Summary
एस्चेरिचिया कोलाई नवजात ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरियल मेनिनजाइटिस का प्रमुख कारण है। बैक्टीरियल संक्रमण के दौरान, न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पादित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां एक प्रमुख जीवाणु की भूमिका निभाती हैं। यहां हम दिमागी बुखार ई कोलाईके जवाब में न्यूट्रोफिल में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाने के लिए एक विधि पेश करते हैं ।
Abstract
एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई)सबसे आम ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया है जो नवजात दिमागी बुखार का कारण बनता है। रक्त-मस्तिष्क बाधा के माध्यम से जीवाणु और बैक्टीरियल प्रवेश की घटना ई कोलाई दिमागी बुखार के विकास के लिए अपरिहार्य कदम हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) आक्रमण किए गए रोगजनकों को नष्ट करने के लिए न्यूट्रोफिल के प्रमुख जीवाणु तंत्र का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस प्रोटोकॉल में, मेनिंगिटिक ई. कोलाई से संक्रमित न्यूट्रोफिल में समय पर निर्भर इंट्रासेलुलर आरओएस उत्पादन को वास्तविक समय फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा पता लगाया गया फ्लोरोसेंट आरओ जांच का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। इस विधि को रोगजनक-मेजबान बातचीत के दौरान स्तनधारी कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन के आकलन पर भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
नवजात जीवाणु दिमागी बुखार एक आम बाल चिकित्सा संक्रामक रोग है। के 1 कैप्सूल के साथ एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई)सबसे आम ग्राम-नकारात्मक रोगजनक है जो नवजात जीवाणु दिमागी बुखार का कारण बनता है, जो कुल घटना1,2,3का लगभग 80% है। एंटीमाइक्रोबियल कीमोथेरेपी और सहायक देखभाल में प्रगति के बावजूद, बैक्टीरियल दिमागी बुखार अभी भी उच्च रुग्णता और मृत्यु दर4के साथ सबसे विनाशकारी स्थितियों में से एक है।
नवजात जीवाणु दिमागी बुखार की घटना आमतौर पर नवजात शिशुओं के स्थानीय घावों से परिधीय परिसंचरण में रोगजनक बैक्टीरिया के प्रवेश के कारण जीवाणु के साथ शुरू होती है, जिसके बाद मस्तिष्क में रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के माध्यम से प्रवेश होता है, जिसके परिणामस्वरूप मेनिंग4की सूजन होती है। जीवाणु की शुरुआत बैक्टीरिया और मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत पर निर्भर करती है जिसमें न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज आदि शामिल हैं। न्यूट्रोफिल, जो सफेद रक्त कोशिकाओं के ~ 50-70% के लिए खाते हैं, जीवाणु संक्रमण5,6के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति हैं। बैक्टीरिया के आक्रमण के दौरान, सक्रिय न्यूट्रोफिल संक्रामक स्थलों में भर्ती किए जाते हैं और सुपरऑक्साइड एनियन, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स और सिंगलेट ऑक्सीजन7सहित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को छोड़ते हैं। आरओएस कोशिका झिल्ली, न्यूक्लिक एसिड अणुओं और बैक्टीरिया के प्रोटीन के साथ रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप हमलावर बैक्टीरिया8की चोट और मृत्यु हो जाती है। माइटोकॉन्ड्रिया यूकेरियोटिक कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन का मुख्य स्थल है, और विभिन्न ऑक्सीडास (जैसे, निकोटीनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (एनएडीपीएच) ऑक्सीडेस कॉम्प्लेक्स, लिपोक्सीजेनेज सिस्टम, प्रोटीन किनेज सी और साइक्लॉक्सीजेनेज सिस्टम) आरओएस9,10के उत्पादन में मध्यस्थता करते हैं। आरओएस के उत्पादन का वास्तविक समय माप, न्यूट्रोफिल में प्राथमिक रोगाणुरोधी तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है, बैक्टीरिया-मेजबान बातचीत के दौरान मेजबान रक्षा का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है।
