Summary
Escherichia coli è la principale causa di meningite batterica gram-negativa neonatale. Durante l'infezione batterica, le specie reattive di ossigeno prodotte dai neutrofili svolgono un ruolo battericida importante. Qui introduciamo un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili in risposta alla meningite E. coli.
Abstract
L'Escherichia coli (E. coli)è il batterio Gram-negativo più comune che causa meningite neonatale. Il verificarsi di batteriemia e penetrazione batterica attraverso la barriera ematica-encefalica sono passi indispensabili per lo sviluppo della meningite E. coli. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) rappresentano i principali meccanismi battericidi dei neutrofili per distruggere gli agenti patogeni invasi. In questo protocollo, la produzione di ROS intracellulare dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata utilizzando sonde ROS fluorescenti rilevate da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS nelle cellule di mammifero durante le interazioni patogeno-ospite.
Introduction
La meningite batterica neonatale è una malattia infettiva pediatrica comune. L'Escherichia coli (E. coli) con una capsula K1 è il più comune agente patogeno Gram-negativo che causa meningite batterica neonatale, rappresentando circa l'80% dell'incidenzatotale 1,2,3. Nonostante i progressi nella chemioterapia antimicrobica e nelle cure di supporto, la meningite batterica è ancora una delle condizioni più devastanti con elevata morbilità e mortalità4.
Il verificarsi di meningite batterica neonatale di solito inizia con la batteriemia causata dall'ingresso di batteri patogeni nella circolazione periferica dalle lesioni locali dei neonati, seguita dalla penetrazione attraverso la barriera ematico-encefalica (BBB) nel cervello, con conseguente infiammazione delle meningi4. L'insorgenza della bacteremia dipende dall'interazione tra batteri e cellule immunitarie ospiti tra cui neutrofili e macrofagi, ecc. I neutrofili, che rappresentano ~ 50-70% dei globuli bianchi, sono la prima linea di difesa contro le infezionibatteriche 5,6. Durante l'invasione dei batteri, i neutrofili attivati vengono reclutati nei siti infettivi e rilasciano specie reattive dell'ossigeno (ROS) tra cui l'anione superossido, il perossido di idrogeno, i radicali idrossili e l'ossigeno singlet7. Il ROS subisce reazioni redox con la membrana cellulare, molecole di acido nucleico e proteine dei batteri, con conseguente lesione e morte del batterio invasore8. I mitocondri sono il principale sito di produzione di ROS nelle cellule eucariotiche e varie ossidasi (ad esempio, nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) complesso ossidasi, sistema lipossigenasi, protein chinasi C e sistema cicloossigenasi) mediano la produzione di ROS9,10. La misurazione in tempo reale della produzione di ROS, che rappresenta il meccanismo antimicrobico primario nei neutrofili, è un metodo utile per studiare la difesa dell'ospite durante l'interazione batteri-ospite.
In questo protocollo, la produzione di ROS dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata con una sonda FLUORESCENTE ROS DHE, rilevata da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS in altre cellule di mammiferi durante l'interazione agente patogeno-ospite.
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Protocol
Il sangue periferico dei volontari applicato in questa ricerca è stato approvato dall'Institutional Review Board della prima Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Preparazione dei reagenti e del mezzo di coltura
- Preparare il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo 8,29 g di NH4Cl, 1 g di KHCO3, 37,2 mg di Na2EDTA in 1 L di acqua distillata doppia e regolare il pH a 7,2-7,4. Rimuovere i batteri mediante filtrazione utilizzando filtri da 0,22 μm.
- Preparare il terreno di coltura sperimentale per i neutrofili aggiungendo il 5% di siero bovino fetale al mezzo RPMI 1640 e conservare a 4 °C. Equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso.
NOTA: Utilizzare il mezzo RPMI 1640 senza rosso fenolo. - Preparare la salina tampone fosfato (PBS) aggiungendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4·2H2O e 0,2 g di KH2PO4 in 1 L di acqua distillata doppia in un pallone di vetro da 1 L. Regolare il pH a 7,2-7,4. Autoclave per 15 min a 121 °C.
