Summary
Escherichia coli является основной причиной неонатального грамотрицательных бактериального менингита. Во время бактериальной инфекции, реактивные виды кислорода, производимые нейтрофилов играют важную бактерицидную роль. Здесь мы представляем метод обнаружения реактивных видов кислорода в нейтрофилов в ответ на менингит E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) является наиболее распространенными грамотрицательных бактерий, вызывающих неонатальный менингит. Возникновение бактериемии и проникновение бактерий через геммозеозный барьер являются незаменимыми шагами для развития менингита кишечной палочки. Реактивные виды кислорода (ROS) представляют собой основные бактерицидные механизмы нейтрофилов для уничтожения вторгшихся патогенов. В этом протоколе, зависит от времени внутриклеточного производства ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки была количественно с помощью флуоресцентных зондов ROS обнаружены в режиме реального времени флуоресценции микроплеся читателя. Этот метод также может быть применен к оценке производства ROS в клетках млекопитающих во время взаимодействия патогена-хозяина.
Introduction
Неонатальный бактериальный менингит является распространенным детским инфекционным заболеванием. Escherichia coli (E. coli) с капсулой K1 является наиболее распространенным грам-отрицательным патогеном, вызывающим неонатальный бактериальный менингит, на который приходится около 80% от общейзаболеваемости 1,2,3. Несмотря на достижения в области антимикробной химиотерапии и поддерживающей помощи, бактериальный менингит по-прежнему является одним из самых разрушительных состояний с высокой заболеваемостью исмертностью 4.
Возникновение неонатального бактериального менингита обычно начинается с бактериемии, вызванной входом патогенных бактерий в периферическую циркуляцию от местных поражений новорожденных, а затем проникновение через геммозео-мозговой барьер (BBB) в мозг, в результате чего воспаление опоясывания4. Начало бактериемии зависит от взаимодействия между бактериями и иммунными клетками хозяина, включая нейтрофилы и макрофаги и т.д. Нейтрофилов, на которые приходится 50-70% белых кровяных телец, являются первой линией защиты отбактериальных инфекций 5,6. Во время вторжения бактерий, активированные нейтрофилов набираются в инфекционные сайты и высвобождают реактивные виды кислорода (ROS), включая супероксидный анион, перекись водорода, гидроксиловы радикалы и синглетныйкислород 7. ROS проходят редокс реакции с клеточной мембраны, молекулы нуклеиновой кислоты и белки бактерий, в результате чего травмы и смерти вторжениябактерий 8. Митохондрии является основным местом производства ROS в эукариотических клетках, и различные оксидазы (например, никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидазы комплекс, липоксигеназа системы, белка киназы C и циклоксигеназы системы) посредником производства ROS9,10. Измерение в режиме реального времени производства ROS, представляющего первичный противомикробный механизм в нейтрофилах, является полезным методом для изучения защиты хозяина во время взаимодействия бактерий-хозяина.
В этом протоколе, зависит от времени производства ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки была количественно с флуоресцентным зондом ROS DHE, обнаруженный в режиме реального времени флуоресцентной микроплеся читателя. Этот метод также может быть применен к оценке производства ROS в других клетках млекопитающих во время взаимодействия патогена-хозяина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Периферическая кровь добровольцев, применяемых в этом исследовании, была одобрена Институциональным советом по обзору первой больницы Китайского медицинского университета (#2020-2020-237-2).
1. Подготовка реагентов и среды культуры
- Подготовь буфер лиза красных кровяных телец, добавив 8,29 г NH4Cl, 1 г KHCO3, 37,2 мг Na2EDTA в 1 л двойной дистиллированной воды и настроить рН до 7,2-7,4. Удалите бактерии путем фильтрации с помощью фильтров 0,22 мкм.
