Summary
大肠杆菌 是新生儿革兰阴性细菌性脑膜炎的主要原因。在细菌感染期间，中性粒细胞产生的活性氧物种起着主要的杀菌作用。在这里，我们介绍了一种检测中性粒细胞中反应性氧物种以应对 大肠杆菌脑膜炎的方法。
Abstract
大肠杆菌 （大肠杆菌）是导致新生儿脑膜炎的最常见革兰阴性细菌。细菌血症的发生和细菌通过血脑屏障的渗透是 大肠杆菌 脑膜炎发展的不可或缺的步骤。活性氧物种（ROS）是中性粒细胞破坏入侵病原体的主要杀菌机制。在本协议中，使用实时荧光微板读卡器检测到的荧光 ROS 探头对感染脑膜 大肠杆菌 的嗜中性粒细胞内 ROS 生产的时间依赖性 ROS 进行量化。该方法还可用于在病原体-宿主相互作用期间评估哺乳动物细胞中的ROS生产。
Introduction
新生儿细菌性脑膜炎是一种常见的儿科传染病。大肠杆菌（大肠杆菌）与K1胶囊是最常见的革兰阴性病原体引起新生儿细菌性脑膜炎，约占总发病率的80%1，2，3。尽管抗菌化疗和支持性护理取得了进展，但细菌性脑膜炎仍然是发病率高、死亡率最高的疾病之一。
新生儿细菌性脑膜炎的发生通常从致病菌从新生儿的局部病变进入周围循环引起的细菌血症开始，然后通过血脑屏障（BBB）渗透到大脑中，导致脑膜炎。细菌血症的发病取决于细菌与宿主免疫细胞（包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞等）之间的相互作用。中性粒细胞占白细胞的50-70%，是抵御细菌感染的第一道防线。在细菌入侵期间，活性嗜中性粒细胞被招募到传染性部位并释放活性氧物种（ROS），包括超氧化物离子、过氧化氢、羟基基和单氧7。ROS对细菌的细胞膜、核酸分子和蛋白质进行氧化反应，导致入侵细菌8的损伤和死亡。线粒体是俄罗斯在真核细胞中生产的主要场所，各种氧化物（如烟酰胺腺苷二氯酰胺磷酸盐（NADPH）氧化酶复合物、脂氧酶系统、蛋白激酶C和环氧酶酶系统）调解了ROS9、10的生产。代表中性粒细胞中主要抗菌机制的ROS生产的实时测量，是研究细菌与宿主相互作用期间宿主防御的有用方法。
在此协议中，受脑膜性大肠杆菌 感染的嗜中性粒细胞中依赖时间的 ROS 生产用荧光 ROS 探头 DHE 进行量化，该探测器由实时荧光微板读卡器检测到。在病原体与宿主相互作用期间，此方法还可用于评估其他哺乳动物细胞中的 ROS 生产。
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Protocol
本研究中应用的志愿者外周血液经中国医科大学第一医院机构评审委员会批准（#2020-2020-237-2）。
1. 试剂和文化介质的制备
- 通过添加 8.29 克 NH4Cl、1 克 KHCO 3、37.2 毫克 Na2EDTA 添加到 1 升双蒸馏水中，将 pH 值调整为 7.2-7.4，从而准备红细胞裂解缓冲器。使用 0.22 μm 过滤器过滤细菌。
- 通过在RPMI 1640介质中加入5%的胎儿牛血清，并在4°C储存，为嗜中性粒细胞准备实验培养介质。 使用前与室温均衡。
注：使用RPMI 1640介质，无酚红色。 - 通过在 1 L 玻璃瓶中加入 8 克 NaCl、0.2 克 KCl、1.44 克 Na2HPO4+2H2O 和 0.2 g KH2PO4 加入 1 升双蒸馏水来准备磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。将pH口调整为7.2-7.4。在 121 °C 时自动将其高压 15 分钟。
- 通过在 10 mL 的二甲基硫氧化物 （DMSO） 中溶解 0.5 克里芬霉素粉末来制备里芬平溶液，从而产生 50 毫克/mL 的利芬平溶液。
- 通过加入 10 克 NaCl、10 克 tryptone、5 克酵母提取物和 15 克 agar 粉末加入 1 升双蒸馏水并高压灭菌混合物来准备 LB agar 解决方案。通过浇灌含有 100μg/mL 里芬平的温暖 LB agar 溶液，将培养皿填充到体积的一半。将冷却的固体板存放在 4 °C。
- 通过将 37 克 BHI 粉末溶解到 1 升双蒸馏水中，准备适合细菌菌株的脑心输液 （BHI） 汤。将pH度调整到7.2并将其高压灭菌。