- Preparare la soluzione di rifampicina sciogliendo 0,5 g di polvere di rifampicina in 10 mL di solfossido di dimetile (DMSO) per produrre una soluzione di rifampicina da 50 mg/mL.
- Preparare la soluzione di agar LB aggiungendo 10 g di NaCl, 10 g di triptono, 5 g di estratto di lievito e 15 g di polvere di agar in 1 L di acqua distillata doppia e autoclavare la miscela. Riempire le piastre di Petri a metà del volume versando una soluzione calda di agar LB contenente 100 μg/mL di rifampicina. Conservare la piastra solida raffreddata a 4 °C.
- Preparare l'infusione di cuore cerebrale (BHI) brodo appropriato per i ceppi batterici sciogliendo 37 g di polvere BHI in 1 L di acqua distillata doppia. Regolare il pH a 7,2 e autoclave.
- Sciogliere il diidroetidio della sonda fluorescente (DHE) in solvente DMSO per ottenere una soluzione stock da 10 mM. Mescolare delicatamente prima dell'uso.
NOTA: Aliquote la soluzione stock immediatamente in fiale a prova di luce. La durata di conservazione della soluzione stock è di 6 mesi a -20 °C.
2. Preparazione del ceppo batterico E44
NOTA: E44 è un ceppo mutante di meningite E. coli con resistenza alla rifampicina.
- Immergere la colonia E44 crioconservata con una punta sterile di pipetta, inoculare il ceppo E44 sulla piastra di agar LB contenente 100 μg/mL di rifampicina disegnando linee. Mettere la piastra capovolta nell'incubatore a 37 °C durante la notte.
- Un giorno prima dell'esperimento, scegliere una colonia E44 dalla piastra con una punta sterile di pipetta e metterla in 5 ml di brodo BHI contenente 100 μg/mL di rifampicina in un pallone da 50 ml. Incubare la coltura batterica a 37 °C con 90 giri/min per 17 ore in uno shaker di incubazione.
3. Isolamento dei neutrofili dal sangue periferico umano
- Eleva 5 ml di campione di sangue dai volontari per via endovenosa al tubo di raccolta del sangue sottovuoto contenente EDTA per l'anticoagulazione.
- Centrifugare i campioni di sangue periferico a 500 x g per 5 min. I campioni di sangue sono divisi in tre strati per centrifugazione, che dal basso verso l'alto sono lo strato di globuli rossi (RBC), lo strato di globuli bianchi (WBC) e lo strato plasmatico, in sequenza.
- Aspirare lo strato di globuli bianchi con una pipetta a un nuovo tubo con tampone di lysis RBC 3x. Frullare accuratamente la miscela e posizionarsi a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Centrifugare il tubo a 500 x g per 5 min. Aspirare completamente il supernatante e scartare.
- Ripetere la procedura di lisi con tampone di lisi RBC 1-2 volte, fino a quando il precipitato diventa bianco.
- Lavare le cellule rimospensendo il precipitato con 2 mL di PBS. Quindi centrifugare a 300 x g per 5 minuti per lasciare che le cellule si sistemino sul fondo del tubo.
- Etichettare i neutrofili con microperline CD16 risospendendo il sedimento con 50 μL di tampone di smistamento delle celle magnetiche preraffreddato. Quindi mescolare accuratamente con 50 μL di microperline CD16 umane. Incubare la miscela a 4 °C per 30 minuti.
NOTA: Le soluzioni devono essere pre-raffreddate per prevenire la tappatura degli anticorpi sulla superficie cellulare e l'etichettatura non specifica. La maggior parte degli adulti ha da 4.000 a 10.000 globuli bianchi per microlitro di sangue, tra cui i neutrofili rappresentano circa il 50-70%. Secondo le stime, i conteggi dei globuli bianchi totali in 5 mL di sangue periferico umano sono solitamente fino a 2-5 x 107. - Lavare le celle aggiungendo 2 mL di tampone di smistamento delle celle magnetiche e centrifuga a 4 °C, 300 x g per 10 min. Scartare completamente il supernatante e risospendare il precipitato con 500 μL di tampone di smistamento.
