Summary
Escherichia coli é a principal causa de meningite bacteriana gram-negativa neonatal. Durante a infecção bacteriana, espécies reativas de oxigênio produzidas por neutrófilos desempenham um papel bactericida importante. Aqui introduzimos um método para detectar as espécies reativas de oxigênio em neutrófilos em resposta à meningite E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) é a bactéria gram-negativa mais comum que causa meningite neonatal. A ocorrência de bacteremia e penetração bacteriana através da barreira hemencefálica são passos indispensáveis para o desenvolvimento da meningite E. coli. As espécies reativas de oxigênio (ROS) representam os principais mecanismos bactericidas dos neutrófilos para destruir os patógenos invadidos. Neste protocolo, a produção de ROS intracelular dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli foi quantificada por sondas ROS fluorescentes detectadas por um leitor de microplaca de fluorescência em tempo real. Este método também pode ser aplicado à avaliação da produção de ROS em células de mamíferos durante interações patógenos-hospedeiros.
Introduction
Meningite bacteriana neonatal é uma doença infecciosa pediátrica comum. Escherichia coli (E. coli) com uma cápsula K1 é o patógeno Gram-negativo mais comum que causa meningite bacteriana neonatal, representando cerca de 80% da incidência total1,2,3. Apesar dos avanços na quimioterapia antimicrobiana e no cuidado de apoio, a meningite bacteriana ainda é uma das condições mais devastadoras com alta morbidade e mortalidade4.
A ocorrência de meningite bacteriana neonatal geralmente começa com a bacteremia causada pela entrada de bactérias patogênicas na circulação periférica das lesões locais dos recém-nascidos, seguida pela penetração através da barreira hemoencefálica (BBB) no cérebro, resultando na inflamação das meninges4. O surgimento da bacteremia depende da interação entre bactérias e células imunes hospedeiras, incluindo neutrófilos e macrófagos, etc. Os neutrófilos, que respondem por ~50-70% dos glóbulos brancos, são a primeira linha de defesa contra infecções bacterianas5,6. Durante a invasão de bactérias, os neutrófilos ativados são recrutados para os locais infecciosos e liberam espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo o ânion de superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidróxil e oxigênio singlet7. O ROS sofre reações redox com a membrana celular, moléculas de ácido nucleico e proteínas da bactéria, resultando na lesão e morte da bactéria invasora8. A mitocôndria é o principal local da produção de ROS em células eucarióticas, e várias oxidases (por exemplo, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) complexo oxidase, sistema lipoxygenase, proteína quinase C e sistema ciclooxygenase) mediam a produção de ROS9,10. A medição em tempo real da produção de ROS, representando o principal mecanismo antimicrobiano em neutrófilos, é um método útil para estudar a defesa hospedeira durante a interação bactérias-hospedeiras.
Neste protocolo, a produção de ROS dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli foi quantificada com uma sonda ROS fluorescente DHE, detectada por um leitor de microplaca de fluorescência em tempo real. Este método também pode ser aplicado à avaliação da produção de ROS em outras células mamíferas durante a interação patógeno-hospedeiro.
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Protocol
O sangue periférico dos voluntários aplicado nesta pesquisa foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do primeiro Hospital da Universidade Médica da China (#2020-2020-237-2).
1. Preparação de reagentes e meio de cultura
- Prepare o tampão de lise de glóbulos vermelhos adicionando 8,29 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3, 37,2 mgs de Na2EDTA em 1 L de água dupla destilada e ajuste o pH para 7,2-7.4. Remova as bactérias por filtragem usando filtros de 0,22 μm.
- Prepare o meio de cultura experimental para neutrófilos adicionando 5% de soro bovino fetal ao meio RPMI 1640 e armazene a 4 °C. Equilibre-se à temperatura ambiente antes de usar.
NOTA: Use o meio RPMI 1640 sem vermelho fenol. - Prepare o soro fisco tampão de fosfato (PBS) adicionando 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4·2H2O e 0,2 g de KH2PO4 em 1 L de água dupla destilada em um frasco de vidro 1 L. Ajuste o pH para 7,2-7.4. Autoclave-o por 15 min a 121 °C.
- Prepare a solução de rifampicina dissolvendo 0,5 g de pó de rifampicina em 10 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO) para produzir uma solução de rifampicina de 50 mg/mL.
- Prepare a solução de ágar LB adicionando 10 g de NaCl, 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 15 g de ágar em pó em 1 L de água dupla destilada e autoclave a mistura. Encha as placas de Petri à metade do volume, derramando solução de ágar LB quente contendo 100 μg/mL rifampicina. Armazene a placa sólida resfriada a 4 °C.
- Prepare o caldo de infusão do coração cerebral (BHI) apropriado para cepas bacterianas, dissolvendo 37 g de pó BHI em 1 L de água dupla destilada. Ajuste o pH para 7.2 e autoclave-o.
- Dissolva a sonda fluorescente dihidroedicium (DHE) em solvente DMSO para produzir uma solução de estoque de 10 mM. Misture delicadamente antes de usar.