- Подготовьте экспериментальную культурную среду для нейтрофилов, добавив 5% сыворотки крупного рогатого скота в rpMI 1640 средней и хранить при 4 градусах Цельсия. Equilibrate к комнатной температуре перед пользой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте RPMI 1640 среды без фенола красный. - Приготовьте солевой фосфатный буфер (PBS), добавив 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4 2H2O и 0,2 г KH2PO4 в 1 л двойной дистиллированной воды в стеклянной колбе 1 л. Отрегулируйте рН до 7,2-7,4. Автоклав его в течение 15 мин при 121 градусе по Цельсию.
- Приготовьте раствор рифампицина, растворив 0,5 г порошка рифампицина в 10 мл диметилового сульфоксида (DMSO), чтобы дать раствор 50 мг/мл рифампицина.
- Приготовьте раствор LB agar, добавив 10 г NaCl, 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 15 г агар-порошка в 1 л двойной дистиллированной воды и автоклав смеси. Заполните чашки Петри до половины объема, наливая теплый раствор LB-агара, содержащий 100 мкг/мл рифампицина. Храните охлаждено твердую пластину при 4 градусах Цельсия.
- Подготовка мозга настой сердца (BHI) бульон подходит для бактериальных штаммов путем растворения 37 г порошка BHI в 1 л двойной дистиллированной воды. Отрегулируйте рН до 7,2 и отрегулируйте его.
- Растворите флуоресцентный зонд дигидроэтидий (DHE) в растворителя DMSO, чтобы дать 10 мМ запасов раствора. Аккуратно перемешайте перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Aliquot фондового решения сразу же в светоуязаемые флаконы. Срок годности запасного раствора составляет 6 месяцев при -20 градусов по Цельсию.
2. Подготовка штамма бактерий Е44
ПРИМЕЧАНИЕ: E44 является мутант штаммом менингитной кишечной палочки с устойчивостью к рифампицину.
- Опустите криоконсервированную колонию E44 с помощью стерильного наконечника пипетки, прививите нагрузку E44 на пластину Агара LB, содержащую 100 мкг/мл рифампицина, рисуя линии. Положите пластину вверх дном в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию на ночь.
- За день до эксперимента выберите одну колонию E44 из пластины со стерильным кончиком пипетки и положите ее в 5 мл бульона BHI, содержащего 100 мкг/мл рифампицина в колбе 50 мл. Инкубировать бактериальную культуру при 37 градусов по Цельсию при 90 об/мин при 17 ч в инкубационный шейкер.
3. Изоляция нейтрофилов от периферической крови человека
- Нарисуйте 5 мл образца крови у добровольцев внутривенно в вакуумную трубку для сбора крови, содержащую ЭДТА для антикоагуляции.
- Центрифуга периферических образцов крови на 500 х г в течение 5 мин. Образцы крови делятся на три слоя центрифугации, которые снизу вверх являются слой красных кровяных телец (РБК), белые кровяные клетки (WBC) слой и плазменный слой, последовательно.
- Аспирировать слой белых кровяных телец с пипетки к новой трубке с 3x РБК лиза буфера. Смешайте смесь тщательно и поместите при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Центрифуга трубки на 500 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью и отказаться.
- Повторите процедурулиза с буфером лиза РБК 1-2 раза, пока осадок не побелеет.
- Вымойте клетки путем повторного перерасхода осадка с 2 мл PBS. Затем центрифуга на 300 х г в течение 5 минут, чтобы клетки оседают на дно трубки.
- Этикетка нейтрофилов с CD16 микробусов путем повторного перерасхода осадка с 50 йл предварительно перенапись магнитных клеток сортировки буфера. Затем смешайте с 50 МКЛ человеческих микробусов CD16 тщательно. Инкубировать смесь при 4 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решения должны быть предварительно охлаждены, чтобы предотвратить ограничение антител на поверхности клетки и неспецифической маркировки. Большинство взрослых имеют от 4000 до 10000 белых кровяных телец на микролитер крови, среди которых, нейтрофилов приходится примерно 50-70%. По оценкам, количество белых кровяных телец в 5 мл периферической крови человека, как правило, до 2-5 х 107. - Вымойте клетки, добавив 2 мл буфера сортировки магнитных клеток и центрифуги при 4 градусов по Цельсию, 300 х г в течение 10 мин. Отбросьте супернатант полностью и resuspend осадок с 500 qL буфера сортировки.