इस प्रोटोकॉल में, मेनिंगिटिक ई. कोलाई से संक्रमित न्यूट्रोफिल में समय पर निर्भर आरओएस उत्पादन को फ्लोरोसेंट आरओएस प्रोब डीएचई के साथ निर्धारित किया गया था, जो वास्तविक समय फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा पता लगाया गया था। इस विधि को रोगजनक-मेजबान बातचीत के दौरान अन्य स्तनधारी कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन के आकलन पर भी लागू किया जा सकता है।
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Protocol
इस शोध में लागू स्वयंसेवकों से परिधीय रक्त चीन चिकित्सा विश्वविद्यालय (#2020-2020-237-2) के पहले अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. रिएजेंट्स और कल्चर मीडियम की तैयारी
- एनएच4सीएल के 8.29 ग्राम, केएचसीओ 3 के 1 ग्राम, 37.2 मिलीग्रामएनए2ईडीटीए को डबल डिस्टिल्ड पानी में डालकर लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर तैयार करें और पीएच को 7.2-7.4 में समायोजित करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके छानने का काम करके बैक्टीरिया को हटा दें।
- आरएमआई 1640 मीडियम में 5 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़कर न्यूट्रोफिल के लिए प्रायोगिक संस्कृति माध्यम तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर बराबरी करें।
नोट: फिनॉल लाल बिना आरपीएमआई 1640 माध्यम का उपयोग करें। - 1 एल ग्लास फ्लास्क में 8 ग्राम एनएसीएल, 0.2 ग्राम केसीएल, 1.44 ग्राम एनए2एचपीओ4 ·2एच2ओ और 0.2 ग्राम केएच2पीओ4 को 1 एल डिफाल्टर पानी में डालकर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें। पीएच को 7.2-7.4 पर समायोजित करें। ऑटोक्लेव इसे 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए।
- 50 मिलीग्राम/एमएल रिफाम्पिकिन समाधान उपज के लिए डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 10 एमएल में रिफाम्पिकिन पाउडर के 0.5 ग्राम को भंग करके रिफाम्पिकिन समाधान तैयार करें।
- एनएसीएल के 10 ग्राम, ट्राइप्टोन के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 ग्राम और 15 ग्राम आगर पाउडर को 1 एल डबल डिस्टिल्ड पानी में जोड़कर एलबी एगर समाधान तैयार करें और मिश्रण को ऑटोक्लेव करें। 100 μg/mL rifampicin युक्त गर्म पौंड आगर समाधान डालने का कार्य करके मात्रा के आधे तक पेट्री व्यंजन भरें। कूल्ड सॉलिड प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 37 ग्राम बीएचआई पाउडर को 1 एल डबल डिस्टिल्ड पानी में घोलकर बैक्टीरियल उपभेदों के लिए उपयुक्त मस्तिष्क हृदय जलसेक (बीएचआई) शोरबा तैयार करें। पीएच को 7.2 पर समायोजित करें और इसे ऑटोक्लेव करें।
- 10 एमएम स्टॉक सॉल्यूशन निकालने के लिए डीएमएसओ सॉल्वेंट में फ्लोरोसेंट प्रोब डिहाइड्रोथिडियम (डीएचई) को भंग करें। उपयोग से पहले धीरे-धीरे मिलाएं।
नोट: स्टॉक समाधान को तुरंत प्रकाश-प्रूफ शीशियों में अलीकोट करें। स्टॉक समाधान का शेल्फ जीवन -20 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने है।
2. E44 बैक्टीरिया तनाव की तैयारी
नोट: E44 rifampicin प्रतिरोध के साथ मेनिंगिटिक ई. कोलाई का एक उत्परिवर्ती तनाव है ।
- एक बाँझ पिपेट टिप के साथ क्रायोप्रेवरीवित E44 कॉलोनी को डुबोएं, एलबी एगर प्लेट पर E44 तनाव को टीका लगाते हैं जिसमें 100 μg/mL रिफम्पिकिन होता है। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में प्लेट को उल्टा रखें।
- प्रयोग से एक दिन पहले, एक बाँझ पिपेट टिप के साथ थाली से एक E44 कॉलोनी उठाओ और यह एक ५० ml फ्लास्क में १०० μg/mL rifampicin युक्त बीएचआई शोरबा के 5 एमएल में डाल दिया । एक इनक्यूबेशन शेकर में 17 घंटे के लिए 90 आरपीएम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल कल्चर को इनक्यूबेट करें।
