Summary
Escherichia coli הוא הגורם המוביל לדלקת קרום המוח חיידקית גראם שלילית יילודים. במהלך הזיהום החיידקי, מיני חמצן תגובתי המיוצר על ידי נויטרופילים לשחק תפקיד bactericidal גדול. כאן אנו מציגים שיטה לגילוי מינים חמצן תגובתי נויטרופילים בתגובה דלקת קרום המוח E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) הוא החיידק הגרם שלילי הנפוץ ביותר הגורם לדלקת קרום המוח יילודים. המופע של חיידקים וחדירה חיידקית דרך מחסום הדם - מוח הם צעדים הכרחיים להתפתחות של דלקת קרום המוח E. coli. מינים תגובתיים של חמצן (ROS) מייצגים את המנגנונים הבקטריואידיים העיקריים של נויטרופילים כדי להשמיד את הפתוגנים הפולשים. בפרוטוקול זה, ייצור ROS תאיים תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה לכמת באמצעות בדיקות ROS פלואורסצנטי זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה לחול גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים במהלך אינטראקציות מארח פתוגן.
Introduction
דלקת קרום המוח חיידקית יילודים היא מחלה זיהומית בילדים נפוצה. Escherichia coli (E. coli) עם כמוסה K1 הוא הפתוגן הגרם שלילי הנפוץ ביותר גורם דלקת קרום המוח חיידקי יילודים, המהווה כ 80% מכלל השכיחות1,2,3. למרות ההתקדמות בכימותרפיה מיקרוביאלית וטיפול תומך, דלקת קרום המוח חיידקית היא עדיין אחד התנאים ההרסניים ביותר עם תחלואה גבוההותמותה 4.
המופע של דלקת קרום המוח חיידקי יילודים בדרך כלל מתחיל עם חיידקים הנגרמים על ידי כניסת חיידקים פתוגניים לתוך זרימת הדם ההיקפית מן הנגעים המקומיים של התינוקות, ואחריו חדירה דרך מחסום הדם - מוח (BBB) לתוך המוח, וכתוצאה מכך דלקת של קרום המוח4. הופעת החיידק תלויה באינטראקציה בין חיידקים לתאי חיסון מארחים כולל נויטרופילים ומאקרופאגים וכו '. נויטרופילים, המהווים ~ 50-70% מתאי הדם הלבנים, הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים חיידקיים5,6. במהלך הפלישה של חיידקים, נויטרופילים מופעל מגויסים לאתרים זיהומיות ולשחרר מינים חמצן תגובתי (ROS) כולל אניון סופראוקסיד, מי חמצן, רדיקלים הידרוקסיל, וחמצןסינגלט 7. ROS לעבור תגובות redox עם קרום התא, מולקולות חומצת גרעין וחלבונים של החיידקים, וכתוצאה מכך פציעה ומוות של חיידקים פולשים8. המיטוכונדריה היא האתר העיקרי של ייצור ROS בתאים אוקריוטיים, ואוקסידאזים שונים (למשל, ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט (NADPH) קומפלקס אוקסידאז, מערכת ליפוקסיגנאז, חלבון קינאז C ומערכת ציקלואוקסיגניאז) מתווכים את הייצור של ROS9,10. המדידה בזמן אמת של הייצור של ROS, המייצג את המנגנון האנטי מיקרוביאלית העיקרית נויטרופילים, היא שיטה שימושית לחקר ההגנה המארחת במהלך האינטראקציה חיידקים מארח.
בפרוטוקול זה, ייצור ROS תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה מכמת עם DHE בדיקה ROS פלואורסצנטי, זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה להיות מיושמת גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים אחרים במהלך האינטראקציה פתוגן מארח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דם היקפי ממתנדבים המיושמים במחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים הראשון של האוניברסיטה הרפואית של סין (#2020-2020-237-2).
1. הכנת ריאגנטים ובינוני תרבות
- הכן את מאגר התמוגה של תאי הדם האדומים על ידי הוספת 8.29 גרם של NH4Cl, 1 גרם של KHCO3, 37.2 מ"ג של Na2EDTA לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים ולהתאים את ה- pH ל 7.2-7.4. הסר את החיידקים על ידי סינון באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.