NOTA: Aliquot a solução de ações imediatamente em frascos à prova de luz. O prazo de validade da solução de ações é de 6 meses a -20 °C.
2. Preparação da cepa de bactérias E44
NOTA: E44 é uma cepa mutante de meningite E. coli com resistência à rifampicina.
- Mergulhe a colônia criopreservada E44 com uma ponta de pipeta estéril, inocular a cepa E44 na placa de ágar LB contendo 100 μg/mL rifampicina por linhas de desenho. Coloque a placa de cabeça para baixo na incubadora a 37 °C durante a noite.
- Um dia antes do experimento, escolha uma colônia E44 da placa com uma ponta de pipeta estéril e coloque-a em 5 mL de caldo BHI contendo 100 μg/mL rifampicina em um frasco de 50 mL. Incubar a cultura bacteriana a 37 °C com 90 rpm por 17 h em um shaker de incubação.
3. Isolamento de neutrófilos do sangue periférico humano
- Retire 5 mL de amostra de sangue de voluntários por via intravenosa para o tubo de coleta de sangue de vácuo contendo EDTA para anticoagulação.
- Centrifugar as amostras de sangue periférico a 500 x g por 5 min. As amostras de sangue são divididas em três camadas por centrifugação, que de baixo para cima são a camada de glóbulos vermelhos (RBC), a camada de glóbulos brancos (WBC) e a camada plasmática, sequencialmente.
- Aspire a camada de glóbulos brancos com uma tubulação em um novo tubo com tampão de lise RBC 3x. Misture bem a mistura e coloque em temperatura ambiente por 5 minutos.
- Centrifugar o tubo a 500 x g por 5 min. Aspire completamente o supernatante e descarte.
- Repita o procedimento de lise com tampão de lise RBC 1-2 vezes, até que o precipitado fique branco.
- Lave as células reutilizando o precipitado com 2 mL de PBS. Em seguida, centrífuga a 300 x g por 5 minutos para deixar as células se acalmarem até o fundo do tubo.
- Rotule os neutrófilos com microesferas CD16 reutilizando o sedimento com 50 μL de tampão de classificação de células magnéticas pré-cozidos. Em seguida, misture com 50 μL de microesferas CD16 humanas completamente. Incubar a mistura a 4 °C por 30 min.
NOTA: As soluções devem ser pré-resfriadas para evitar o corte de anticorpos na superfície celular e rotulagem não específica. A maioria dos adultos tem cerca de 4.000 a 10.000 glóbulos brancos por microliter de sangue, entre os quais, os neutrófilos representam aproximadamente 50-70%. Por estimativa, as contagens de glóbulos brancos totais em 5 mL de sangue periférico humano são geralmente até 2-5 x 107. - Lave as células adicionando 2 mL de tampão de classificação de células magnéticas e centrífuga a 4 °C, 300 x g por 10 min. Descarte o supernatante completamente e resuspenque o precipitado com 500 μL de tampão de classificação.
- Monte a coluna magnética e a prateleira de separação. Mova o separador para a prateleira com a coluna magnética e enxágue a coluna com 3 mL de tampão de classificação.
- Solte a suspensão celular na coluna para permitir que os neutrófilos rotulados pelas contas magnéticas se conectem à coluna magnética.
- Lave as células não rotuladas adicionando 3 mL de tampão de classificação de células magnéticas 3 vezes, certificando-se de que o reservatório da coluna está vazio cada vez.
- Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de tampão de classificação de células magnéticas à coluna. Empurre as células magnéticas rotuladas usando um êmbolo.
NOTA: Para melhorar a pureza dos neutrófilos, as etapas de classificação podem ser repetidas usando uma nova coluna. - Centrifugar o tubo a 300 x g por 5 min, descartar o supernasal completamente e resuspensar o precipitado com 1 mL de meio de cultura. Determine o número da célula com um contador celular e prepare as células para mais experimentos.
4. Medição de ROS
- Centrifugar os neutrófilos isolados a 300 x g por 5 min, resuspensar o precipitado e ajustar a concentração celular para 2 x 106/mL com meio de cultura contendo 5 μM SONDA de fluorescência DHE.
- Incubar os neutrófilos a 37 °C por 30 minutos para carregar a sonda DHE e, em seguida, alocar a suspensão celular para uma microplata de poliestireno preto de 96 poços com 200 μL por poço.
- Ligue o leitor de microplacão e abra o software de detecção. Escolha o formato opaco da placa de 96 poços e determine a área de leitura.
- Ajuste a fluorescência (Ex/Em = 518/605 nm) no modo cinético a cada 5 minutos para 60 min a 37 °C. Certifique-se de agitar a placa por 3 s antes de cada leitura.
- Retire a microplaca da incubadora, adicione o E44 cultivado (MOI=100) ou phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) a cada poço contendo neutrófilos pré-carregados com 3 réplicas. Use o PMA como um controle positivo.
- Coloque a placa no leitor de microplacão e inicie o ensaio imediatamente.
