Summary
Escherichia coli est la principale cause de méningite bactérienne gramnégative néonatale. Pendant l’infection bactérienne, les espèces réactives d’oxygène produites par les neutrophiles jouent un rôle bactérien majeur. Ici, nous introduisons une méthode pour détecter les espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles en réponse à la méningite E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) est la bactérie gramnégative la plus commune causant la méningite néonatale. L’apparition de la bactériémie et la pénétration bactérienne par la barrière céphalo-encéphalique sont des étapes indispensables au développement de la méningite à E. coli. Les espèces réactives d’oxygène (ROS) représentent les principaux mécanismes bactéricides des neutrophiles pour détruire les pathogènes envahis. Dans ce protocole, la production intracellulaire de ROS dépendante du temps dans les neutrophiles infectés par E. coli méningitique a été quantifiée à l’aide de sondes ROS fluorescentes détectées par un lecteur de microplaque de fluorescence en temps réel. Cette méthode peut également être appliquée à l’évaluation de la production de ROS dans les cellules mammifères lors des interactions pathogènes-hôtes.
Introduction
La méningite bactérienne néonatale est une maladie infectieuse pédiatrique courante. Escherichia coli (E. coli) avec une capsule K1 est l’agent pathogène gramnégatif le plus commun causant la méningite bactérienne néonatale, représentant environ 80% de l’incidence totale1,2,3. Malgré les progrès de la chimiothérapie antimicrobienne et des soins de soutien, la méningite bactérienne reste l’une des affections les plus dévastatrices avec une morbidité et une mortalitéélevées 4.
L’occurrence de la méningite bactérienne néonatale commence habituellement par la bactériémie provoquée par l’entrée des bactéries pathogènes dans la circulation périphérique des lésions locales des nouveau-nés, suivie de la pénétration par la barrière de sang-cerveau (BBB) dans le cerveau, ayant pour résultat l’inflammation des méninges4. L’apparition de la bactériémie dépend de l’interaction entre les bactéries et les cellules immunitaires hôtes, y compris les neutrophiles et les macrophages, etc. Les neutrophiles, qui représentent ~50-70% des globules blancs, sont la première ligne de défense contre les infections bactériennes5,6. Pendant l’invasion des bactéries, les neutrophiles activés sont recrutés dans les sites infectieux et libèrent des espèces réactives d’oxygène (ROS), y compris l’anion de superoxyde, le peroxyde d’hydrogène, les radicaux hydroxyles et l’oxygène singlet7. Le ROS subit des réactions de redox avec la membrane cellulaire, les molécules d’acide nucléique et les protéines des bactéries, ayant pour résultat la blessure et la mort des bactéries envahissantes8. Les mitochondries sont le site principal de la production de ROS dans les cellules eucaryotes, et divers oxidases (par exemple, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase complexe, système de lipoxygénase, protéine kinase C et système de cyclooxygénase) médiation la production de ROS9,10. La mesure en temps réel de la production de ROS, représentant le mécanisme antimicrobien primaire dans les neutrophiles, est une méthode utile pour étudier la défense de l’hôte pendant l’interaction bactéries-hôte.
Dans ce protocole, la production de ROS dépendante du temps dans les neutrophiles infectés par E. coli méningitique a été quantifiée par une sonde ROS fluorescente DHE, détectée par un lecteur de microplaque de fluorescence en temps réel. Cette méthode peut également être appliquée à l’évaluation de la production de ROS dans d’autres cellules mammifères au cours de l’interaction pathogène-hôte.
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Protocol
Le sang périphérique des volontaires appliqués dans cette recherche a été approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de la première université médicale de l’Hôpital de Chine (#2020-2020-237-2).
1. Préparation des reagents et du milieu culturel
- Préparer le tampon de lyse des globules rouges en ajoutant 8,29 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3, 37,2 mg de Na2EDTA en 1 L d’eau distillée double et ajuster le pH à 7,2-7,4. Éliminez les bactéries par filtration à l’aide de filtres de 0,22 μm.
- Préparer un milieu de culture expérimentale pour les neutrophiles en ajoutant 5 % de sérum bovin fœtal au milieu du RPMI 1640 et le conserver à 4 °C. Equilibrer à température ambiante avant utilisation.