- Assemblare la colonna magnetica e separare lo scaffale. Spostare il separatore sullo scaffale con la colonna magnetica e sciacquare la colonna con 3 mL di tampone di smistamento.
- Far cadere la sospensione cellulare nella colonna per consentire ai neutrofili etichettati dalle perline magnetiche di attaccarsi alla colonna magnetica.
- Lavare le celle non etichettate aggiungendo 3 mL di buffer di smistamento delle celle magnetiche 3 volte, assicurandosi che il serbatoio della colonna sia vuoto ogni volta.
- Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e metterla su un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 mL di buffer di ordinamento delle celle magnetiche alla colonna. Spingere fuori le celle magnetiche etichettate usando uno stantuffo.
NOTA: Per migliorare la purezza dei neutrofili, i passaggi di ordinamento possono essere ripetuti utilizzando una nuova colonna. - Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 minuti, scartare completamente il supernatante e rimescolare il precipitato con 1 ml di mezzo di coltura. Determinare il numero di cella con un contatore di celle e preparare le celle per ulteriori esperimenti.
4. Misurazione del ROS
- Centrifugare i neutrofili isolati a 300 x g per 5 minuti, rimescolare il precipitato e regolare la concentrazione cellulare a 2 x 106/mL con un mezzo di coltura contenente 5 μM di sonda a fluorescenza DHE.
- Incubare i neutrofili a 37 °C per 30 minuti per caricare la sonda DHE, quindi allocare la sospensione cellulare a una micropia piastra di polistirolo nero da 96 pozzetti con 200 μL per pozzo.
- Accendere il lettore di micropiatte e aprire il software di rilevamento. Scegliere il formato opaca della piastra a 96 pozzi e determinare l'area di lettura.
- Impostare la fluorescenza (Ex/Em = 518/605 nm) in modalità cinetica ogni 5 minuti per 60 min a 37 °C. Assicurarsi di scuotere la piastra per 3 s prima di ogni lettura.
- Esegna la micropiatta dall'incubatore, aggiungi l'E44 coltivato (MOI=100) o il phorbol 12-miristato 13 acetato (PMA) (100 ng/mL) a ogni neutrofilo precaricato ben contenente con 3 repliche. Utilizzare pma come controllo positivo.
- Posizionare la piastra nel lettore di micropiastrine e iniziare immediatamente il test.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo delineato in questo articolo, i neutrofili sono stati isolati dal sangue periferico umano e caricati con sonda a fluorescenza DHE per rilevare i cambiamenti dei livelli di ROS in risposta all'infezione da E44. Qui forniamo dati rappresentativi che dimostrano la produzione ROS evocata dalla deformazione E44 determinata da un lettore di micropiatte in tempo reale. Aggiungendo ceppi E44 ad un MOI di 100, i livelli di ROS sono aumentati immediatamente e hanno mostrato una continua tendenza all'aumento con un modo dipendente dal tempo(figura 1). Aggiungendo PMA, un noto induttore ROS di ROS intracellulare nei neutrofili, abbiamo osservato una curva a forma di S che presenta una curva piatta nella fase iniziale seguita da un aumento significativo da 20 minuti a 40 minuti e infine raggiungendo il picco a 60 min(Figura 1).
Figura 1. Produzione di ROS dipendente dal tempo in neutrofili infetti da meningite E. coli. I neutrofili isolati dal sangue periferico umano sono stati caricati con colorante DHE, è stato aggiunto un ceppo E44 (MOI=100) e l'intensità media della fluorescenza (IFM) è stata determinata immediatamente con un lettore di micropiacche. I neutrofili trattati con PMA (100 ng/mL) sono stati usati come controllo positivo. Tutti i dati sono stati normalizzati al valore iniziale per ottenere l'intensità DHE relativa e presentati come ± SEM (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I neutrofili agiscono come il componente più abbondante dei globuli bianchi nella circolazione sanguigna umana. Sono importanti cellule effettori nel sistema immunitario umano innato, che costruisce la prima linea di difesa contro l'invasione di agenti patogeni11. La generazione di ROS rappresenta uno dei principali meccanismi battericidi dei neutrofili dopo la fagocitosi11. Recenti studi hanno dimostrato che una struttura simile a una rete rilasciata da un neutrofilo chiamato neutrofilo trappola extracellulare (NET) è anche coinvolta nel processo diuccisione dei batteri 6,11,12.