- הכן מדיום תרבות ניסיוני לנויטרופילים על ידי הוספת 5% סרום שור עוברי למדיום RPMI 1640 ולאחסן ב 4 °C (69 °F). יש להשוות לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
הערה: השתמש באמצעי RPMI 1640 ללא פנול אדום. - הכן מלוחים חיץ פוספט (PBS) על ידי הוספת 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na2HPO4·2H2O ו 0.2 גרם של KH2PO4 לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים בקבוק זכוכית 1 L. כוונן את ה- pH ל- 7.2-7.4. אוטוקלאב זה במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרון ריפאמפיצין על ידי המסת 0.5 גרם של אבקת ריפאמפיצין ב 10 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) להניב פתרון ריפאמפיצין 50 מ"ג / מ"ל.
- הכן פתרון אגר LB על ידי הוספת 10 גרם של NaCl, 10 גרם של טריפטון, 5 גרם של תמצית שמרים ו 15 גרם של אבקת אגר לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים autoclave את התערובת. מלאו את מנות הפטרי לחצי מהנפח על ידי שפיכת תמיסת אגר LB חמה המכילה ריפאמפיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל. אחסן את הצלחת המוצקה המקוררת ב-4 מעלות צלזיוס.
- הכן את מרק עירוי לב המוח (BHI) המתאים לזנים חיידקיים על ידי המסת 37 גרם אבקת BHI ל-1 ליטר מים מזוקקים כפולים. כוונן את ה- pH ל- 7.2 ונבלע אותו באופן אוטומטי.
- להמיס את דיהידרותידיום בדיקה פלואורסצנטי (DHE) בממס DMSO להניב פתרון 10 מ"מ למניה. מערבבים בעדינות לפני השימוש.
הערה: אליגוט פתרון המניה מיד לתוך בקבוקונים אור הוכחה. חיי המדף של פתרון המניה הם 6 חודשים ב -20 מעלות צלזיוס.
2. הכנת זן חיידקים E44
הערה: E44 הוא זן מוטציה של מנינגיטיקה E. coli עם התנגדות ריפאמפיצין.
- טובלים את מושבת E44 cryopreserved עם קצה פיפטה סטרילי, לחסן את זן E44 על צלחת אגר LB המכיל 100 ריפאמפיצין מיקרוגרם / מ"ל על ידי ציור קווים. שים את הצלחת במהופך באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
- יום אחד לפני הניסוי, לבחור מושבה אחת E44 מהצלחת עם קצה פיפטה סטרילי ולשים אותו 5 מ"ל של מרק BHI המכיל 100 μg / mL ריפאמפיצין בבקבוק 50 מ"ל. דגירה את תרבות החיידקים ב 37 °C (69 °F) עם 90 סל"ד עבור 17 שעות בשייקר דגירה.
3. בידוד נויטרופילים מדם היקפי אנושי
- צייר 5 מ"ל של דגימת דם ממתנדבים תוך ורידי לצינור איסוף הדם ואקום המכיל EDTA עבור קרישה.
- צנטריפוגה דגימות הדם ההיקפי ב 500 x g במשך 5 דקות. דגימות הדם מחולקות לשלוש שכבות על ידי צנטריפוגה, אשר מלמטה למעלה הם שכבת תא הדם האדום (RBC), שכבת תא הדם הלבן (WBC) ואת שכבת הפלזמה, ברצף.
- לשאוף את שכבת תאי הדם הלבנים עם צינור לצינור חדש עם חיץ תמוגה 3x RBC. מערבבים את התערובת ביסודיות ומניחים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- צנטריפוגה הצינור ב 500 x g במשך 5 דקות. לשאוף את העל-טבעי לחלוטין ולהשליך.
- חזור על הליך התמוגה עם מאגר תמוגה RBC 1-2 פעמים, עד שהמשקע הופך לבן.
- לשטוף את התאים על ידי שימוש חוזר המשקעים עם 2 מ"ל של PBS. ואז צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתחתית הצינור.
- תווית נויטרופילים עם CD16 microbeads על ידי שימוש חוזר משקעים עם 50 μL של מאגר מיון תאים מגנטיים precooled. לאחר מכן לערבב עם 50 μL של מיקרוביאדות CD16 אנושי ביסודיות. דגירה את התערובת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
הערה: יש לקרר מראש פתרונות כדי למנוע מכסה של נוגדנים על פני התא ותיוג לא ספציפי. רוב המבוגרים יש כ 4,000 כדי 10,000 כדוריות דם לבנות לכל microliter של דם, ביניהם, נויטרופילים מהווים כ 50-70%. על פי הערכה, הסעיפים של סך תאי הדם הלבנים ב 5 מ"ל של דם היקפי אנושי הם בדרך כלל עד 2-5 x 107. - לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של מאגר מיון תאים מגנטיים צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס, 300 x גרם במשך 10 דקות. השלך את supernatant לחלוטין ו resuspend את המשקעים עם 500 μL של מאגר מיון.