REMARQUE : Utilisez le milieu RPMI 1640 sans rouge phénol. - Préparer le salin tampon phosphate (PBS) en ajoutant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4·2H2O et 0,2 g de KH2PO4 en 1 L d’eau distillée double dans un flacon de verre de 1 L. Réglez le pH à 7,2-7,4. Autoclave-le pendant 15 min à 121 °C.
- Préparer la solution de rifampicine en dissolvant 0,5 g de poudre de rifampicine dans 10 mL de sulfure de diméthyle (DMSO) pour produire une solution de rifampicine de 50 mg/mL.
- Préparer la solution d’agar LB en ajoutant 10 g de NaCl, 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 15 g de poudre d’agar dans 1 L d’eau distillée double et autoclave le mélange. Remplissez les boîtes de Pétri à la moitié du volume en versant la solution chaude d’agar de LB contenant 100 μg/mL de rifampicine. Conserver la plaque solide refroidie à 4 °C.
- Préparer l’infusion cardiaque du cerveau (BHI) bouillon approprié pour les souches bactériennes en dissolvant 37 g de poudre BHI dans 1 L d’eau distillée double. Réglez le pH à 7,2 et autoclavez-le.
- Dissoudre la sonde fluorescente dihydroethidium (DHE) dans le solvant DMSO pour produire une solution de stock de 10 mM. Mélanger délicatement avant utilisation.
REMARQUE : Aliquot la solution de stock immédiatement dans des flacons à l’épreuve de la lumière. La durée de conservation de la solution de stock est de 6 mois à -20 °C.
2. Préparation de la souche de bactéries E44
REMARQUE : E44 est une souche mutante d’E. coli méningitique résistante à la rifampicine.
- Tremper la colonie cryopréservée E44 avec une pointe stérile de pipette, inoculer la souche E44 sur la plaque d’agar LB contenant 100 μg/mL de rifampicine en dessinant des lignes. Mettez la plaque à l’envers dans l’incubateur à 37 °C pendant la nuit.
- Un jour avant l’expérience, choisissez une colonie E44 dans la plaque avec une pointe stérile de pipette et mettez-la dans 5 mL de bouillon BHI contenant 100 μg/mL de rifampicine dans un flacon de 50 mL. Incuber la culture bactérienne à 37 °C avec 90 rpm pendant 17 h dans un shaker d’incubation.
3. Isolement des neutrophiles du sang périphérique humain
- Tirez 5 mL d’échantillon de sang des volontaires par voie intraveineuse au tube de collecte de sang sous vide contenant EDTA pour l’anticoagulation.
- Centrifugeuse les échantillons de sang périphériques à 500 x g pendant 5 min. Les échantillons de sang sont divisés en trois couches par centrifugation, qui de bas en haut sont la couche de globules rouges (RBC), la couche de globules blancs (WBC) et la couche plasmatique, séquentiellement.
- Aspirez la couche de globules blancs avec un pipet à un nouveau tube avec tampon de lyse RBC 3x. Bien mélanger le mélange et le placer à température ambiante pendant 5 min.
- Centrifuger le tube à 500 x g pendant 5 min. Aspirer complètement le surnatant et jeter.
- Répétez la procédure de lyse avec le tampon de lyse RBC 1-2 fois, jusqu’à ce que le précipité devient blanc.
- Lavez les cellules en réutilisant le précipité avec 2 mL de PBS. Puis centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min pour laisser les cellules s’installer au fond du tube.
- Étiquetez les neutrophiles avec des microbilles CD16 en réutilisant les sédiments avec 50 μL de tampon de tri des cellules magnétiques précoolées. Ensuite, mélanger avec 50 μL de microbilles humaines CD16 à fond. Incuber le mélange à 4 °C pendant 30 min.
REMARQUE : Les solutions doivent être pré-refroidies pour éviter le plafonnement des anticorps à la surface des cellules et l’étiquetage non spécifique. La plupart des adultes ont environ 4.000 à 10.000 globules blancs par microlitre de sang, parmi lesquels, les neutrophiles représentent environ 50-70%. Selon les estimations, les comptes de globules blancs totaux dans 5 mL de sang périphérique humain sont généralement jusqu’à 2-5 x 107. - Lavez les cellules en ajoutant 2 mL de tampon de tri des cellules magnétiques et centrifugeuse à 4 °C, 300 x g pendant 10 min. Jetez complètement le supernatant et resuspendez le précipité avec 500 μL de tampon de tri.
- Assembler la colonne magnétique et séparer l’étagère. Déplacez le séparateur sur l’étagère avec la colonne magnétique et rincez la colonne avec 3 mL de tampon de tri.
- Déposez la suspension cellulaire dans la colonne pour permettre aux neutrophiles étiquetés par les perles magnétiques de s’attacher à la colonne magnétique.
- Lavez les cellules non étiquetées en ajoutant 3 mL de tampon de tri des cellules magnétiques 3 fois, en vous assurant que le réservoir de colonne est vide à chaque fois.
- Retirez la colonne du séparateur magnétique et placez-la sur un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de tampon de tri des cellules magnétiques à la colonne. Poussez les cellules magnétiques étiquetées à l’aide d’un piston.
REMARQUE : Pour améliorer la pureté des neutrophiles, les étapes de tri peuvent être répétées à l’aide d’une nouvelle colonne. - Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min, jeter complètement le supernatant et resuspendre le précipité avec 1 mL de culture moyenne. Déterminez le numéro de cellule avec un compteur cellulaire et préparez les cellules pour d’autres expériences.
4. Mesure du ROS
- Centrifugeuse les neutrophiles isolés à 300 x g pendant 5 min, resuspendent le précipité, et ajustent la concentration cellulaire à 2 x 106/mLavec le milieu de culture contenant la sonde de fluorescence de 5 μM DHE.
- Incuber les neutrophiles à 37 °C pendant 30 min pour charger la sonde DHE, puis allouer la suspension cellulaire à une microplaque de polystyrène noir de 96 puits avec 200 μL par puits.
- Allumez le lecteur de microplaque et ouvrez le logiciel de détection. Choisissez un format opaque de plaques de 96 puits et déterminez la zone de lecture.
- Réglez la fluorescence (Ex/Em = 518/605 nm) en mode cinétique toutes les 5 minutes pendant 60 min à 37 °C. Assurez-vous de secouer la plaque pendant 3 s avant chaque lecture.
- Sortez la microplaque de l’incubateur, ajoutez l’E44 cultivé (MOI=100) ou le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (100 ng/mL) à chaque puits contenant des neutrophiles préchargés avec 3 répliques. Utilisez la PMA comme un contrôle positif.
- Placez la plaque dans le lecteur de microplaque et commencez l’analyse immédiatement.
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Representative Results
Utilisant le protocole décrit dans cet article, les neutrophiles ont été isolés du sang périphérique humain et chargés avec la sonde de fluorescence DHE pour détecter les changements des niveaux de ROS en réponse à l’infection d’E44. Ici, nous fournissons des données représentatives démontrant la production ros évoquée par la souche E44 déterminée par un lecteur de microplaques en temps réel. En ajoutant des souches E44 à un MOI de 100, les niveaux de ROS ont augmenté immédiatement et ont montré une tendance continue à la hausse avec une manière dépendante du temps (figure 1). En ajoutant pma, un inducteur ros bien connu de ROS intracellulaire dans les neutrophiles, nous avons observé une courbe en forme de S qui présente une courbe plate au stade initial suivie d’une augmentation significative de 20 min à 40 min et enfin un pic à 60 min (Figure 1).