È stato riferito che il ROS prodotto dai neutrofili indotti dalla stimolazione di microrganismi patogeni è causato principalmente dall'attivazione della NADPH ossidasi, che è composta da due subunità leganti a membrana (gp91phox e p22phox)e tre subunità citosoliche (p47phox, p67phoxe p40phox)5. I batteri inghiottiti attivano una serie di chinasi all'interno dei neutrofili, come la protein chinasi C (PKC), la protein chinasi A (PKA) e la protein chinasi attivata dai mitogeni (MAPK), che fosforilati le subunità citosoliche p47phox di NADPH ossidasi. Quindi un trimero citosolico composto da p47phox, p67phoxe p40phox si trasferisce nella membrana per combinarsi con la subunità legante membrana gp91phox e p22phox, formando il complesso completo di OSSIDASI NADPH. Il complesso di OSSidasi NADPH assemblato trasferisce elettroni derivati dal NADPH alla molecolare O2,generando anioni di superossido e attivando le funzioni battericide13,14,15. È anche riportato che il ROS prodotto dai neutrofili può anche essere associato alla formazione NETTA di neutrofili16,17. Pertanto, l'individuazione della produzione di ROS contribuirebbe all'ulteriore studio del meccanismo battericida dei neutrofili.
In questo protocollo, i neutrofili isolati dal sangue periferico sono precaricati con sonda a fluorescenza DHE e assegnati a una micropiatta di polistirolo nero da 96 porri. L'intensità del ROS viene rilevata da un lettore di micropiatta in tempo reale dopo l'aggiunta della meningite Escherichia coli.
Il sangue raccolto viene antico coagulato utilizzando EDTA o citrato per evitare l'attivazione di neutrofili per complemento18. Poiché i neutrofili sono differenziati terminalemente e hanno una breve durata della vita (circa 4-8 ore) nel sangue circolante, i passaggi di isolamento devono essere eseguiti il prima possibile dopo la raccolta del sangue19. Molti reagenti isolanti, come Ficoll-Hypaque e Percoll, sono stati utilizzati per isolare i neutrofilidal sangue periferico 11,19,20. In questo protocollo, i neutrofili sono isolati dalla selezione di microperline CD16 dopo la llisi degli erytrociti dal sangue periferico. Offre miglioramenti significativi in termini di velocità, semplicità e purezza. Per ottenere neutrofili più puri, una centrifugazione del gradiente di densità potrebbe essere applicata prima dell'isolamento con perline magnetiche CD16.
Un certo numero di sonde fluorescenti riconosciute, come il diidroetidio (DHE), 2', Il diacetato di 7'-diclorodidrofluoresceina (H2DCF-DA) e la diidrorhodamina 123 (DHR) che passano liberamente attraverso la membrana cellulare, possono essere utilizzati per la determinazione del ROS intracellulare mediante citometria a flusso, microscopia confocale o lettore di micropiastra21,22,23,24. Oltre al rilevamento della sonda a fluorescenza DHE con lettore di micropiatta, la citometria a flusso e la microscopia confocale potrebbero essere utilizzate anche per rilevare le alterazioni dell'intensità di fluorescenza del DHE nei punti di tempo indicati per misurare la produzione di ROS nei neutrofili.
Questo protocollo fornisce un modo più semplice per il rilevamento della produzione di ROS in tempo reale e può essere utilizzato in una varietà di scenari per rilevare la generazione di ROS nelle cellule di mammiferi ospiti infettate da microrganismi patogeni.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) e dal Programma di Distinguished Professor della provincia di Liaoning (LJH2018-35).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
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