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Representative Results
Utilizando o protocolo descrito neste artigo, os neutrófilos foram isolados do sangue periférico humano e carregados com sonda de fluorescência DHE para detectar as alterações dos níveis de ROS em resposta à infecção pelo E44. Aqui, fornecemos dados representativos que demonstram a produção ROS evocada pela cepa E44 determinada por um leitor de microplapes em tempo real. Adicionando cepas E44 a um MOI de 100, os níveis de ROS aumentaram imediatamente e mostraram uma tendência contínua de alta com uma maneira dependente do tempo(Figura 1). Adicionando PMA, um conhecido indutor ROS de ROS intracelular em neutrófilos, observamos uma curva em forma de S que apresenta uma curva plana na fase inicial seguida de um aumento significativo de 20 min para 40 min e finalmente atingindo 60 min(Figura 1).
Figura 1. Produção de ROS dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli. Os neutrófilos isolados do sangue periférico humano foram carregados com corante DHE, uma cepa E44 (MOI=100) foi adicionada, e a intensidade média de fluorescência (IMFI) foi determinada imediatamente com um leitor de microplaca. Os neutrófilos tratados com PMA (100 ng/mL) foram utilizados como controle positivo. Todos os dados foram normalizados ao valor inicial para obtenção da intensidade relativa do DHE e apresentados como média ± SEM (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os neutrófilos agem como o componente mais abundante dos glóbulos brancos na circulação sanguínea humana. São importantes células efeitos no sistema imunológico humano inato, que constrói a primeira linha de defesa contra a invasão de patógenos11. A geração de ROS representa um dos principais mecanismos bactericidas de neutrófilos após a fagocitose11. Estudos recentes mostraram que uma estrutura semelhante a uma rede liberada por um neutrófilo chamado armadilha extracelular de neutrófilo (NET) também está envolvida no processo de morte de bactérias6,11,12.
Foi relatado que a ROS produzida por neutrófilos induzidos pela estimulação de microrganismos patogênicos são causadas principalmente pela ativação do NADPH oxidase, que é composto por duas subunidades de ligação de membrana(fóxi gp91 ep22 phox) e três subunidades citotómicas(foxp47, p67phox, e p40phox)5. As bactérias engolfadas ativam uma série de quinases dentro dos neutrófilos, como proteína quinase C (PKC), proteína quinase A (PKA) e proteína ativada por mitogênio quinase (MAPK), que fosforilolato as subunidades citotódicos p47phox de NADPH oxidase. Em seguida, um trimer citosolítico composto defoxp47 ,p67 phox, e p40phox transloca para a membrana para combinar com a membrana de ligação de tíxuno gp91phox ep22 phox,formando o complexo oxidase NADPH completo. O complexo oxidase nadph montado transfere elétrons derivados do NADPH para o molecular O2,gerando ânions de superóxido e ativando as funções bactericidas13,14,15. Também é relatado que a ROS produzida por neutrófilos também pode estar associada à formação líquida de neutrófilos16,17. Portanto, a detecção da produção de ROS contribuiria para o estudo mais aprofundado do mecanismo bactericida de neutrófilos.
Neste protocolo, os neutrófilos isolados do sangue periférico são pré-carregados com sonda de fluorescência DHE e alocados em uma microplaca de poliestireno preto de 96 poços. A intensidade ros é detectada por um leitor de microplaca em tempo real após a adição de meningite escherichia coli.
O sangue coletado é antiagulado usando EDTA ou citrato para evitar a ativação de neutrófilos por complemento18. Como os neutrófilos são terminantemente diferenciados e têm um curto tempo de vida (cerca de 4-8 horas) no sangue circulante, as etapas de isolamento devem ser feitas o mais rápido possível após a coleta de sangue19. Muitos reagentes isolantes, como Ficoll-Hypaque e Percoll, têm sido usados para isolar neutrófilos do sangue periférico11,19,20. Neste protocolo, os neutrófilos são isolados pela seleção de microesferas CD16 após a lise eritrócito do sangue periférico. Oferece melhorias significativas na velocidade, simplicidade e pureza. Para obter neutrófilos mais puros, uma centrifugação gradiente de densidade poderia ser aplicada antes do isolamento com contas magnéticas CD16.
Uma série de sondas fluorescentes reconhecidas, como dihidroendiidium (DHE), 2', 7'dichlorodihydrofluoresceto (H2DCF-DA) e dihidrorhodamina 123 (DHR) que passam pela membrana celular livremente, podem ser usados para a determinação da ROS intracelular por citometria de fluxo, microscopia confocal ou leitor de microplaca21,22,23,24. Além da detecção da sonda de fluorescência DHE com leitor de microplaca, citometria de fluxo e microscopia confocal também poderiam ser usadas para detectar as alterações da intensidade de fluorescência de DHE nos pontos de tempo indicados para medir a produção de ROS em neutrófilos.
Este protocolo fornece uma maneira mais fácil para a detecção da produção de ROS de forma em tempo real e pode ser usado em uma variedade de cenários para detectar a geração ROS em células de mamíferos hospedeiros infectadas com microrganismos patogênicos.
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Disclosures
Os autores declaram não interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31670845, 31870832, 32000811) e pelo Programa de Distinto Professor da Província de Liaoning (LJH2018-35).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
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