- Соберите магнитную колонку и разделив полку. Перемести сепаратор на полку с помощью магнитной колонки и промыть столбец 3 мл буфера сортировки.
- Бросьте подвеску клетки в колонку, чтобы нейтрофилов, помеченных магнитными бусинами, прикреплялись к магнитной колонке.
- Смойте не помеченные ячейки, добавив 3 мл буфера сортировки магнитных клеток 3 раза, убедившись, что резервуар столбца пуст каждый раз.
- Снимите столбец с магнитного сепаратора и положите его на трубку 15 мл. Добавьте 5 мл буфера сортировки магнитных ячеев в столбец. Выталкивайте магнитные помеченные клетки с помощью поршеня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы улучшить чистоту нейтрофилов, шаги сортировки могут быть повторены с помощью новой колонки. - Центрифуга трубки на 300 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант полностью и повторно осадок с 1 мл среды культуры. Определите номер ячейки с помощью счетчика клеток и подготовь клетки к дальнейшим экспериментам.
4. Измерение ROS
- Центрифуга изолированных нейтрофилов на 300 х г в течение 5 мин, повторного осаждения, и настроить концентрацию клеток до 2 х 106/ мл с культурой среды, содержащей 5 МКМ DHE флуоресценции зонда.
- Инкубировать нейтрофилов при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы загрузить зонд DHE, а затем выделить подвеску клетки на 96-хорошо черный полистирол микроплюрат с 200 йл на колодец.
- Включите считыватель микроплатформ и откройте программное обеспечение обнаружения. Выберите непрозрачный формат пластины 96 скважин и определите область чтения.
- Установите флуоресценцию (Ex/Em 518/605 нм) в кинетическом режиме каждые 5 минут в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия. Убедитесь в том, чтобы встряхнуть пластину в течение 3 с перед каждым чтением.
- Вынюйте микроплиты из инкубатора, добавьте культурный E44 (MOI-100) или phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) (100 нг/мл) к каждому хорошо содержащем предварительно загруженные нейтрофили с 3 репликациями. Используйте PMA в качестве положительного контроля.
- Поместите пластину в считыватель микропластиров и немедленно начните анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол, изложенный в этой статье, нейтрофили были выделены из периферической крови человека и загружены флуоресцентным зондом DHE для обнаружения изменений уровней ROS в ответ на инфекцию E44. Здесь мы предоставляем репрезентативные данные, демонстрирующие производство ROS, вызванное штаммом E44, определяемым считывателем микроплатформ в режиме реального времени. Добавив штаммы E44 в MOI 100, уровни ROS немедленно повысились и показали непрерывную восходящую тенденцию с зависящим от времени образом(рисунок 1). Добавив PMA, известный индуктор ROS внутриклеточного ROS в нейтрофилах, мы наблюдали S-образную кривую, которая представляет собой плоскую кривую на начальном этапе с последующим значительным увеличением с 20 минут до 40 минут и, наконец, достигнув пика в 60 мин (Рисунок 1).
