم19. وقد استخدمت العديد من الكواشف عزل، مثل فيكول-Hypaque وبيركول، لعزل العدلات من الدم المحيطي11،19،20. في هذا البروتوكول ، يتم عزل العدلات عن طريق اختيار الميكروبات CD16 بعد تحلل كريات الدم الحمراء من الدم المحيطي. وهو يقدم تحسينات كبيرة في السرعة والبساطة والنقاء. للحصول على أنقى العدلات، يمكن تطبيق الطرد المركزي الانحدار الكثافة قبل العزل مع الخرز المغناطيسي CD16.

وهناك عدد من المسابير الفلورية المعترف بها، مثل ديهيدرويثيديوم (DHE)، 2'، 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) وديهيدروردهودامين 123 (DHR) التي تمر عبر غشاء الخلية بحرية، ويمكن استخدامها لتحديد ROS داخل الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي، المجهر confocal أو قارئ لوحة صغيرة21،22،23،24. بالإضافة إلى الكشف عن مسبار مضان DHE مع قارئ الألواح الدقيقة ، يمكن أيضا استخدام قياس التدفق الخلوي والمجهر البؤري للكشف عن تعديلات كثافة الفلورية في DHE في النقاط الزمنية المشار إليها لقياس إنتاج ROS في العدلات.

يوفر هذا البروتوكول طريقة أسهل للكشف عن إنتاج ROS بطريقة فورية ويمكن استخدامه في مجموعة متنوعة من السيناريوهات للكشف عن جيل ROS في خلايا الثدييات المضيفة المصابة بالكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة أو أي تضارب آخر في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31670845، 31870832، 32000811) وبرنامج الأستاذ المتميز في مقاطعة لياونينغ (LJH2018-35).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes KIRGEN KG2611
96-well plate Corning 3025
Agar DINGGUO DH010-1.1
Autuomated cell counter Bio-rad 508BR03397
Biological Safety Carbinet Shanghai Lishen Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion BD 237500
CD16 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-701
Centrifuge Changsha Xiangyi TDZ5-WS
Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Dihydroethidium (DHE) MedChemExpress 104821-25-2
Fetal bovine serum Cellmax SA211.02
Incubator Heraeus Hera Cell
MACS separation buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Beyoitme S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit Miltenyi Biotec 130-090-976
Rifampicin Solarbio 13292-46-1
RPMI1640 medium Sangon Biotech E600027-0500
Thermostatic shaker Shanghai Zhicheng ZWY-100D
Trypton OXOID LP0042
Yeast extract OXOID LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
  2. Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
  3. Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
  4. Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
  5. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  7. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  8. Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
  9. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  10. Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
  11. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
  13. Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
  14. Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
  15. Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
  16. Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
  17. Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
  18. Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
  19. Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
  20. Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  21. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  22. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  23. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  24. Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 170، الإشريكية القولونية، التهاب السحايا ، العدلات ، ROS
التحديد الكمي في الوقت الحقيقي لأنواع الأكسجين التفاعلية في العدلات المصابة <em>بالإشريشيا القولونية السحايا</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X. W., An, M. X., Zhao, W. D. … More

Zhang, X. W., An, M. X., Zhao, W. D. Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (170), e62314, doi:10.3791/62314 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter