Summary
대장균은 신생아 그람 음성 세균성 뇌막염의 주요 원인입니다. 세균성 감염 도중, 호중구에 의해 생성된 반응성 산소 종은 중요한 bactericidal 역할을 합니다. 여기서 우리는 뇌막염 대장균에 대응하여 호중구에서 반응성 산소 종을 검출하는 방법을 소개한다.
Abstract
대장균 (대장균)은신생아 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 박테리아입니다. 혈액-뇌 장벽을 통한 세균혈및 세균성 침투의 발생은 대장균 뇌막염의 발달을 위한 필수 단계입니다. 반응성 산소 종 (ROS)은 침략 된 병원체를 파괴하는 호중구의 주요 bactericidal 메커니즘을 나타냅니다. 이 프로토콜에서, 수막 대장균에 감염된 호중구에서의 시간 의존적인 세포내 ROS 생산은 실시간 형광 마이크로 플레이트 판독기에 의해 검출된 형광 ROS 프로브를 사용하여 정량화되었다. 이 방법은 또한 병원체 호스트 상호 작용 도중 포유류 세포에 있는 ROS 생산의 평가에 적용될 수 있습니다.
Introduction
신생아 세균성 뇌막염은 일반적인 소아 전염병입니다. K1 캡슐을 가진대장균(E. coli)은신생아 세균성 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 병원균으로, 전체 발병률 1,2,3의약 80%를 차지한다. 항균 화학 요법과 지원 치료의 진보에도 불구하고 세균 성 뇌막염은 여전히 높은 이환율과 사망률4를가진 가장 파괴적인 조건 중 하나입니다.
신생아 세균성 뇌막염의 발생은 일반적으로 신생아의 국소 병변으로부터 말초 순환으로 병원성 박테리아의 진입에 의한 박테혈으로 시작하여 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 뇌로 침투하여 수막4의염증을 초래한다. 박테리아의 발병은 호중구와 대식세포 등을 포함한 박테리아와 숙주 면역 세포 사이의 상호 작용에 달려 있습니다. 백혈구의 ~50-70%를 차지하는 호중구는 세균 감염5,6에대한 첫 번째 방어선이다. 박테리아의 침입 동안, 활성화된 호중구는 전염하는 부위에 모집되고 슈퍼옥사이드 음염, 과산화수소, 하이드록실 라디칼 및 단일 산소7을포함하는 반응성 산소 종(ROS)을 방출한다. ROS는 세포막, 핵산 분자 및 박테리아의 단백질과 의결된 레독스 반응을 겪으며,침입하는박테리아8의 부상과 사망을 초래한다. 미토콘드리아는 진핵세포에서 ROS 생산의 주요 사이트이며, 다양한 산화제(예를 들어, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염(NADPH) 산화체 복합체, 립산소아제 시스템, 단백질 키나아제 C 및사이클로시산소시스템)의 생산을 중화한다. 호중구의 1차 항균 메커니즘을 나타내는 ROS의 생산의 실시간 측정은 박테리아-숙주 상호 작용 중에 숙주 방어를 연구하는 유용한 방법입니다.
이 프로토콜에서, 수막 대장균에 감염된 호중구의 시간 의존적인 ROS 생산은 실시간 형광 마이크로 플레이트 판독기에 의해 검출된 형광 ROS 프로브 DHE로 정량화되었다. 이 방법은 또한 병원체 숙주 상호 작용 동안 다른 포유류 세포에서 ROS 생산의 평가에 적용될 수 있다.
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Protocol
이 연구에 적용 된 자원 봉사자의 말초 혈액은 중국 의과 대학 (#2020-2020-237-2)의 첫 번째 병원의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 및 문화 매체의 준비
- NH4Cl8.29g, KHCO31g, Na2EDTA 37.2 mg을 이중 증류수 1L에 첨가하여 적혈구 용해 완충제를 준비하고 pH를 7.2-7.4로 조절한다. 0.22 μm 필터를 사용하여 여과에 의해 박테리아를 제거합니다.
- RPMI 1640 배지에 5% 태아 소 혈청을 첨가하여 호중구에 대한 실험 배양 배지를 준비하고 4°C에 저장한다. 사용하기 전에 실온에 평형.
참고: 페놀 레드 없이 RPMI 1640 배지를 사용합니다. - NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO 4 ·2H2O 및 0.2 g의 KH2PO4를1L 유리 플라스크에서 이중 증류수 1L에 추가하여 인산염 완충식 식염수(PBS)를 준비한다. pH를 7.2-7.4로 조정합니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브하십시오.
- 디메틸 설플옥사이드(DMSO)의 10mL에서 0.5 g의 리팜피신 분말을 용해하여 50 mg/mL 리팜피신 용액을 산출하여 리팜피신 용액을 준비하십시오.
- NaCl 10g, 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 한고 분말 15g을 이중 증류수 1L에 첨가하여 LB 한천 용액을 준비하고 혼합물을 오토클레이브합니다. 100 μg/mL 리팜피신이 들어있는 따뜻한 LB 한천 용액을 부어 페트리 접시를 부피의 절반으로 채웁니다. 냉각된 고체 플레이트를 4°C에 보관합니다.
- BHI 분말 37g을 이중 증류수 1L로 용해시켜 세균균에 적합한 뇌 심장 주입(BHI) 국물을 준비합니다. pH를 7.2로 조정하고 자동 복제합니다.
- DMSO 용매에서 형광 프로브 디하이드로에티듐(DHE)을 용해하여 10mM 스톡 용액을 산출한다. 사용하기 전에 부드럽게 섞으세요.
참고: 재고 솔루션을 즉시 광 방지 바이알에 알리쿼트합니다. 재고 용액의 유통 기한은 -20 °C에서 6 개월입니다.
2. E44 박테리아 균주 제제
참고: E44는 리팜피신 저항을 가진 수막 대장균의 돌연변이 균주입니다.
- 저온 보존 된 E44 콜로니를 멸균 파이펫 끝으로 찍어 선을 그리면 100 μg / mL 리팜피신을 포함하는 LB 천지 판에 E44 변형을 접종하십시오. 플레이트를 인큐베이터에 거꾸로 넣고 하룻밤 사이에 37°C로 내려놓습니다.
- 실험 하루 전에 멸균 파이펫 팁이 있는 플레이트에서 E44 콜로니 1개를 선택하고 50mL 플라스크에 100 μg/mL 리팜피신을 함유한 BHI 국물의 5mL에 넣습니다. 인큐베이션 셰이커에서 17시간 동안 90rpm으로 세균 배양을 37°C에서 배양한다.
3. 인간의 말초 혈액에서 호중구의 격리
- 항응고를 위해 EDTA를 함유한 진공 혈액 수집 튜브에 정맥내 자원 봉사자로부터 혈액 샘플 5mL를 그립니다.
- 5 분 동안 500 x g에서 말초 혈액 샘플을 원심 분리합니다. 혈액 샘플은 원심분리에 의해 3층으로 나뉘며, 아래에서 위쪽으로는 적혈구(RBC) 층, 백혈구(WBC) 층 및 혈장 층이 순차적으로 된다.
- 3배 RBC 리시스 버퍼를 사용하여 새로운 튜브에 파이펫으로 백혈구 층을 흡인시합니다. 혼합물을 철저히 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배치하십시오.
- 5 분 동안 500 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 슈퍼 상체를 완전히 흡인하고 폐기하십시오.
- 침전이 흰색으로 바뀔 때까지 RBC 리시스 버퍼를 1-2번 반복합니다.
- PBS의 2mL로 침전을 다시 중단하여 세포를 세척한다. 그런 다음 300 x g에서 원심 분리기를 5 분 동안 사용하여 세포가 튜브의 바닥으로 정착할 수 있습니다.
- 미리 냉각된 자기 세포 선별 버퍼의 50 μL로 퇴적물을 재연하여 CD16 마이크로비드로 호중구를 라벨링합니다. 그런 다음 인간 CD16 마이크로비드의 50 μL과 완전히 섞는다. 혼합물을 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 세포 표면및 비특이적 라벨링에 대한 항체의 캡핑을 방지하기 위해 용액을 미리 냉각해야 합니다. 대부분의 성인은 혈액의 마이크로 리터 당 약 4,000에서 10,000 백혈구가, 그 중, 호중구는 대략 50-70%를 차지합니다. 추정에 따르면, 인간 말초 혈액의 5 mL에 있는 총 백혈구의수는 일반적으로 2-5 x 10 7까지입니다. - 4°C에서 자기 세포 선별 완충제 및 원심분리기 2mL, 10분 동안 300 x g를 추가하여 세포를 세척합니다. 상체를 완전히 버리고 500 μL의 정렬 버퍼로 침전을 다시 일시 중지합니다.
- 자기 컬럼을 조립하고 선반을 분리합니다. 분리기를 자기 기둥으로 선반으로 이동하고 3mL의 정렬 버퍼로 컬럼을 헹구습니다.
- 마그네틱 비즈에 의해 표지된 호중구가 자기 열에 부착되도록 세포 현탁액을 컬럼에 떨어뜨립니다.
- 3mL의 자기 세포 선별 버퍼를 3mL를 추가하여 라벨이 부착되지 않은 세포를 씻어 내고 매번 열 저장소가 비어 있는지 확인합니다.
- 자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 15mL 튜브에 놓습니다. 열에 자기 셀 정렬 버퍼 5mL을 추가합니다. 플런저를 사용하여 마그네틱 표지된 세포를 밀어내보아.
참고: 호중구의 순도를 향상시키기 위해 새 열을 사용하여 선별 단계를 반복할 수 있습니다. - 튜브를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상체를 완전히 버리고 배양 배지 1 mL로 침전을 다시 중단합니다. 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 결정하고 추가 실험을 위해 세포를 준비합니다.
4. 로스 의 측정
- 원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 300 x g로 분리된 호중구를 재연하고, 5μM DHE 형광 프로브를 포함하는 배양 배지로 세포 농도를 2 x 10 6/mL로 조절한다.
- 37°C에서 호중구를 30분 동안 배양하여 DHE 프로브를 적재한 다음, 잘 200 μL을 가진 96웰 의 검은 폴리스티렌 마이크로플레이트에 세포 현탁액을 할당한다.
- 마이크로 플레이트 판독기를 켜고 감지 소프트웨어를 엽니다. 불투명 한 96 웰 플레이트 형식을 선택하고 판독 영역을 결정합니다.
- 37°C에서 60분 동안 5분마다 운동 모드(Ex/Em = 518/605 nm)로 형광(Ex/Em = 518/605 nm)을 설정합니다. 각 읽기 전에 3 s에 대 한 접시를 흔들어 있는지 확인 합니다.
- 인큐베이터에서 마이크로 플레이트를 꺼내, 배양된 E44(MOI=100) 또는 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (100 ng/mL)를 3개의 복제를 함유한 전부하된 호중구를 각각 함유하고 있다. PMA를 긍정적인 컨트롤로 사용합니다.
- 접시를 마이크로 플레이트 판독기에 놓고 즉시 분석서를 시작합니다.
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Representative Results
이 문서에 설명된 프로토콜을 사용하여, 호중구는 인간 말초 혈액에서 격리되고 E44 감염에 응하여 ROS 수준의 변경을 검출하기 위하여 형광 프로브 DHE로 로드되었습니다. 여기서, 우리는 실시간으로 마이크로 플레이트 판독기에 의해 결정된 E44 균주에 의해 생성된 ROS 생산을 보여주는 대표적인 데이터를 제공합니다. 100의 MOI에서 E44 균주를 첨가함으로써 ROS 수치가 즉시 증가하고 시간 의존적 방식으로 연속 상승 추세를보였다(도 1). 호중구에서 세포내 ROS의 잘 알려진 ROS 유도기인 PMA를 추가하여 초기 단계에서 평평한 곡선을 제시하는 S자형 곡선을 관찰한 후 20분에서 40분으로 크게 증가하여 60분(그림1)으로정점을 찍었습니다.
그림 1. 뇌막대장균에감염된 호중구에서의 시간 의존적인 ROS 생산. 인간 말초 혈액으로부터 분리된 호중구는 DHE 염료로 적재되었고, E44 균주(MOI=100)가 첨가되었고, 평균 형광 강도(MFI)는 마이크로플레이트 판독기로 즉시 결정되었다. PMA (100 ng/mL)로 처리된 호중구는 양성 대조군으로 사용되었다. 모든 데이터는 상대DHE 강도를 얻기 위해 초기 값으로 정규화되었고 평균 ± SEM(n = 3)으로 제시되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
호중구는 인간의 혈액 순환에서 백혈구의 가장 풍부한 구성 요소역할을합니다. 그(것)들은 병원체 의 침략에 대하여 방어의 첫번째 선을 구축하는 타고난 인간 면역 계통에 있는 중요한 이펙터 세포입니다(11). ROS의 생성은 phagocytosis11다음호중구의 주요 bactericidal 기계장치 중 하나를 나타낸다. 최근 연구에 따르면 호중구 세포 외 트랩(NET)이라고 불리는 호중구에 의해 방출된 순과 같은 구조도6,11,12의박테리아 살해 과정에 관여하는 것으로 나타났다.
병원성 미생물의 자극에 의해 유도된 호중구에 의해 생성된 ROS는 주로 2개의 막 결합 서브유닛(gp91 phox 및 p22phox)과3개의 세포소 서브유닛(p47phox, p67phox및 p40phox)으로구성된 NADPH 산화제의 활성화에 기인하는 것으로보고되었습니다. 침몰한 박테리아는 단백질 키나아제 C(PKC), 단백질 키나아제 A(PKA), 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 등 호중구 내부의 키나아제 시리즈를 활성화하여, 나드PH 산화제의 세포소 소단위 p47포이를 인광하는 것을 유도한다. 그런 다음 p47포스,p67포제및 p40포로 구성된 사이토솔트리머를 멤브레인 결합 서브유닛 gp91포스와 p22포스와결합하여 전체 NADPH 산화제 복합체를 형성한다. 조립된 NADPH 산화제 복합체는 NADPH 유래 전자를 분자 O2로이송하여, 초옥화물 음이온을 생성하고 바액테리시달기능(13,14,15)을활성화한다. 또한 호중구에 의해 생성된 ROS가호중구(16,17)의 순 형성과도 연관될 수 있다고보고된다. 따라서, ROS 생산의 검출은 호중구의 살균 기전의 추가 연구에 기여할 것입니다.
이 프로토콜에서, 말초 혈액에서 분리된 호중구는 형광 프로브 DHE로 미리 로드되고 96웰의 검은 폴리스티렌 마이크로플레이트에 할당됩니다. ROS 강도는 수막 대장균이 첨가된 후 마이크로플레이트 판독기에서 실시간으로 검출된다.
수집된 혈액은18을보완하여 호중구의 활성화를 피하기 위해 EDTA 또는 구연산염을 사용하여 항응고된다. 호중구는 말기 분화되고 순환 혈액에서 짧은 수명(약 4-8시간)을 가지므로, 격리 단계는 혈액 수집 후 가능한 한 빨리 수행되어야한다(19). 피콜-하이팩 및 퍼콜과 같은 많은 격리 시약은 말초혈액11,19,20에서호중구를 격리하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, 호중구는 말초 혈액에서 적혈구 용해 후에 CD16 microbead 선택에 의해 격리됩니다. 속도, 단순성 및 순도가 크게 향상되었습니다. 순수 호중구를 얻기 위해, 밀도 그라데이션 원심분리는 CD16 자기 구슬로 격리되기 전에 적용될 수 있었다.
다수의 인식형 형광 프로브, 디하이드로에티듐 (DHE), 2', 7'디클로로디하이드로플루오레세신 (H2DCF-DA) 및 디하이드로로로다민 (DHR)과 같은 세포 막을 자유롭게 통과, 흐름 세포 내 ROS의 결정에 사용할 수 있습니다, 공초점 미세 검사 또는 마이크로 플레이트 판독기21, 21,21. 마이크로 플레이트 판독기와 DHE 형광 프로브의 검출 외에도, 유동 세포측정 및 공초점 현미경 검사는 또한 호중구에서 ROS 생산을 측정하기 위해 표시 된 시점에서 DHE의 형광 강도의 변화를 검출하는 데 사용될 수있다.
이 프로토콜은 ROS 생산을 실시간으로 검출하는 쉬운 방법을 제공하며 병원성 미생물에 감염된 숙주 포유류 세포에서 ROS 생성을 검출하기 위해 다양한 시나리오에서 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이나 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31670845, 31870832, 320008111)과 랴오닝성 우수교수(LJH2018-35)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S.
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J.
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S.
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