- 溶解 DMSO 溶剂中的荧光探头二氢二氧化氢 （DHE），产生 10 mM 库存溶液。使用前轻轻混合。
注：阿里立即将库存溶液引用到防光小瓶中。库存解决方案的保质期为 -6 个月-20 °C。
2. E44细菌菌株的制备
注：E44是一种具有利芬霉素耐药性的脑膜大肠杆菌 突变菌株。
- 用无菌移液器尖滴入冷冻保存的 E44 菌落，通过绘制线条在含有 100μg/mL rifampicin 的 LB agar 板上接种 E44 菌株。将盘子倒置在37°C的孵化器中过夜。
- 在实验的前一天，用无菌移液器尖端从盘子中挑选一个E44菌落，并将其放入500微升的BHI汤中，在50升的烧瓶中含有100微克/mL里芬平。在 37 °C 的孵化细菌培养中，在孵化摇床中以 90 rpm 的 17 小时为 17 小时。
3. 将嗜中性粒细胞与人类外围血液隔离
- 将志愿者静脉注射的5mL血液样本抽到含有EDTA的真空采血管中进行抗凝。
- 以 500 x g 的速度将外周血液样本离心 5 分钟。血液样本按离心分三层，从下到上依次为红血球（RBC）层、白血球（WBC）层和血浆层。
- 用管道将白血球层吸气到带有 3 倍 RBC 裂解缓冲器的新管子上。将混合物彻底混合，在室温下放置5分钟。
- 将管子在500 x g 下离心5分钟。完全吸气超自然人并丢弃。
- 用 RBC 裂解缓冲器重复裂解过程 1-2 次，直到沉淀物变白。
- 用 2 mL 的 PBS 重新悬念沉淀细胞来清洗细胞。然后离心机在300 x g 下5分钟，让细胞沉淀到管子底部。
- 用CD16微珠标记嗜中性粒细胞，用50μL的预制磁细胞分拣缓冲器重新悬念沉积物。然后与 50 μL 的人类 CD16 微珠彻底混合。在 4 °C 下孵育混合物 30 分钟。
注意：应预先冷却解决方案，以防止在细胞表面和非特定标签上封盖抗体。大多数成年人每微升血液中约有4，000至10，000个白血球，其中中性粒细胞约占50-70%。据估计，人类外周血5mL中白血球总数通常高达2-5×107。 - 在 4 °C、300 x g 下添加 2 mL 的磁性电池分拣缓冲器和离心机，在 10 分钟内清洗电池。完全丢弃超自然物，用 500 μL 的分拣缓冲器重新吸收沉淀物。
- 组装磁柱并分离架子。用磁柱将分离器移到架子上，然后用 3 mL 的分拣缓冲器冲洗柱子。
- 将细胞悬架放入柱中，使磁珠标记的嗜中性粒细胞附着在磁柱上。
- 通过添加 3 mL 的磁电池分拣缓冲区 3 次来洗掉未标记的细胞，确保柱储液层每次都是空的。
- 从磁分离器中取出柱子，并将其放在 15 mL 管上。将 5 mL 的磁电池分拣缓冲区添加到列中。使用柱塞推出磁性标记单元。
注意：为了提高嗜中性粒细胞的纯度，可以使用新列重复分拣步骤。 - 在300 x g 下将管子离心5分钟，完全丢弃超母体，用1mL的培养介质重新注入沉淀物。用细胞计数器确定细胞编号，并准备细胞进行进一步实验。
4. 罗斯的测量
- 将分离的嗜中性粒细胞在300 x g 中分离5分钟，恢复沉淀物，并将细胞浓度调整为2 x 106/mL，培养介质包含5μM DHE荧光探针。
- 在 37 °C 下孵育嗜中性粒细胞 30 分钟以加载 DHE 探头，然后将细胞悬架分配给每口井 200μL 的 96 井黑色聚苯乙烯微板。
- 打开微板读卡器并打开检测软件。选择不透明的 96 井板格式并确定阅读区域。
- 将荧光（Ex/Em = 518/605 nm）设置为动能模式，每 5 分钟 60 分钟，在 37 °C。 每次阅读前，请务必将盘子摇动3次。
- 从孵化器中取出微板，将培养的 E44 （MOI=100） 或 phorbol 12-肌酸酯 13 醋酸盐 （PMA） （100 ng/mL） 添加到每个含有预装嗜中性粒细胞的井中，并具有 3 个复制品。使用PMA作为正控。
- 将盘子放在微板读卡器中，并立即开始检测。
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Representative Results