Figure 1. Production de ROS dépendante du temps dans les neutrophiles infectés par E. coli méningitique. Des neutrophiles isolés du sang périphérique humain ont été chargés avec le colorant de DHE, une souche E44 (MOI=100) a été ajoutée, et l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) a été déterminée immédiatement avec un lecteur de microplaque. Les neutrophiles traités par PMA (100 ng/mL) ont été utilisés comme un contrôle positif. Toutes les données ont été normalisées à la valeur initiale pour obtenir l’intensité relative du DHE et présentées comme moyen ± SEM (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les neutrophiles agissent comme la composante la plus abondante des globules blancs dans la circulation sanguine humaine. Ce sont des cellules effectrices importantes dans le système immunitaire humain inné, qui construit la première ligne de défense contre l’invasion des pathogènes11. La génération de ROS représente l’un des principaux mécanismes bactéricides des neutrophiles suivant la phagocytose11. Des études récentes ont montré qu’une structure en forme de filet libérée par un neutrophile appelé piège extracellulaire neutrophile (NET) est également impliquée dans le processus de mise à mortdes bactéries 6,11,12.
Il a été rapporté que ros produit par les neutrophiles induits par la stimulation des micro-organismes pathogènes sont principalement causés par l’activation de l’oxidase NADPH, qui est composé de deux sous-unités de liaison membranaire(phox gp91 etp22 phox) et trois sous-unités cytosoliques (p47phox, p67phox, et p40phox)5. Les bactéries englouties activent une série de kinases à l’intérieur des neutrophiles, telles que la protéine kinase C (PKC), la protéine kinase A (PKA) et la kinase protéique activée par mitogène (MAPK), qui phosphorent les sous-unités cytosoliques p47phoxe de NADPH oxidase. Ensuite, un trimer cytosolic composé de p47phox, p67phox, et p40phox se translocalise à la membrane pour se combiner avec la membrane liant subunit gp91phox et p22phox, formant le complexe complet nadph oxidase. Le complexe d’oxidase NADPH assemblé transfère les électrons dérivés du NADPH à l’O2moléculaire, générant des anions de superoxyde et activant les fonctions bactériicides13,14,15. Il est également rapporté que ros produit par les neutrophiles peut également être associé à la formation net de neutrophiles16,17. Par conséquent, la détection de la production de ROS contribuerait à l’étude plus approfondie du mécanisme bactéricide des neutrophiles.
Dans ce protocole, les neutrophiles isolés du sang périphérique sont préchargés avec la sonde de fluorescence DHE et attribués à une microplaque noire de polystyrène de 96 puits. L’intensité ros est détectée par un lecteur de microplaques en temps réel après l’ajout d’Escherichia coli méningitique.
Le sang recueilli est anticoagulé à l’aide d’EDTA ou de citrate pour éviter l’activation des neutrophiles parcomplément 18. Comme les neutrophiles sont différenciés en phase terminale et ont une courte durée de vie (environ 4-8 heures) dans le sang circulant, les étapes d’isolement doivent être faites dès que possible après la collecte desang 19. Beaucoup de reagents isolants, tels que Ficoll-Hypaque et Percoll, ont été employés pour isoler des neutrophilesdu sang périphérique 11,19,20. Dans ce protocole, les neutrophiles sont isolés par sélection de microbilles CD16 après la lyse érythrocyte du sang périphérique. Il offre des améliorations significatives dans la vitesse, la simplicité et la pureté. Pour obtenir des neutrophiles plus purs, une centrifugation de gradient de densité pourrait être appliquée avant l’isolement avec des perles magnétiques CD16.
Un certain nombre de sondes fluorescentes reconnues, telles que le dihydroethidium (DHE), Le dététate de 7'-dichlorodihydrofluorescéine (H2DCF-DA) et la dihydrorhodamine 123 (DHR) qui passent librement à travers la membrane cellulaire, peuvent être utilisés pour la détermination du ROS intracellulaire par cytométrie d’écoulement, microscopie confocale ou lecteur de microplaque21,22,23,24. En plus de la détection de la sonde de fluorescence DHE avec lecteur de microplaques, la cytométrie de débit et la microscopie confocale pourraient également être utilisées pour détecter les altérations de l’intensité de fluorescence du DHE aux points de temps indiqués pour mesurer la production de ROS dans les neutrophiles.
Ce protocole permet de détecter plus facilement la production de ROS en temps réel et peut être utilisé dans une variété de scénarios pour détecter la génération ROS dans les cellules mammifères hôtes infectées par des micro-organismes pathogènes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) et le Programme du professeur émérite de la province du Liaoning (LJH2018-35).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S.
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J.
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S.
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