- להרכיב את העמודה המגנטית ולהפריד מדף. הזז את המפריד למדף עם העמודה המגנטית ושטוף את העמודה עם 3 מ"ל של חיץ מיון.
- זרוק את המתלה התא לתוך העמודה כדי לאפשר נויטרופילים שכותרתו על ידי חרוזים מגנטיים לצרף את העמודה המגנטית.
- שטפו את התאים שאינם מסומנים בתווית על-ידי הוספת מאגר מיון תאים מגנטיים 3 מ"ל 3 פעמים, וודאו שמאגר העמודות ריק בכל פעם.
- הסר את העמודה מהמפריד המגנטי והכנס אותה לצינור של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מאגר מיון תאים מגנטיים לעמודה. לדחוף את התאים המסומנים מגנטי באמצעות בוכנה.
הערה: כדי לשפר את טוהר הנויטרופילים, ניתן לחזור על שלבי המיון באמצעות עמודה חדשה. - צנטריפוגה הצינור ב 300 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant לחלוטין resuspend את המשקעים עם 1 מ"ל של מדיום תרבות. קבע את מספר התא עם מונה תאים והכן את התאים לניסויים נוספים.
4. מדידה של ROS
- צנטריפוגה נויטרופילים מבודדים ב 300 x g במשך 5 דקות, resuspend את המשקעים, ולהתאים את ריכוז התא ל 2 x 106/mL עם מדיום תרבות המכיל 5 μM DHE בדיקת פלואורסצנטיות.
- דגירה נויטרופילים ב 37 °C (60 °F) במשך 30 דקות כדי לטעון את החללית DHE, ולאחר מכן להקצות את השעיית התא 96-היטב פוליסטירן שחור microplate עם 200 μL לכל באר.
- הפעל את קורא המיקרו-פלטה ופתח את תוכנת האיתור. בחרו תבנית צלחת אטומה של 96 בארות וקבעו את אזור הקריאה.
- הגדר את הפלואורסצנטיות (Ex/Em = 518/605 ננומטר) במצב קינטי כל 5 דקות במשך 60 דקות ב 37 °C (60 °F). הקפידו לנער את הצלחת במשך 3 שניות לפני כל קריאה.
- מוציאים את המיקרופלטה מהאינקובטור, מוסיפים את ה-E44 (MOI=100) התרבותי או את הפורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA) (100 ng/mL) לכל באר המכילה נויטרופילים טעונים מראש עם 3 שכפולים. השתמש ב- PMA כפקד חיובי.
- מניחים את הצלחת בקורא המיקרופלאט ומתחילים את ההסתעפות מיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה, נויטרופילים היו מבודדים מדם היקפי אנושי טעון עם בדיקה פלואורסצנטית DHE כדי לזהות את השינויים של רמות ROS בתגובה לזיהום E44. כאן, אנו מספקים נתונים מייצגים המדגימים את ייצור ROS עורר על ידי זן E44 נקבע על ידי קורא microplate בזמן אמת. על ידי הוספת זני E44 ב- MOI של 100, רמות ה- ROS עלו באופן מיידי והראו מגמת עלייה מתמשכת באופן תלוי זמן (איור 1). על ידי הוספת PMA, גורם ROS ידוע של ROS תאיים נויטרופילים, ראינו עקומה בצורת S המציגה עקומה שטוחה בשלב הראשוני ואחריו עלייה משמעותית מ 20 דקות ל 40 דקות ולבסוף לשיא ב 60 דקות (איור 1).
איור 1. ייצור ROS תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטיקה E. coli. נויטרופילים מבודדים מדם היקפי אנושי היו טעונים עם צבע DHE, זן E44 (MOI = 100) נוסף, ואת עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI) נקבע מיד עם קורא microplate. נויטרופילים שטופלו ב-PMA (100 ng/mL) שימשו כבקרה חיובית. כל הנתונים נורמלו לערך ההתחלתי כדי להשיג את עוצמת ה- DHE היחסית והוצגו כמשמעותיים ± SEM (n = 3). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נויטרופילים פועלים כמרכיב הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים במחזור הדם האנושי. הם תאים משפיעים חשובים במערכת החיסון האנושית המולדת, אשר בונה את קו ההגנה הראשון נגד הפלישה של פתוגנים11. הדור של ROS מייצג את אחד המנגנונים bactericidal העיקריים של נויטרופילים בעקבות phagocytosis11. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מבנה דמוי רשת שפורסם על ידי נויטרופילים הנקראים מלכודת חוץ תאית נויטרופילים (NET) מעורב גם בתהליך הרג החיידקים6,11,12.