使用本文概述的协议，嗜中性粒细胞从人类外周血液中分离出来，并装载荧光探头 DHE，以检测针对 E44 感染的 ROS 水平的变化。在这里，我们提供具有代表性的数据，演示由微板读卡器实时确定的 E44 菌株引起的 ROS 生产。通过在 100 的 MOI 中添加 E44 菌株，ROS 水平立即增加，并以时间依赖的方式呈现持续上升趋势（图 1）。通过添加PMA，一个众所周知的中性粒体细胞内ROS的ROS诱导器，我们观察到一个S形曲线，在初始阶段呈现一个扁平的曲线，然后从20分钟到40分钟显著增加，最后在60分钟达到峰值（图1）。
图1。时间依赖的ROS生产中性粒细胞感染脑膜大 肠杆菌。 从人类外周血液中分离出的嗜中性粒细胞装有DHE染料，添加了E44菌株（MOI=100），并立即用微板读卡器确定平均荧光强度（MFI）。使用PMA（100 ng/mL）治疗的嗜中性粒细胞被用作阳性控制。所有数据均正常化到初始值，以获得相对的 DHE 强度，并作为 平均 ± SEM （n = 3） 呈现。 请单击此处查看此图的更大版本。
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Discussion
嗜中性粒细胞是人类血液循环中白血球最丰富的成分。它们是先天人类免疫系统中的重要效应细胞，是抵御病原体入侵的第一道防线。ROS的产生代表了11号噬菌体病后嗜中性粒细胞的主要杀菌机制之一。最近的研究表明，一种名为中性粒细胞外陷阱（NET）的中性粒细胞释放出的网状结构也参与了细菌杀灭过程6、11、12。
据报道，由致病微生物刺激诱导的嗜中性粒细胞产生的ROS主要由NADPH氧化酶的活化引起，该酶由两个膜结合亚单位（gp91phox和p22phox）和三个细胞子单位（p47phox、p67phox和p40phox）5组成。被吞没的细菌激活了中性粒细胞内的一系列激酶，如蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）和线粒体激活蛋白激酶（MAPK），这些激酶会磷酸化NADPH氧化酶的细胞亚单位p47phox。然后由p47磷、p67phox和p40磷组成的细胞溶胶修剪器转移到膜上，与膜结合亚单位gp91phox和p22phox，形成完整的NADPH氧化酶复合物。组装的NADPH氧化酶复合物将NADPH衍生的电子转移到分子O2，产生超氧化物阳离子，激活杀菌功能13、14、15。另据报道，由中性粒细胞产生的ROS也可能与中性粒细胞16、17的NET形成有关。因此，对ROS生产的检测将有助于进一步研究嗜中性粒细胞的杀菌机理。
在此协议中，从外周血液中分离出的嗜中性粒细胞预装荧光探头DHE，并分配给96井黑色聚苯乙烯微板。加入脑膜大肠杆菌 后，微板读卡器可实时检测到ROS强度。
收集的血液是使用EDTA或柠檬酸盐进行抗凝固，以避免中性粒细胞的活化补充18。由于嗜中性粒细胞是绝缘分化的，在循环血液中寿命短（约4-8小时），隔离步骤应在采集血液后尽快完成。许多分离的试剂，如菲科尔-海帕克和珀科尔，已经被用来隔离中性粒细胞从外周血液11，19，20。在此协议中，中性粒细胞在红细胞从外周血液溶解后，通过CD16微珠选择进行分离。它在速度、简单性和纯度方面提供了显著的改进。为了获得更纯净的嗜中性粒细胞，可以在与CD16磁珠隔离之前应用密度梯度离心。
一些公认的荧光探头，如二氢二氧化氢（DHE），2'， 7'-二氯二氢氟西汀二乙酸酯（H2DCF-DA）和二氢氢胺123（DHR）可自由通过细胞膜，可用于通过流动细胞测量、共聚焦显微镜或显微板读卡器21、22、23、24来测定细胞内ROS。除了使用显微板读卡器检测 DHE 荧光探头外，流细胞学和共焦显微镜还可用于检测指示时间点 DHE 荧光强度的变化，以测量中性粒细胞中的 ROS 生产。
该协议为实时检测 ROS 生产提供了更简单的方法，可用于各种场景，以检测感染致病微生物的宿主哺乳动物细胞中的 ROS 生成。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（31670845、31870832、32000811）和辽宁省杰出教授项目（LJH2018-35）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
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