Рисунок 1. Зависит от времени производство ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки. Нейтрофили, изолированные от периферической крови человека, были загружены красителем DHE, был добавлен штамм E44 (MOI-100), и средняя интенсивность флуоресценции (МФО) была определена сразу же с помощью микропластицита. В качестве положительного контроля использовались нейтрофии, обработанные ПМА (100 нг/мл). Все данные были нормализованы до начального значения для получения относительной интенсивности DHE и представлены как среднее значение ± SEM (n No 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нейтрофили действуют как наиболее распространенный компонент белых кровяных телец в крови человека. Они являются важными клетками-эффекторами в врожденной иммунной системе человека, которая строит первую линию защиты от вторжения патогенных микроорганизмов11. Поколение ROS представляет собой один из основных бактерицидных механизмов нейтрофилов после фагоцитоза11. Недавние исследования показали, что чистая структура, выпущенная нейтрофилом называется нейтрофил внеклеточной ловушки (NET) также участвует впроцессе убийства бактерий 6,11,12.
Было сообщено, что ROS производится нейтрофилов индуцированных стимуляции патогенных микроорганизмов в основном вызваны активацией NADPH oxidase, которая состоит из двух мембранных связывающих подразделений (gp91phox и p22phox) и трех цитозоловых подразделений (p47phox, p67phox, и p40phox)5. Поглощенные бактерии активируют ряд киназ внутри нейтрофилов, таких как белковая киназа C (PKC), белковая киназа A (PKA) и митоген-активированная белковая киназа (MAPK), что фосфорилат цитозолических подразделений p47phox NADPH oxidase. Затем цитозолический тример состоит из p47phox, p67phox, и p40phox транслокирует к мембране в сочетании с мембраной связывания субъединит gp91phox и p22phox, образуя полный комплекс оксидазы NADPH. Собранный комплекс NADPH oxidase передает электроны, полученные из NADPH, молекулярному O2,генерируя супероксидные анионы и активируябактерицидные функции 13,14,15. Также сообщается, что РОС, производимый нейтрофилами, также может быть связан с образованием NETнейтрофилов 16,17. Таким образом, обнаружение производства ROS будет способствовать дальнейшему изучению бактерицидного механизма нейтрофилов.
В этом протоколе, нейтрофилов, изолированных от периферической крови предварительно загружены с флуоресценции зонд DHE и выделены на 96-ну черный полистирол микроплорки. Интенсивность ROS обнаруживается считывателем микроплатформ в режиме реального времени после добавления менингитной кишечной палочки.
Собранная кровь антикоагулируется с помощью ЭДТА или цитрата, чтобы избежать активации нейтрофилов в дополнениек 18. Как нейтрофилов неизлечимо дифференцированы и имеют короткий срок службы (около 4-8 часов) в циркулирующей крови, изоляция шаги должны быть сделаны как можно скорее послесбора крови 19. Многие изолирующий реагенты, такие как Ficoll-Hypaque и Percoll, были использованы для изоляции нейтрофилов от периферическойкрови11,19,20. В этом протоколе, нейтрофилов изолированы CD16 микропиба выбор после лизиса эритроцитов из периферической крови. Он предлагает значительные улучшения в скорости, простоте и чистоте. Для получения более чище нейтрофилов, градиентной центрифугации плотности может быть применен до изоляции с CD16 магнитных бусин.
Ряд признанных флуоресцентных зондов, таких как дигидроэтидий (DHE), 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein диацетат (H2DCF-DA) и дигидрородамин 123 (DHR), которые проходят через клеточную мембрану свободно, могут быть использованы для определения внутриклеточного ROS поток цитометрии, конфокальноймикроскопии или микроскопа читателя 21,22,23,24. В дополнение к обнаружению DHE флуоресценции зонд с микроплеся читателя, поток цитометрии и конфокальные микроскопии также могут быть использованы для обнаружения изменений интенсивности флуоресценции DHE в указанные моменты времени для измерения производства ROS в нейтрофилов.
Этот протокол обеспечивает более простой способ обнаружения производства ROS в режиме реального времени и может быть использован в различных сценариях для обнаружения генерации ROS в клетках млекопитающих-хозяинах, инфицированных патогенными микроорганизмами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31670845, 31870832, 32000811) и Программой заслуженного профессора провинции Ляонин (LJH2018-35).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S.
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J.
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S.
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