3. मानव परिधीय रक्त से न्यूट्रोफिल का अलगाव
- एंटीकोगुलेशन के लिए ईडीटीए युक्त वैक्यूम रक्त संग्रह ट्यूब के लिए नसों के माध्यम से स्वयंसेवकों से रक्त नमूना के 5 एमएल ड्रा करें।
- 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर परिधीय रक्त के नमूने अपकेंद्रित्र। रक्त के नमूनों को अपकेंद्रित्र द्वारा तीन परतों में विभाजित किया जाता है, जो नीचे से ऊपर तक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) परत, सफेद रक्त कोशिका (डब्ल्यूबीसी) परत और प्लाज्मा परत, क्रमिक रूप से होते हैं।
- सफेद रक्त कोशिका परत को 3x आरबीसी लाइसिस बफर के साथ एक नई ट्यूब पर एक पिपेट के साथ एस्पिरेट करें। मिश्रण को अच्छी तरह से ब्लेंड करें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
- 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को पूरी तरह से एस्पिरेट करें और त्यागें।
- आरबीसी लाइसिस बफर के साथ लाइसिस प्रक्रिया को 1-2 बार दोहराएं, जब तक कि वर्षा सफेद न हो जाए।
- पीबीएस के 2 एमएल के साथ वर्षा को पुनर्व्यवसस्ता द्वारा कोशिकाओं को धोएं। फिर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को ट्यूब के नीचे तक बसने दें।
- प्रीकूल्ड मैग्नेटिक सेल सॉर्टिंग बफर के 50 माइक्रोन के साथ तलछट को फिर से खर्च करके सीडी16 माइक्रोमोतियों के साथ न्यूट्रोफिल को लेबल करें। फिर मानव सीडी 16 माइक्रोमोतियों के 50 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: कोशिका की सतह और गैर-विशिष्ट लेबलिंग पर एंटीबॉडी की कैपिंग को रोकने के लिए समाधानों को पूर्व-ठंडा किया जाना चाहिए। अधिकांश वयस्कों में रक्त के प्रति माइक्रोलीटर लगभग 4,000 से 10,000 सफेद रक्त कोशिकाएं होती हैं, जिनमें से, न्यूट्रोफिल लगभग 50-70% के लिए खाते हैं। अनुमान के अनुसार, मानव परिधीय रक्त के 5 एमएल में कुल सफेद रक्त कोशिकाओं की गिनती आमतौर पर 2-5 x 107तक होती है। - 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 300 एक्स ग्राम पर चुंबकीय सेल छंटाई बफर और अपकेंद्रित्र के 2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। सुपरनेट को पूरी तरह से त्यागें और 500 माइक्रोन के साथ बफर को फिर से खर्च करें।
- चुंबकीय स्तंभ को इकट्ठा करें और शेल्फ को अलग करें। चुंबकीय स्तंभ के साथ शेल्फ करने के लिए विभाजक ले जाएँ और छंटाई बफर के 3 एमएल के साथ कॉलम कुल्ला।
- चुंबकीय मोतियों द्वारा लेबल किए गए न्यूट्रोफिल को चुंबकीय स्तंभ से संलग्न करने की अनुमति देने के लिए कोशिका निलंबन को कॉलम में छोड़ दें।
- 3 बार चुंबकीय सेल छंटाई बफर के 3 एमएल जोड़कर गैर-लेबल कोशिकाओं को धोएं, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि कॉलम जलाशय हर बार खाली है।
- मैग्नेटिक सेपरेटर से कॉलम निकालकर 15 एमएल ट्यूब पर डाल दें। कॉलम में चुंबकीय कोशिका छंटाई बफर के 5 एमएल जोड़ें। एक प्लंजर का उपयोग कर चुंबकीय लेबल कोशिकाओं को बाहर पुश करें।
नोट: न्यूट्रोफिल की शुद्धता में सुधार करने के लिए, छंटाई चरणों को एक नए कॉलम का उपयोग करके दोहराया जा सकता है। - 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें, सुपरनेट को पूरी तरह से त्यागें और संस्कृति माध्यम के 1 मिलीएल के साथ वर्षा को फिर से खर्च करें। सेल काउंटर के साथ सेल नंबर निर्धारित करें और आगे के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं को तैयार करें।
4. ROS का माप
- 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अलग न्यूट्रोफिल को अपकेंद्रित्र करें, उपजी को फिर से खर्च करें, और सेल एकाग्रता को 5 माइक्रोन डीएचई फ्लोरेसेंस प्रोब युक्त संस्कृति माध्यम के साथ 2 x 106/एमएल में समायोजित करें।
- डीएचई जांच को लोड करने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूट्रोफिल को इनक्यूबेट करें, और फिर 200 माइक्रोल प्रति अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से ब्लैक पॉलीस्टीरिन माइक्रोप्लेट के लिए सेल सस्पेंशन आवंटित करें।