דווח כי ROS המיוצר על ידי נויטרופילים המושרה על ידי גירוי של מיקרואורגניזמים פתוגניים נגרמים בעיקר על ידי הפעלה של NADPH אוקסידאז, אשר מורכב משני subunits מחייב ממברנה (gp91phox ו p22phox) ושלוש תת-יחידות ציטוזוליות(p47 phox,p67 phox, ו p40phox)5. החיידקים הנבלעים מפעילים סדרה של קינאז בתוך הנויטרופילים, כגון חלבון קינאז C (PKC), חלבון קינאז A (PKA) ו קינאז חלבון המופעל על ידי מיטוגן (MAPK), המתחזה את תת-יחידות הציטוזוליות p47phox של NADPH oxidase. לאחר מכן טרימר ציטוזולי המורכבמפוקסp47 ,p67 phox, ו p40phox translocates לקרום לשלב עם הממברנה מחייב gp91phox ו p22phox, ויוצרים את קומפלקס האוקסידדים NADPH מלא. קומפלקס תחמוצת NADPH שנאסף מעביר אלקטרונים שמקורם ב- NADPH ל- O2מולקולרי , ויוצר אניונים סופראוקסיד ופעלת הפונקציות הבקטריואידיות13,14,15. הוא דיווח גם כי ROS המיוצר על ידי נויטרופילים עשוי להיות קשור גם עם היווצרות NET של נויטרופילים16,17. לכן, הגילוי של ייצור ROS יתרום למחקר נוסף של המנגנון bactericidal של נויטרופילים.
בפרוטוקול זה, הנויטרופילים המבודדים מדם היקפי נטענים מראש עם DHE בדיקה פלואורסצנטית ומוקצים למיקרופלטה פוליסטירן שחורה 96 באר. עוצמת ROS מזוהה על ידי קורא microplate בזמן אמת לאחר מנינגיטי Escherichia coli מתווסף.
הדם שנאסף הוא אנטי קרישה באמצעות EDTA או ציטראט כדי למנוע הפעלה של נויטרופילים על ידי השלמה18. כמו נויטרופילים הם מובחנים סופני ויש להם תוחלת חיים קצרה (כ 4-8 שעות) בדם במחזור, צעדי הבידוד צריך להיעשות בהקדם האפשרי לאחר איסוףהדם 19. ריאגנטים מבודדים רבים, כגון פיקול-Hypaque ו Percoll, שימשו כדי לבודד נויטרופילים מדם היקפי11,19,20. בפרוטוקול זה, נויטרופילים מבודדים על ידי בחירת CD16 microbead לאחר תמוגה אריתרוציטים מהדם ההיקפי. הוא מציע שיפורים משמעותיים במהירות, פשטות וטוהר. כדי להשיג נויטרופילים טהורים יותר, ניתן ליישם צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות לפני הבידוד עם חרוזי CD16 מגנטיים.
מספר בדיקות פלואורסצנטיות מוכרות, כגון דיהידרותידיום (DHE), 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) ודיהידרודורהודמין 123 (DHR) העוברים דרך קרום התא בחופשיות, ניתן להשתמש בהם לקביעת ROS תאיים על ידי ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה קונפוקלית או קוראמיקרופלטה 21,22,23,24. בנוסף לגילוי של בדיקה פלואורסצנטית DHE עם קורא microplate, cytometry זרימה מיקרוסקופיה confocal יכול לשמש גם כדי לזהות את השינויים של עוצמת הפלואורסצנטיות של DHE בנקודות הזמן המצוין כדי למדוד את ייצור ROS נויטרופילים.
פרוטוקול זה מספק דרך קלה יותר לגילוי ייצור ROS באופן בזמן אמת וניתן להשתמש בו במגוון תרחישים כדי לזהות את דור ה- ROS בתאי יונקים מארחים הנגועים במיקרואורגניזמים פתוגניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31670845, 31870832, 32000811) ותכניתו של פרופסור מצטיין במחוז ליאונינג (LJH2018-35).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S.
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J.
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S.
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