- माइक्रोप्लेट रीडर चालू करें और डिटेक्शन सॉफ्टवेयर खोलें। अपारदर्शी 96-वेल्स प्लेट प्रारूप चुनें और पढ़ने के क्षेत्र का निर्धारण करें।
- फ्लोरेसेंस (एक्स/एम = 518/605 एनएम) को गतिज मोड में हर 5 मिनट में ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट करें । प्रत्येक पढ़ने से पहले 3 एस के लिए थाली हिला सुनिश्चित करें ।
- इनक्यूबेटर से माइक्रोप्लेट निकालें, सुसंस्कृत E44 (MOI = 100) या phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पीएमए) (१०० एनजी/एमएल) प्रत्येक अच्छी तरह से 3 प्रतिकृति के साथ प्रीलोडेड न्यूट्रोफिल युक्त करने के लिए जोड़ें । पीएमए को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग करें।
- प्लेट को माइक्रोप्लेट रीडर में रखें और परख तुरंत शुरू करें।
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Representative Results
इस लेख में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, न्यूट्रोफिल को मानव परिधीय रक्त से अलग किया गया था और E44 संक्रमण के जवाब में आरओएस के स्तर के परिवर्तनों का पता लगाने के लिए फ्लोरेसेंस प्रोब डीएचई से भरा हुआ था। यहां, हम वास्तविक समय में एक माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा निर्धारित E44 तनाव द्वारा पैदा किए गए आरओएस उत्पादन का प्रदर्शन करने वाले प्रतिनिधि डेटा प्रदान करते हैं। 100 के एमओआई पर E44 उपभेदों को जोड़कर, आरओएस का स्तर तुरंत बढ़ गया और समय-निर्भर तरीके(चित्रा 1)के साथ निरंतर वृद्धि की प्रवृत्ति दिखाई दी। न्यूट्रोफिल में इंट्रासेलुलर आरओएस के एक प्रसिद्ध आरओ प्रेरक पीएमए को जोड़कर, हमने एक एस-आकार का वक्र देखा जो प्रारंभिक चरण में एक सपाट वक्र प्रस्तुत करता है जिसके बाद 20 मिनट से 40 मिनट तक महत्वपूर्ण वृद्धि होती है और अंत में 60 मिनट(चित्रा 1)पर बढ़ता जा रहा है।
चित्रा 1। मेनिंगिटिक ई. कोलाईसे संक्रमित न्यूट्रोफिल में समय पर निर्भर आरओएस उत्पादन । मानव परिधीय रक्त से अलग न्यूट्रोफिल DHE डाई के साथ भरी हुई थी, एक E44 तनाव (MOI = 100) जोड़ा गया था, और मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (MFI) तुरंत एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ निर्धारित किया गया था। पीएमए (१०० एनजी/एमएल) के साथ इलाज किए गए न्यूट्रोफिल को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । सभी डेटा को सापेक्ष डीएचई तीव्रता प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक मूल्य पर सामान्यीकृत किया गया था और मतलब ± एसईएम (एन = 3) के रूप में प्रस्तुत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
न्यूट्रोफिल मानव रक्त परिसंचरण में सफेद रक्त कोशिकाओं के सबसे प्रचुर घटक के रूप में कार्य करते हैं। वे जन्मजात मानव प्रतिरक्षा प्रणाली में महत्वपूर्ण प्रभावक कोशिकाएं हैं, जो रोगजनकों के आक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति बनाती है11। आरओएस का उत्पादन फैगोसाइटोसिस11के बाद न्यूट्रोफिल के प्रमुख जीवाणु तंत्रों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (नेट) नामक न्यूट्रोफिल द्वारा जारी एक नेट जैसी संरचना बैक्टीरिया किलिंगप्रक्रिया6,11,12में भी शामिल है।
यह सूचित किया गया है कि रोगजनक सूक्ष्मजीवों की उत्तेजना से प्रेरित न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पादित आरओएस मुख्य रूप से एनएडीपीएच ऑक्सीडेस की सक्रियता के कारण होता है, जो दो झिल्ली बाध्यकारी उपइकाओं (जीपी 91फोक्स और पी22फोक्स)और तीन साइटोसोलिक सबयूनिट (पी 47फोक्स,पी 67 फोक्स और पी 40फोक्स)5से बना होता है। घिरा हुआ बैक्टीरिया न्यूट्रोफिल के अंदर किनेस की एक श्रृंखला को सक्रिय करता है, जैसे प्रोटीन किनेज सी (पीकेसी), प्रोटीन किनेज ए (पीकेए), और मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके), जो फॉस्फोरलेट एनएडीपीपी ऑक्सीडेस के साइटोसोलिक सबयूनिट पी 47फोक्स को फास्फोरलेट करते हैं। फिर p47फोक्स,p67फोक्स,और p40फोक्स से बना एक साइटोसोलिक ट्राइमर झिल्ली के लिए झिल्ली बाध्यकारी सबयूनिट जीपी91फोक्स और पी22फोक्सके साथ गठबंधन करने के लिए ट्रांसलॉलेट करता है, जो पूर्ण एनएडीपीपी ऑक्सीडेस कॉम्प्लेक्स बनाता है। इकट्ठे नाडीपीएच ऑक्सीडेस परिसर एनएडीपीएच-व्युत्पन्न इलेक्ट्रॉनों को आणविक ओ2में स्थानांतरित करता है, जिससे सुपरऑक्साइड एनियन उत्पन्न होते हैं और जीवाणु13 , 14,15होते हैं । यह भी बताया गया है कि न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पादित आरओएस न्यूट्रोफिल16,17के नेट गठन से भी जुड़ा हो सकता है । इसलिए, आरओएस उत्पादन का पता लगाने से न्यूट्रोफिल के जीवाणु तंत्र के आगे के अध्ययन में योगदान होगा।
इस प्रोटोकॉल में, परिधीय रक्त से अलग न्यूट्रोफिल फ्लोरेसेंस जांच DHE के साथ पूर्व से अधिक है और एक ९६ अच्छी तरह से काले पॉलीस्टीरिन माइक्रोप्लेट के लिए आवंटित कर रहे हैं । आरओएस तीव्रता का पता वास्तविक समय में एक माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा मेनिंगिटिक एस्चेरिचिया कोलाई को जोड़े जाने के बाद लगाया जाता है।
एकत्रित रक्त18पूरक द्वारा न्यूट्रोफिल की सक्रियता से बचने के लिए ईडीए या साइट्रेट का उपयोग करके विरोधी जमावित होता है। चूंकि न्यूट्रोफिल को मरणासन्न रूप से अलग किया जाता है और परिसंचारी रक्त में एक छोटी जीवन अवधि (लगभग 4-8 घंटे) होती है, इसलिए रक्त संग्रह19के बाद जितनी जल्दी हो सके अलगाव के कदम किए जाने चाहिए। फिकोल-हाइप और परकोल जैसे कई अलग-थलग रहने वाले अभिकर्मकों का उपयोग परिधीय रक्त11, 19,20से न्यूट्रोफिल को अलग करनेकेलिए किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, परिधीय रक्त से एरिथ्रोसाइट लाइसिस के बाद सीडी 16 माइक्रोमोतियों के चयन से न्यूट्रोफिल को अलग किया जाता है। यह गति, सादगी और शुद्धता में महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता है। शुद्ध न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए, CD16 चुंबकीय मोतियों के साथ अलगाव से पहले एक घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र लागू किया जा सकता है।
कई मान्यता प्राप्त फ्लोरोसेंट जांच, जैसे डिइड्रोएथिडियम (डीएचई), 2', 7'-डाइक्लोरोहाइड्रोफ्रोफोरेसिन डायसेटेट (एच2डीसीएफ-डीए) और डाइहाइड्रोरहोडामाइन 123 (डीएचआर) जो स्वतंत्र रूप से कोशिका झिल्ली से गुजरते हैं, का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री, कॉन्मोकल माइक्रोस्कोपी यामाइक्रोस्कोप रीडर21,22,23,24द्वारा इंट्रासेलुलर रोस के निर्धारण के लिए किया जा सकता है। माइक्रोप्लेट रीडर के साथ डीएचई फ्लोरेसेंस प्रोब का पता लगाने के अलावा, न्यूट्रोफिल में आरओएस उत्पादन को मापने के लिए संकेतित समय बिंदुओं पर डीएचई की फ्लोरेसेंस तीव्रता के परिवर्तनों का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोसल माइक्रोस्कोपी का भी उपयोग किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय में आरओएस उत्पादन का पता लगाने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है और रोगजनक सूक्ष्मजीवों से संक्रमित मेजबान स्तनधारी कोशिकाओं में आरओएस पीढ़ी का पता लगाने के लिए विभिन्न परिदृश्यों में उपयोग किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों या हितों के अन्य संघर्षों की घोषणा करते हैं।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (31670845, 31870832, 32000811) और लियानिंग प्रांत के प्रतिष्ठित प्रोफेसर (एलजेएच2018-35) के कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
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